本发明涉及生物制药中的发酵工程技术领域，尤其涉及一种提高西罗莫司发酵产量的方法。
背景技术：
西罗莫司(sirolimus，又称雷帕霉素，rapamycin)是由吸水链霉菌(streptomycesgroscopicus)发酵产生的一种含氮三烯大环内酯新型强效免疫抑制剂，可用于肾移植的抗排斥反应和自身免疫性疾病的治疗，其分子式c51h79no13，分子量为914，分子结构式如下式(1)所示：
惠氏制药研制的西罗莫司口服液于1999年10月首次在美国上市，并且获得fda批准，允许其作为一种安全性较高的药物用于临床防治肾移植排斥反应。随后西罗莫司片剂(1mg)在美国上市成功，获准与环孢菌素、类固醇联合用于肾移植病人的抗排异。之后，fda又批准本wyeth公司的免疫抑制剂rapamune(ⅰ)(sirolimus)的新标签，用于使用鸡尾酒疗法病人中撤除环孢霉素后预防肾移植排斥的维持使用。2000年雷帕霉素产品相继在英国、德国、丹麦、挪威、瑞士等国上市，用于成人肾移植抗排斥。2001年，奥地利、德国、丹麦和瑞典分别获批与csa、皮质甾类激素合用于肾移植病人抗排斥。2002年由cordis公司研发的以雷帕霉素作为涂层药物的血管支架cypher相继在欧洲、美国和日本上市。2005年6月我国福建省微生物研究所研发的国产雷帕霉素经sfda批准投放市场。
目前，国内通过发酵生产西罗莫司的产量较低，这对工业化生产极为不利，从而导致药品价格过高，对药品的推广造成困难。有鉴于此，有必要对现有技术中的如何提高西罗莫司产量的方法予以改进，以解决上述问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于揭示一种提高西罗莫司发酵产量的方法，用以实现提高发酵产量，以降低西罗莫司的制造成本，并提出一种适用于工业化量产的工艺。
为实现上述发明目的，本发明提供了一种提高西罗莫司发酵产量的方法，包括以下步骤：
步骤(1)：将西罗莫司发酵菌丝体斜面接种于种子培养基中，26～30℃，200～300rmp的条件下在摇床上培养40～50h；
步骤(2)：按照2％～15％的接种量接种于一级种子罐的种子培养基上，温度26～30℃，摇床转速200～300rmp，罐压0.03～0.05mpa，通气量为1:0.5～1:1.5vvm，培养时间20～28h；
步骤(3)：按照2％～15％的接种量接种于发酵培养基后置入发酵罐，温度26～30℃，通过改变转速的方式维持发酵罐内的溶解氧浓度保持在设定值之上，罐压0.03～0.05mpa，通气量为1:0.5～1:1.5vvm，培养时间20～28h；
步骤(4)：在发酵进行至20～28h时补加小分子化合物，在发酵培养至40～52h时流加第一补料，发酵培养至于68～76h时流加第二补料，当培养时间至116～122h时发酵结束。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(1)及步骤(2)中的种子培养基的组成为：玉米淀粉1.0～2.0g/l，葡萄糖0.5～1.0g/l，黄豆饼粉1.0～2.0g/l，酵母抽提物0.5～1.0g/l，kh2po40.01～0.03g/l，k2hpo40.01～0.03g/l，所述种子培养基ph呈6.5～7.5。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(3)中的发酵培养基的组成为：玉米淀粉1.0～3.0g/l，果糖3.0～5.0g/l，黄豆饼粉3.0～4.0g/l，酵母粉0.3～0.6g/l，酵母抽提物0.3～0.6g/l，氯化钠0.1～1.0g/l，氯化钴0.0001～0.0002g/l，l-赖氨酸盐酸盐0.1～0.5g/l，kh2po40.1～0.3g/l，k2hpo40.1～0.3g/l，碳酸钙0.1～0.3g/l，所述发酵培养基ph呈6.0～6.5。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(3)中初始发酵罐的溶解氧浓度为100％，发酵过程中发酵罐内的溶解氧浓度的设定值为25％，初始转速设定为180～220rpm；当发酵罐中的溶解氧浓度低于25％时，提高搅拌转速以控制溶解氧浓度；当发酵罐内的溶解氧浓度高于100％时，降低搅拌转速以控制溶解氧浓度。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(4)中所述小分子化合物选自乙醇、异丙醇或者乙醇与异丙醇的混合溶液。
作为本发明的进一步改进，所述小分子化合物的添加量为发酵罐中发酵液体积的0.3～0.5％。
作为本发明的进一步改进，所述第一补料的组成为：麦芽糖8.0～12.0g/l，l-赖氨酸盐酸盐1.0～2.0g/l，硫酸亚铁0.3～0.5g/l，硫酸镁，2.0～3.0g/l，碳酸钙0.5～0.8g/l。
作为本发明的进一步改进，所述第二补料的组成为：l-赖氨酸盐酸盐1.0～2.0g/l，碳酸钙0.5～0.8g/l。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：在本发明中，通过添加不同种类的碳源和氮源来保证前期菌体的生产及后期产物的合成，并且通过添加无机盐对吸水链霉菌代谢系统进行调控，适时的添加前体物质及小分子化合物来强化产物合成的代谢通路；同时对发酵工艺进行优化，在发酵过程中补料流加强化产物的合成途径，通过本发明所述方法得到的西罗莫司发酵液产量提高60％～90％，降低了采用发酵法制备西罗莫司的生产成本。
具体实施方式
下面结合各实施方式对本发明进行详细说明，但应当说明的是，这些实施方式并非对本发明的限制，本领域普通技术人员根据这些实施方式所作的功能、方法、或者结构上的等效变换或替代，均属于本发明的保护范围之内。
除非说明书中有特殊说明，本发明中的各个实施例中的组分、原料均采用分析纯级别。另外，各实施例中的“g”为重量单位“克”；“h”为时间单位“小时”；“ml”为体积单位“毫升”；“室温”为23℃。“vvm”为通气量单位(airvolume/culturevolume/min)，并具体为单位时间内(通常为每分钟)通入到发酵容器(例如“发酵罐”)的气体体积。“g/l”为培养基中各组分的含量单位。术语“罐压”为发酵罐或者一级种子罐等密闭容器的内部压力。
实施例一：
本实施例公开了一种提高西罗莫司发酵产量的方法的第一种实施例，并具体包括以下步骤：
步骤(1)：将西罗莫司发酵菌丝体斜面接种于种子培养基中，26℃，200rmp的条件下在摇床上培养50h。
步骤(2)：按照2％的接种量进行接种于一级种子罐的种子培养基上，温度26℃，摇床转速20rmp，罐压0.03mpa，通气量为1:0.5vvm，培养时间28h。
步骤(3)：按照2％的接种量进行接种于发酵培养基后置入发酵罐，温度26℃，转速以溶解氧浓度进行反馈，初始设置转速为180rpm，溶解氧浓度设定为100％，当溶解氧浓度低于20％时，提高搅拌转速控制溶解氧浓度，罐压0.03mpa，通气量为1:0.5vvm，培养时间28h。
步骤(3)中初始发酵罐的溶解氧浓度为100％，发酵过程中发酵罐内的溶解氧浓度的设定值为25％，初始转速设定为180rpm；当发酵罐中的溶解氧浓度低于25％时，提高搅拌转速以控制溶解氧浓度；当发酵罐内的溶解氧浓度高于100％时，降低搅拌转速以控制溶解氧浓度。
步骤(4)：在发酵进行至28h时补加相当于发酵罐中发酵液体积的0.3％的无水乙醇，在发酵培养至52h时流加第一补料的流加，发酵培养至于76h时再次流加第二补料，当培养时间至122h时发酵结束。在本实施例中，通过添加无水乙醇这种有机溶剂，可将乙醇作为小分子的前体物质，在发酵生产西罗莫司的过程中对发酵环境进行扰动，从而达到提高西罗莫司发酵产量的作用。
在本实施例中，步骤(1)与步骤(2)中的种子培养基的组成为：玉米淀粉1.0g/l，葡萄糖0.5g/l，黄豆饼粉1.0g/l，酵母抽提物0.5g/l，kh2po40.01g/l，k2hpo40.01g/l，余量为水。种子培养基的ph呈6.5。
在本实施例中，该发酵培养基的组成为：玉米淀粉1.0g/l，果糖3.0g/l，黄豆饼粉3.0g/l，酵母粉0.3g/l，酵母抽提物0.3g/l，氯化钠0.1g/l，氯化钴0.0001g/l，l-赖氨酸盐酸盐0.1g/l，kh2po40.1g/l，k2hpo40.1g/l，碳酸钙0.1g/l，余量为水。发酵培养基的ph呈6.0。
其中，第一补料的组成为：麦芽糖8.0g/l，l-赖氨酸盐酸盐1.0g/l，硫酸亚铁0.3g/l，硫酸镁2.0g/l，碳酸钙0.5g/l，余量为水。添加体积为400l。
第二补料的组成为：l-赖氨酸盐酸盐1.0g/l，碳酸钙0.5g/l，余量为水。添加体积为400l。
实施例二：
本实施例公开了一种提高西罗莫司发酵产量的方法的第二种实施例，并具体包括以下步骤：
步骤(1)：将西罗莫司发酵菌丝体斜面接种于种子培养基中，30℃，300rmp的条件下在摇床上培养40h。
步骤(2)：按照15％的接种量进行接种于一级种子罐的种子培养基上，温度30℃，摇床转速300rmp，罐压0.05mpa，通气量为1:1.5vvm，培养时间20h。
步骤(3)：按照15％的接种量进行接种于发酵培养基后置入发酵罐，温度30℃，转速以溶解氧浓度进行反馈，初始设置转速为220rpm，溶解氧浓度设定为100％，当溶解氧浓度低于25％时，提高搅拌转速控制溶解氧浓度，罐压0.05mpa，通气量为1:1.5vvm，培养时间20h。
步骤(3)中初始发酵罐的溶解氧浓度为100％，发酵过程中发酵罐内的溶解氧浓度的设定值为25％，初始转速设定为200rpm；当发酵罐中的溶解氧浓度低于25％时，提高搅拌转速以控制溶解氧浓度；当发酵罐内的溶解氧浓度高于100％时，降低搅拌转速以控制溶解氧浓度。
步骤(4)：在发酵进行至20h时补加相当于发酵罐中发酵液体积的0.5％异丙醇，在发酵培养至40h时流加第一补料，发酵培养至于68h时再次流加第二补料，当培养时间至116h时发酵结束。在本实施例中，通过添加无异丙醇这种有机溶剂，可将异丙醇作为小分子的前体物质，在发酵生产西罗莫司的过程中对发酵环境进行扰动，从而达到提高西罗莫司发酵产量的作用。
在本实例中，步骤(1)与步骤(2)中的种子培养基的组成为：玉米淀粉2.0g/l，葡萄糖1.0g/l，黄豆饼粉2.0g/l，酵母抽提物1.0g/l，kh2po40.03g/l，k2hpo40.03g/l，余量为水。所述种子培养基的ph呈7.5。
发酵培养基的组成为：玉米淀粉3.0g/l，果糖5.0g/l，黄豆饼粉4.0g/l，酵母粉0.3～0.6g/l，酵母抽提物0.6g/l，氯化钠1.0g/l，氯化钴0.0002g/l，l-赖氨酸盐酸盐0.5g/l，kh2po40.3g/l，k2hpo40.3g/l，碳酸钙0.3g/l，余量为水。所述发酵培养基的ph呈6.5。
第一补料的组成为：麦芽糖12.0g/l，l-赖氨酸盐酸盐2.0g/l，硫酸亚铁0.5g/l，硫酸镁3.0g/l，碳酸钙0.8g/l，余量为水。添加体积为300l。
第二补料的组成为：l-赖氨酸盐酸盐2.0g/l，碳酸钙0.8g/l，余量为水。添加体积为300l。
实施例三：
本实施例公开了一种提高西罗莫司发酵产量的方法的第三种实施例，并具体包括以下步骤：
步骤(1)：将西罗莫司发酵菌丝体斜面接种于种子培养基中，28℃，260rmp的条件下在摇床上培养48h。
步骤(2)：按照10％的接种量进行接种于一级种子罐的种子培养基上，温度28℃，摇床转速260rmp，罐压0.04mpa，通气量为1:1vvm，培养时间24h。
步骤(3)：按照10％的接种量进行接种于发酵培养基后置于发酵罐，温度28℃，转速以溶解氧浓度进行反馈，初始设置转速为200rpm，溶解氧浓度设定为100％，当溶解氧浓度低于25％时，提高搅拌转速控制溶解氧浓度，罐压0.04mpa，通气量为1:1vvm，培养时间24h。
在步骤(3)中，初始发酵罐的溶解氧浓度为100％，发酵过程中发酵罐内的溶解氧浓度的设定值为25％，初始转速设定为220rpm；当发酵罐中的溶解氧浓度低于25％时，提高搅拌转速以控制溶解氧浓度；当发酵罐内的溶解氧浓度高于100％时，降低搅拌转速以控制溶解氧浓度。
步骤(4)：在发酵进行至24h时补加相当于发酵罐中发酵液体积的0.4％由无水乙醇与异丙醇所组成的混合溶液；其中无水乙醇与异丙醇的摩尔比为2:1。在发酵培养至48h时流加第一补料，发酵培养至于72h时再次流加第二补料，当培养时间至120h时发酵结束。在本实施例中，通过添加无水乙醇与异丙醇所组成的混合溶液，可将乙醇与异丙醇作为小分子的前体物质，在发酵生产西罗莫司的过程中对发酵环境进行扰动，从而达到提高西罗莫司发酵产量的作用。
在本实施中，步骤(1)与步骤(2)中的种子培养基的组成为：玉米淀粉1.5g/l，葡萄糖0.8g/l，黄豆饼粉1.5g/l，酵母抽提物0.8g/l，kh2po40.02g/l，k2hpo40.02g/l，余量为水。所述种子培养基的ph呈7.0。
发酵培养基的组成为：玉米淀粉20g/l，果糖5.0g/l，黄豆饼粉4.0g/l，酵母粉0.6g/l，酵母抽提物0.6g/l，氯化钠0.5g/l，氯化钴0.00015g/l，l-赖氨酸盐酸盐0.3g/l，kh2po40.2g/l，k2hpo40.2g/l，碳酸钙0.2g/l，余量为水。所述发酵培养基的ph呈6.2。
第一补料的组成为：麦芽糖10.0g/l，l-赖氨酸盐酸盐1.5g/l，硫酸亚铁0.4g/l，硫酸镁2.0g/l，碳酸钙0.8g/l，余量为水。体积为350l。
第二补料的组成为：l-赖氨酸盐酸盐1.5g/l，碳酸钙0.6g/l，余量为水。体积为350l。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。