本发明属于生物法制备和提取技术领域，尤其是涉及一种从生物发酵液中同时提取β-聚苹果酸和普鲁兰多糖的方法。
背景技术：
β-聚苹果酸（poly(β-)malicacid），简称pmla，是一种水溶性脂肪族聚酯，是苹果酸的聚合物。作为一种水溶性脂肪族聚酯,pmla具有高度的水溶性、生物相容性、生物可降解性、生物可吸收性、无免疫原性和可化学衍生性,pmla可在水溶液中自发或由酶促降解为小分子苹果酸,而苹果酸单体可被人体吸收并无任何毒副作用,这些性质使得β-聚苹果酸可作为药物载体、微胶囊材料、生物医学材料等直接用于人体，还可用于化妆产品、食品包装等材料。
普鲁兰多糖是出芽短梗霉(aureobsidiumpullulan)发酵产β-聚苹果酸时产生的胞外多糖副产物,易溶于水,不溶于乙醇，是一种水溶性的不定形葡聚糖并作为水溶性多糖的模式多糖，分子量在2万-200万，可用作乳化剂、增稠剂、成膜剂、稳定剂等，已广泛应用于生物医药、食品、轻工、化工和石油等领域，是一种很有前景的工业用多糖。
目前β-聚苹果酸的生物合成主要方式是微生物发酵。研究发现粘菌（physarumpolycephalum）和出芽短梗霉(aureobasidiumpullulan)具有较高的β-聚苹果酸合成能力，通过微生物发酵得到的聚苹果酸均为β型，分子量一般在3000-1万。但微生物发酵生产pmla产量不高，发酵产物成分复杂，对pmla的分离纯化造成一定的困难，特别是在采用出芽短梗霉(aureobasidiumpullulan)发酵生产β-聚苹果酸的过程中，发酵副产物普鲁兰多糖的去除一直是pmla提取中不容忽视的问题。到目前为止，国内外研究人员已经对β-聚苹果酸的生物发酵法进行了深入研究，但对生物发酵法生产β-聚苹果酸的提取工艺的研究不是很多，“一种出芽短梗霉联产聚苹果酸和普鲁兰多糖的方法（公开号为cn102492740a）”介绍了通过出芽短梗霉细胞生产聚苹果酸和普鲁兰多糖的方法，是通过优化发酵条件提高二者的产量，并未对其进行提取。“一种制备高纯度β-聚苹果酸的方法（公开号为cn103103225a）”介绍了通过醇沉法将大部分普鲁兰多糖除去，用普鲁兰酶进一步除多糖，然后再对聚苹果酸进行离子交换获取聚苹果酸，这种提取方法只适用于实验室水平，在工业化生产中将导致生产成本的增加和安全隐患。“同时获得副产物普鲁兰多糖的β-聚苹果酸的制备方法（公开号为cn101100687a）”中，介绍的方法是同时获得聚苹果酸和普鲁兰多糖两种产物，采用的是溶剂沉淀分离的方法，也没有具体提到通过这种方法得到的聚苹果酸达到多少纯度。
目前国内pmla生产面临的瓶颈主要有以下几个方面：1、发酵过程中因出芽短梗霉会产生黑、黄绿色素等物质，从而使得色素较难去除；2、发酵过程中因产生大量的普鲁兰多糖，使得糖与pmla难分离；3、传统工艺中，采用有机溶剂醇沉或者离子交换树脂等方法进行pmla提取，这将导致生产成本的增加以及工业化大生产时的安全隐患。
虽然从生物技术途径已经能够提供克级的pmla的钠盐、钙盐、钾盐或自由酸，但由于pmla的发酵周期较长，提取工艺大多以有机溶剂沉淀为主，对环境危害大、耗资高等方面因素的影响，pmla的大规模生产仍然受到了很大的限制。与pmla相关的文章及专利中涉及pmla的应用及发酵方面的较多，而关于提取方法的相对较少。并且我国的这些相关研究和报道也仅处于实验室水平，真正进行工业生产的还没有。要实现发酵法制备pmla的产业化，就必须对发酵液中的pmla的分离提纯工艺进行优化。
技术实现要素：
为解决上述存在的技术问题，本发明的目的是一种从生物发酵液中同时提取β-聚苹果酸和普鲁兰多糖的方法，利用膜分离技术从pmla发酵液中同时获得pmla和副产物普鲁兰多糖的提取工艺。整个过程不再添加有机溶剂进行醇沉，主要是利用物理的方法除去发酵液中的杂质，根据pmla和普鲁兰多糖的分子量差异，用膜分离技术得到pmla和副产物普鲁兰多糖，减少由于副产物普鲁兰多糖废弃造成的环境污染及聚苹果酸的生产成本。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种从生物发酵液中同时提取β-聚苹果酸和普鲁兰多糖的方法，包括以下工艺步骤：
1）制备β-聚苹果酸发酵液；
2）将步骤1）的β-聚苹果酸发酵液进行过滤，脱色；
3）将步骤2）脱色后的发酵液进行热变性除蛋白，将发酵液调ph至7.5，在90°c下使蛋白质沉淀，时间为30~60min，然后通过抽滤将蛋白质去除；
4）将除蛋白后的发酵液通过超滤膜进行超滤，取超滤后所得截留液，通过旋蒸浓缩，冷冻干燥，得到微黄色粉末为普鲁兰多糖；
5)向步骤4）中的超滤后的透过液中加入1%~3%（v/v）普鲁兰酶，操作温度40~50℃下进行酶解反应2小时；
6）将步骤5）酶解后的溶液通过超滤膜进行超滤，取超滤所得截留液，通过旋蒸浓缩，冷冻干燥，得白色pmla粉末。
进一步的，β-聚苹果酸发酵液包括以下步骤：
菌种活化：将出芽短梗霉a.pullulanscgmcc3337菌株转接到固体斜面培养基上于25℃恒温培养箱中培养4-5天；
种子培养：取出活化后的斜面种子，用无菌生理盐水将斜面的孢子洗下，制成孢子悬液；然后按照10%（v/v）的接种量，接入到种子培养基中；培养条件：温度25℃，转速200r/min，培养40个小时至对数生长期；
发酵培养：将种子培养液以10%接种量接入发酵培养基中，在25℃，200r/min条件下培养发酵144h后得β-聚苹果酸的发酵液。
更进一步的，其中步骤2）中板框过滤采用800~1000目滤布预涂硅藻土，硅藻土加入量为1%~2%（m/v）；步骤2）中的脱色是采用活性炭脱色，将发酵液加热到50~70℃后，加入1%~1.5%（m/v）活性炭于100r/min下搅拌，脱色60~120min，然后用800~1000目滤布预涂硅藻土，硅藻土加入量为1%~1.5%（m/v），进行板框过滤除去活性炭。
更进一步的，其中步骤4）中所述超滤采用的超滤膜是聚醚砜超滤膜，截留分子量10kda，超滤时控制溶液温度为30~50℃，操作压力为0.2~0.5mpa。
更进一步的，其中步骤6）中超滤采用的超滤膜为聚醚砜超滤膜，截留分子量1kda，超滤时控制溶液温度为30~50℃，操作压力控制为0.2~0.5mpa。
更进一步的，斜面培养基为：即马铃薯葡萄糖琼脂培养基（pda）：马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂20g/l，121℃高压蒸汽灭菌30分钟；
种子培养基为：蔗糖60g/l，酵母膏3g/l，丁二酸2g/l，硫酸铵1g/l，k2co30.4g/l，kh2po40.1g/l，mgso4·7h2o0.1g/l，znso4·7h2o0.005g/l，玉米浆0.1%（v/v），caco320g/l。
发酵培养基：蔗糖100g/l，蛋白胨35g/l，kh2po40.1g/l，nano32g/l，mgso4·7h2o0.3g/l，kcl0.5g/l，mnso40.05g/l，caco320g/l。
本技术方案设计原理
1、板框过滤除去菌体和不溶性固形物；活性炭脱色后，再次采用板框过滤进一步除去菌体和活性炭；发酵液中的蛋白质经热变形后去除，后超滤膜超滤，截流液中得大分子多糖——普鲁兰多糖溶液，经过精制的普鲁兰多糖；超滤的透过液，经普鲁兰多糖酶解残留的普鲁兰多糖，再进行一次超滤，小分子杂质及酶解产物麦芽三糖等随超滤透过液流出，取截流液为相对大分子的pmla。
2、膜分离过程无相变，能耗低，设备简单，操作控制方便，应用范围较广。经过两次超滤膜的过滤，针对的截留目的产物，本发明经生物发酵法制备的β-聚苹果酸发酵提取液中β-聚苹果酸的分子量从几千到10000，本发明的超滤膜的选择是针对该分子量阶段的β-聚苹果酸的。
本发明的有益效果是：
1、采用板框过滤机去除发酵液中的菌体,不仅可以避免有机、无机絮凝剂添加造成的溶剂残留,而且有效提高了除菌效率，降低了发酵法生产pmla过程中在除菌方面的成本可更有效的应用于工业化生产中。
2、充分利用膜对混合物中各组分的选择透过性来分离和提取目的产物。利用pmla和普鲁兰多糖的分子量差异，通过采用不同分子量的超滤膜对料液进行超滤，实现同时从发酵液中获得pmla和副产物普鲁兰多糖的分离提取，降低pmla的生产成本。
3、经过多级的膜分离技术进行过滤和提取，减少了有机溶剂的使用造成的成本增加和安全隐患，大大提高了提取，节能降耗，利于工业化大规模生产的实现。
4、超滤纳滤相结合的提取技术避免了有机溶剂的使用、减少了对环境的污染、降低了危险度。
5、同时提取得到普鲁兰多糖和β-聚苹果酸，普鲁兰多糖用醇沉法得产量为35~40g/l，高效液相色谱法测得β-聚苹果酸的产量达到32~35g/l，纯度达到91~93%。
具体实施方式
实施例1
一、培养基的配制
（1）斜面培养基：即马铃薯葡萄糖琼脂培养基（pda）：马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂20g/l，121℃高压蒸汽灭菌30分钟；
（2）种子培养基：蔗糖60g/l，酵母膏3g/l，丁二酸2g/l，硫酸铵1g/l，k2co30.4g/l，kh2po40.1g/l，mgso4·7h2o0.1g/l，znso4·7h2o0.005g/l，玉米浆0.1%（v/v），caco320g/l(单独灭菌)。
（3）基础发酵培养基：蔗糖100g/l，蛋白胨35g/l，kh2po40.1g/l，nano32g/l，mgso4·7h2o0.3g/l，kcl0.5g/l，mnso40.05g/l，caco320g/l(单独灭菌)。
二、菌种活化：
将出芽短梗霉a.pullulanscgmcc3337菌株转接到斜面培养基上于25℃活化培养4-5天。
三、种子培养：
取出活化后的斜面种子，用无菌生理盐水将斜面的孢子洗下，制成孢子悬液。然后以10%（v/v）接种量接入到种子培养基中。培养条件：温度25℃，200r/min条件下培养40个小时至对数生长期。
四、发酵培养：
将种子培养液以10%接种量接入发酵培养基中，在25℃，200r/min条件下培养发酵144h。
五、分离提取
（1）发酵液的预处理：发酵结束后将发酵液进行板框过滤，用800目滤布预涂硅藻土，硅藻土加入量为1%（m/v）。
（2）活性炭脱色：将预处理后的发酵液加热到50℃后加入1%活性炭于100r/min下搅拌，脱色90min，然后用800目滤布预涂硅藻土，硅藻土加入量为1%（m/v），进行板框过滤除去活性炭。
（3）热变性除蛋白：将脱色后的发酵液进行热变性除蛋白，将发酵液调ph至7.5，在90°c进行蛋白质的去除，时间为45min，然后通过抽滤将蛋白质去除。
（4）普鲁兰多糖的提纯：将除蛋白后的发酵液通过截留分子量为10kda的聚醚砜超滤膜，溶液温度控制为40℃，操作压力控制为0.3mpa，进行超滤。超滤后的截留液即为普鲁兰多糖溶液，通过旋蒸浓缩，冷冻干燥，得到副产物微黄色普鲁兰多糖粉末，用醇沉法测产量35.3g/l。
（5）pmla的提纯：向超滤后的透过液中加入2%（v/v）普鲁兰酶，操作温度为45℃进行酶解反应，处理时间为2小时，以保证酶作用完全，然后将酶解后的溶液通过截留分子量为1kda的聚醚砜超滤膜，溶液温度控制为45℃，操作压力控制为0.3mpa，进行超滤，酶解产物麦芽三糖及小分子杂质通过超滤膜进入透过液中，此过程中的截留液即为pmla溶液，通过旋蒸浓缩，冷冻干燥，得白色pmla粉末，用高效液相色谱法测得pmla的产量为33.2g/l，纯度为91.2%。
实施例2
一、培养基的配制
（1）斜面培养基：即马铃薯葡萄糖琼脂培养基（pda）：马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂20g/l，121℃高压蒸汽灭菌30分钟；
（2）种子培养基：蔗糖60g/l，酵母膏3g/l，丁二酸2g/l，硫酸铵1g/l，k2co30.4g/l，kh2po40.1g/l，mgso4·7h2o0.1g/l，znso4·7h2o0.005g/l，玉米浆0.1%（v/v），caco320g/l(单独灭菌)。
（3）基础发酵培养基：蔗糖100g/l，蛋白胨35g/l，kh2po40.1g/l，nano32g/l，mgso4·7h2o0.3g/l，kcl0.5g/l，mnso40.05g/l，caco320g/l(单独灭菌)。
二、菌种活化：
将出芽短梗霉a.pullulanscgmcc3337菌株转接到斜面培养基上于25℃活化培养4-5天。
三、种子培养：
取出活化后的斜面种子，用无菌生理盐水将斜面的孢子洗下，制成孢子悬液。然后以10%（v/v）接种量接入到种子培养基中。培养条件：温度25℃，200r/min条件下培养40个小时至对数生长期。
四、发酵培养：
将种子培养液以10%接种量接入发酵培养基中，在25℃，200r/min条件下培养发酵144h。
五、分离提取
（1）发酵液的预处理：发酵结束后将发酵液进行板框过滤，用900目滤布预涂硅藻土，硅藻土加入量为1.5%（m/v）。
（2）活性炭脱色：将预处理后的发酵液加热到70℃后加入1.5%活性炭于100r/min下搅拌，脱色60min，然后用1000目滤布预涂硅藻土，硅藻土加入量为1.2%（m/v），进行板框过滤除去活性炭。
（3）热变性除蛋白：将脱色后的发酵液进行热变性除蛋白，将发酵液调ph至7.5，在90°c进行蛋白质的去除，时间为30min，然后通过抽滤将蛋白质去除；。
（4）普鲁兰多糖的提纯：将除蛋白后的发酵液通过截留分子量为10kda的聚醚砜超滤膜，溶液温度控制为30℃，操作压力控制为0.4mpa，进行超滤。超滤后的截留液即为普鲁兰多糖溶液，通过旋蒸浓缩，冷冻干燥，得到副产物微黄色普鲁兰多糖粉末，用醇沉法测得产量为37.6g/l。
（5）pmla的提纯：向超滤后的透过液中加入1%（v/v）普鲁兰酶，操作温度为40℃进行酶解反应，处理时间为2小时，以保证酶作用完全，然后将酶解后的溶液通过截留分子量为1kda的聚醚砜超滤膜，溶液温度控制为40℃，操作压力控制为0.2mpa，进行超滤，酶解产物麦芽三糖及小分子杂质通过超滤膜进入透过液中，此过程中的截留液即为pmla溶液，通过旋蒸浓缩，冷冻干燥，得白色pmla粉末，用高效液相色谱法测得pmla的产量为32.5g/l，纯度为92.0%。
实施例3
一、培养基的配制
（1）斜面培养基：即马铃薯葡萄糖琼脂培养基（pda）：马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂20g/l，121℃高压蒸汽灭菌30分钟；
（2）种子培养基：蔗糖60g/l，酵母膏3g/l，丁二酸2g/l，硫酸铵1g/l，k2co30.4g/l，kh2po40.1g/l，mgso4·7h2o0.1g/l，znso4·7h2o0.005g/l，玉米浆0.1%（v/v），caco320g/l(单独灭菌)。
（3）基础发酵培养基：蔗糖100g/l，蛋白胨35g/l，kh2po40.1g/l，nano32g/l，mgso4·7h2o0.3g/l，kcl0.5g/l，mnso40.05g/l，caco320g/l(单独灭菌)。
二、菌种活化：
将出芽短梗霉a.pullulanscgmcc3337菌株转接到斜面培养基上于25℃活化培养4-5天。
三、种子培养：
取出活化后的斜面种子，用无菌生理盐水将斜面的孢子洗下，制成孢子悬液。然后以10%（v/v）接种量接入到种子培养基中。培养条件：温度25℃，200r/min条件下培养40个小时至对数生长期。
四、发酵培养：
将种子培养液以10%接种量接入发酵培养基中，在25℃，200r/min条件下培养发酵144h。
五、分离提取
（1）发酵液的预处理：发酵结束后将发酵液进行板框过滤，用1000目滤布预涂硅藻土，硅藻土加入量为2%（m/v）。
（2）活性炭脱色：将预处理后的发酵液加热到60℃后加入1.2%活性炭于100r/min下搅拌，脱色120min，然后用900目滤布预涂硅藻土，硅藻土加入量为1.5%（m/v），进行板框过滤除去活性炭。
（3）热变性除蛋白：将脱色后的发酵液进行热变性除蛋白，将发酵液调ph至7.5，在90℃进行蛋白质的去除，时间为60min，然后通过抽滤将蛋白质去除；。
（4）普鲁兰多糖的提纯：将除蛋白后的发酵液通过截留分子量为10kda的聚醚砜超滤膜，溶液温度控制为50℃，操作压力控制为0.5mpa，进行超滤。超滤后的截留液即为普鲁兰多糖溶液，通过旋蒸浓缩，冷冻干燥，得到副产物微黄色普鲁兰多糖粉末，用醇沉法测产量为40.2g/l。
（5）pmla的提纯：向超滤后的透过液中加入3%（v/v）普鲁兰酶，操作温度为50℃进行酶解反应，处理时间为2小时，以保证酶作用完全，然后将酶解后的溶液通过截留分子量为1kda的聚醚砜超滤膜，溶液温度控制为50℃，操作压力控制为0.5mpa，进行超滤，酶解产物麦芽三糖及小分子杂质通过超滤膜进入透过液中，此过程中的截留液即为pmla溶液，通过旋蒸浓缩，冷冻干燥，得白色pmla粉末，用高效液相色谱法测得pmla的产量为34.4g/l，纯度为92.6%。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。