本发明涉及一种从金花葵中分离纯化金丝桃苷和异槲皮苷的方法。具体地说，从金花葵提取液出发，利用金丝桃苷和异槲皮苷与锌盐络合能力较弱，其他黄酮类化合物与锌盐络合能力较强的特性，去除金花葵提取液中的其他黄酮类化合物，开发一种快速、高效、安全从金花葵中分离纯化金丝桃苷和异槲皮苷的方法。属于天然化合物提取和分离领域。
背景技术：
金丝桃苷又名槲皮素-3-o-β-d-吡喃半乳糖苷，异槲皮苷又名槲皮素-3-o-β-d-吡喃葡萄糖苷，两者都是槲皮素的糖苷,具有相同的苷元和相似的极性，仅在糖基部分有一个羟基的构型不同,前者是半乳糖苷,后者是葡萄糖苷,其余部分完全相同，属于黄酮醇苷类化合物。(复旦学报，2007，46，417-420)它们都广泛存在于各种植物体内，如连翘、黄蜀葵花、吴茱萸和罗布麻叶等，都是重要的天然产物。许多药理学研究表明，金丝桃苷具有改善心血管功能、脑缺血/再灌注损伤保护、抗氧化还原、抗炎、镇痛止咳、降压等作用(中国药房，2016，27，1415-1417)，异槲皮苷具有降血压、抗炎、抗抑郁等药理学活性(药学实践杂志，2011，29，272-274)。金丝桃苷的结构式如下式ⅰ所示，异槲皮苷的结构式如下式ⅱ所示。
金花葵(hibiscusmanihotl.)别名菜芙蓉、野芙蓉、黏干或山榆皮，为一年生草本锦葵科(malvaceae)秋葵属植物，金花葵有“植物大熊猫”的美誉，含有多种植物生物活性物质，主要有黄酮类化合物、维生素e、不饱和脂肪酸、膳食纤维和微量元素等(中国药物评价，2015，32，90-92)。近年，金花葵花作为提取黄酮类物质的重要来源受到各方关注。已有研究表明，金丝桃苷和异槲皮苷是金花葵花中的主要活性成分，其最高含量分别为1.59％和1.31％(北京中医药大学学报，2016，39，308-315)。
目前有很多关于分离纯化金丝桃苷和异槲皮苷的报道。比如，夏传海等(中国专利申请号201210424557.9)利用三级串联的大孔树脂吸附洗脱的方式从罗布麻叶中同时制备金丝桃苷和异槲皮苷，纯度均达到90％-98％。付王杰等(中国专利申请号201110091575.1)利用大孔树脂吸附、硅胶柱层析的方式从鹿蹄草中纯化分离金丝桃苷，纯度可达到95％。这些方法都存在纯化方法繁琐、成本过高、生产周期长、难以工业生产等问题，限制了金丝桃苷和异槲皮苷的应用。
本发明从金花葵提取液出发，利用金丝桃苷和异槲皮苷与锌盐络合能力较弱，其他黄酮类化合物与锌盐络合能力较强的特性，去除金花葵提取液中的其他黄酮类化合物，开发一种快速、高效、安全从金花葵中分离纯化金丝桃苷和异槲皮苷的方法。
技术实现要素：
本发明的目的是利用金丝桃苷和异槲皮苷与锌盐络合能力较弱，其他黄酮类化合物与锌盐络合能力较强的特性，去除金花葵提取液中的其他黄酮类化合物，开发一种快速、高效、安全的分离纯化金花葵中的金丝桃苷-异槲皮苷组合物的方法。
本发明的目的是由以下技术方案实现的：
一种从金花葵提取液出发，利用金花葵中黄酮类物质与锌盐络合能力强弱不同，开发一种快速、高效、安全的分离纯化金花葵中的金丝桃苷和异槲皮苷的方法。其步骤如下：
a.精密称取5.0g干燥金花葵花粗粉末，在温度80℃的条件下，用70％的乙醇溶液加热回流提取3h，冷却至室温后抽滤，得到金花葵残渣和上清液，收集上清液，用70％的乙醇溶液定容到250ml容量瓶中即得样品溶液；
b.称取金花葵样品溶液，用碱性溶液调节ph值为8.5-12.5，优选为10.5，所用碱性溶液可选择一定浓度氢氧化钾溶液、氢氧化钠溶液、碳酸钠溶液、氨水等，优选为氢氧化钾溶液。加入一定质量浓度锌盐，所用锌盐可选择硫酸锌、乙酸锌、氯化锌等，优选为硫酸锌，添加量保证金花葵样品与锌盐的质量比为1/0.5-1/5，优选为1/1。添加后，络合反应时间为1-12h，优选为3-5h。络合反应温度为10-70℃，优选为30-40℃，离心分离，去除锌盐-黄酮络合物沉淀，收集上清液；
c.将上述的上清液加热浓缩，获得高纯度的金丝桃苷和异槲皮苷。
对金花葵的提取液和分离纯化后的金丝桃苷和异槲皮苷经高效液相色谱分析得到分析结果，色谱图见附图。采用的色谱条件为：watershplc高效液相色谱仪，色谱柱为cosmosilc18(4.6mm×200mm，5μm)，流动相为乙腈-0.1％甲酸溶液梯度洗脱(0min，15:85v/v；18min，16:84v/v；26min，20:80v/v；35min，40:60v/v；40min，40:60v/v)，流速为1.0ml/min，检测波长为360nm，进样量10μl，柱温为室温。
本发明取得了如下有益成果：
1、对金花葵提取液不需要做进一步处理，直接加入锌盐，通过调节ph使锌盐与提取液中除金丝桃苷和异槲皮苷外的其他黄酮类物质络合，可同时分离纯化金花葵中的金丝桃苷和异槲皮苷，简化了处理步骤，节约操作时间、减少人力和能源的消耗等，提高了制备效率和经济效益；
2、采用硫酸锌等锌盐的成本低，无毒无害，危险程度降低，也便于提取溶剂的回收；
3、通过前述组合操作，便于金花葵中的金丝桃苷和异槲皮苷分离纯化的大规模工业生产。
附图说明
图1是未经纯化的金花葵提取液中金丝桃苷和异槲皮苷的hplc谱图。
图2是纯化后金花葵提取液中金丝桃苷和异槲皮素的hplc谱图。
具体实施方式：
下面结合附图和具体的实施例对本发明的一种从金花葵中分离纯化金丝桃苷和异槲皮苷的方法的进一步说明，以便本领域的技术人员更加了解本发明，但是并不以此限制本发明。
实施例1：
a.精密称取5.0g干燥金花葵花粗粉末，在温度80℃的条件下，用70％的乙醇溶液加热回流提取3h，冷却至室温后抽滤，得到金花葵残渣和上清液，收集上清液，用70％的乙醇溶液定容到250ml容量瓶中即得样品溶液；
b.量取10ml金花葵样品溶液，用氢氧化钾溶液调节ph值为10.5，加入一定质量浓度硫酸锌，添加量保证金花葵样品与硫酸锌的质量比为1/1。添加后，络合反应时间为3h。络合反应温度为30℃，离心分离，得到上清液和锌盐-黄酮络合物，收集上清液；
c.将上述的上清液加热浓缩，获得高纯度的金丝桃苷和异槲皮苷，金丝桃苷和异槲皮素纯度分别为46.59％和33.55％。
实施例2：
a.精密称取5.0g干燥金花葵花粗粉末，在温度80℃的条件下，用70％的乙醇溶液加热回流提取3h，冷却至室温后抽滤，得到金花葵残渣和上清液，收集上清液，用70％的乙醇溶液定容到250ml容量瓶中即得样品溶液；
b.量取10ml金花葵样品溶液，用碳酸钠溶液调节ph值为12.5，加入一定质量浓度氯化锌，添加量保证金花葵样品与氯化锌的质量比为1/0.5。添加后，络合反应时间为12h。络合反应温度为40℃，离心分离，得到上清液和锌盐-黄酮络合物，收集上清液；
c.将上述的上清液加热浓缩，获得高纯度的金丝桃苷和异槲皮苷，金丝桃苷和异槲皮素纯度分别为43.14％和28.44％。
实施例3：
a.精密称取5.0g干燥金花葵花粗粉末，在温度80℃的条件下，用70％的乙醇溶液加热回流提取3h，冷却至室温后抽滤，得到金花葵残渣和上清液，收集上清液，用70％的乙醇溶液定容到250ml容量瓶中即得样品溶液；
b.量取10ml金花葵样品溶液，用氢氧化钠溶液调节ph值为11.5，加入一定质量浓度乙酸锌，添加量保证金花葵样品与乙酸锌的质量比为1/5。添加后，络合反应时间为1h。络合反应温度为10℃，离心分离，得到上清液和锌盐-黄酮络合物，收集上清液；
c.将上述的上清液加热浓缩，获得高纯度的金丝桃苷和异槲皮苷，金丝桃苷和异槲皮素纯度分别为42.97％和28.24％。
实施例4：
a.精密称取5.0g干燥金花葵花粗粉末，在温度80℃的条件下，用70％的乙醇溶液加热回流提取3h，冷却至室温后抽滤，得到金花葵残渣和上清液，收集上清液，用70％的乙醇溶液定容到250ml容量瓶中即得样品溶液；
b.量取10ml金花葵样品溶液，用氨水调节ph值为10.5，加入一定质量浓度硫酸锌，添加量保证金花葵样品与硫酸锌的质量比为1/0.5。添加后，络合反应时间为5h。络合反应温度为70℃，添加后，络合反应时间为1h。络合反应温度为10℃，离心分离，得到上清液和锌盐-黄酮络合物，收集上清液；
c.将上述的上清液加热浓缩，获得高纯度的金丝桃苷和异槲皮苷，金丝桃苷和异槲皮素纯度分别为44.43％和30.74％。
实施例5：
a.精密称取5.0g干燥金花葵花粗粉末，在温度80℃的条件下，用70％的乙醇溶液加热回流提取3h，冷却至室温后抽滤，得到金花葵残渣和上清液，收集上清液，用70％的乙醇溶液定容到250ml容量瓶中即得样品溶液；
b.量取10ml金花葵样品溶液，用氢氧化钾调节ph值为10.5，加入一定质量浓度硫酸锌，添加量保证金花葵样品与硫酸锌的质量比为1/1。添加后，络合反应时间为5h。络合反应温度为40℃，离心分离，得到上清液和锌盐-黄酮络合物，收集上清液；
c.将上述的上清液加热浓缩，获得高纯度的金丝桃苷和异槲皮苷，金丝桃苷和异槲皮素纯度分别为44.07％和28.39％。
实施例6：
a.精密称取5.0g干燥金花葵花粗粉末，在温度80℃的条件下，用70％的乙醇溶液加热回流提取3h，冷却至室温后抽滤，得到金花葵残渣和上清液，收集上清液，用70％的乙醇溶液定容到250ml容量瓶中即得样品溶液；
b.量取10ml金花葵样品溶液，用氢氧钾调节ph值为8.5，加入一定质量浓度硫酸锌，添加量保证金花葵样品与硫酸锌的质量比为1/2。添加后，络合反应时间为7h。络合反应温度为50℃，离心分离，得到上清液和锌盐-黄酮络合物，收集上清液；
c.将上述的上清液加热浓缩，获得高纯度的金丝桃苷和异槲皮苷，金丝桃苷和异槲皮素纯度分别为39.10％和21.70％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。