一种PRRSV感染相关的lncRNA及其siRNA在抑制病毒复制中的应用的制作方法

本发明涉及非编码rna技术领域，具体涉及一种prrsv感染相关长链非编码rna(lncrna)及其干扰rna(sirna)在抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用。

背景技术：

猪繁殖与呼吸综合征(prrs)是严重危害我国养猪业的重要疫病，其致病病毒prrsv是一种单股正链rna病毒，主要感染肺泡巨噬细胞(pam)、成熟单核细胞、小胶质细胞等抗原递呈细胞，造成母猪流产、死胎、木乃伊胎以及仔猪的呼吸道疾病。猪繁殖与呼吸综合征是病毒病，在未感染前可以注射弱毒疫苗或灭活疫苗进行预防，但是现有的疫苗的保护性免疫效果有限，对异源毒株的保护效果差，疫苗免疫不能消除持续带毒现象，弱毒疫苗免疫群体内流行毒株与疫苗毒株的基因重组现象比较普遍，为变异株的产生提供了条件。因此，针对prrsv流行的复杂局面，需要发现新的抗病毒免疫或治疗策略，解决目前prrs防控中存在的困难。prrsv感染相关的长链非编码rna(lncrna)在病毒感染致病过程中发挥着重要的作用，lncrna分子对病毒的复制可能有促进或抑制作用，对其结构与功能进行研究，将有可能发现新的抗病毒方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种sirna及其在抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用。

本发明提供了一种lncrnatcons_00179042的sirna，其特征在于，所述sirna的核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明还提供了所述的sirna在敲低pam细胞中lncrnatcons_00179042表达中的应用。

优选的，所述sirna对lncrnatcons_00179042的敲低效率为45～55％。

本发明还提供了所述的sirna在抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用。

本发明还提供了所述的lncrnatcons_00179042作为靶点在开发治疗和预防prrsv的药物和疫苗中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供了一种lncrnatcons_00179042的sirna，所述sirna可以敲低lncrnatcons_00179042在pam细胞中的表达，从而有效抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒；所述lncrnatcons_00179042能够促进prrsv病毒复制，本发明提供的sirna能够敲低lncrnatcons_00179042的表达，为研究抗prrsv病毒复制的药物提供了新的靶标lncrnatcons_00179042；为进一步开发新的抗病毒策略奠定了基础，也为prrsv感染后宿主抗病毒机制研究提供了候选lncrna。

附图说明

图1为pam细胞接种vr2332毒株24小时后实时荧光定量pcr测定lncrnatcons_00179042表达量结果示意图；

图2为pam细胞中sinc和sitcons_00179042干扰小rna对sitcons_00179042的干扰效率示意图；

图3为pam细胞中sinc和sitcons_00179042干扰小rna，对prrsv的复制抑制作用示意图；

图4为lncrnatcons_00179042琼脂糖凝胶电泳结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种lncrnatcons_00179042的sirna，所述sirna的核苷酸序列如seqidno.1所示，具体序列如下：

gcgcuuucagaacugcaau；

所述sirna为人工合成序列，所述sirna优选的委托生物公司合成。在本发明中所述sirna可以特异的敲低肺泡巨噬细胞(pam)中lncrnatcons_00179042的表达；所述sirna对lncrnatcons_00179042的敲低效率优选的为45～55％，更优选的为50％。

在本发明中所述的lncrnatcons_00179042的表达与病毒prrsv复制相关，lncrnatcons_00179042可以作为抑制病毒prrsv复制的新靶标。在本发明中，所述sirna通过敲低pam细胞中lncrnatcons_00179042的表达水平来抑制pam中猪繁殖与呼吸综合征病毒的复制。

具体的在本发明实施过程中sirna敲低pam细胞中lncrnatcons_00179042表达的方法为：将sirna和lipofectamine2000reagent的混合液加入到pam细胞中培养；培养结束后提取细胞总rna，进行反转录，用实时荧光定量pcr检测tcons_00179042表达水平。

在本发明中所述sirna和lipofectamine2000reagent的混合液的溶剂优选的为opti-mem培养基。所述混合液中sirna的浓度优选的为150～250pmol/ml，更优选的为200pmol/ml；所述混合液中lipofectamine2000reagent优选的为市售商品，所述的lipofectamine2000reagent浓度优选的为8～12μl/ml，更优选的为10μl/ml。

在本发明中，所述培养前优选的还包括向pam细胞中添加opti-mem培养基；在本发明中，所述pam细胞优选的提前接种在六孔板中，所述opti-mem培养基的添加量优选的为每孔1.5ml；所述pam细胞的密度优选的为40～60％，更优选的为50％。在本发明中所述培养的温度优选的为37℃恒温、培养环境优选的为5vol％co2；所述培养的时间优选的为22～26h，更优选的为24h。在本发明具体实施过程中优选的采用恒温培养箱来进行所述培养。

本发明在培养完成后，收集细胞，检测lncrnatcons_00179042表达水平。在本发明中所述检测lncrnatcons_00179042表达水平的方法优选的采用实时荧光定量pcr法。在本发明中所述实时荧光定量pcr采用宝生物工程(大连)有限公司的premixextaq^tmii(tlirnasehplus)荧光定量pcr试剂盒，并根据说明书配置体系和设定程序。所述lncrnatcons_00179042的pcr上游引物序列优选的如seqidno.3所示，下游引物优选的如seqidno.4所示。

在本发明中，所述sirna通过敲低pam细胞中tcons_00179042的表达水平来抑制pam中猪繁殖与呼吸综合征病毒的复制。所述sirna抑制pam中猪繁殖与呼吸综合征病毒具体的方法参见上述sirna敲低pam细胞中tcons_00179042的表达水平的方法，先将sirna转染pam细胞，敲低tcons_00179042的表达后，再用猪繁殖与呼吸综合征病毒感染pam细胞，其他步骤与上述方法相同，在此不再赘述。在本发明中所述猪繁殖与呼吸综合征病毒感染后的pam细胞的获取方法具体的为：将vr2332毒株接种于pam细胞，接种毒株后加入含2％fbs的rpmi-1640培养基培养。在本发明中所述vr2332毒株为疫苗毒株，在本发明中所述vr2332毒株的moi优选的为0.1。

在本发明中，采用实时荧光定量pcr测定prrsv病毒orf7的表达量。具体方法如下：收集细胞，用qiagenrneasyminikit提取细胞总rna；利用宝生物工程(大连)有限公司的试剂盒(rr036a)反转录，然后用实时荧光定量pcr测定prrsv病毒orf7的表达量，以gapdh为内参计算prrsvorf7mrna相对表达量。所述prrsvorf7的上游引物序列优选的如seqidno.7所示，下游引物序列优选的如seqidno.8所示。所述gapdh的pcr上游引物序列优选的如seqidno.5所示，下游引物优选的如seqidno.6所示。

下面结合具体实施例对本发明所述的sirna及其在抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1lncrnatcons_00179042的sirna在抑制pam细胞中lncrnatcons_00179042表达中的应用

所述sirna的核苷酸序列如seqidno.1所示，具体序列如下：gcgcuuucagaacugcaau，所述sirna为人工合成序列。所述lncrnatcons_00179042的核苷酸序列如seqidno.2所示。

将100pmolsirna加入250μlopti-mem培养基中混匀，并用5μllipofectamine2000reagent加入250μlopti-mem培养基中，室温放置5分钟后，将稀释好的sirna溶液与lipofectamine2000reagent用移液器反复吹打充分混匀，室温放置15分钟。用opti-mem培养基润洗预先接种在六孔板中的pam细胞，细胞密度50％，接着将sirna和lipofectamine2000reagent的混合液加入各细胞孔中，最后再补加1.5mlopti-mem培养基，轻轻摇晃。最终于37℃恒温、5％co2的温箱培养中培养，24小时后收集细胞。用qiagenrneasyminikit试剂盒按照说明书操作，提取总rna，进行反转录，用实时荧光定量pcr检测tcons_00179042表达水平。结果如图1所示，tcons_00179042在pam细胞中的敲低效率为50％。

实施例2prrsv病毒在pam中复制对lncrnatcons_00179042表达量的影响

具体步骤如下：

1、猪肺泡巨噬细胞分离：选取3周龄的prrsv阴性健康猪，处死后无菌分离肺脏，用无菌pbs缓冲液灌洗肺脏。将收集的灌洗液400g离心10分钟后弃去上清，加入30mlpbs重悬沉淀细胞，反复洗涤2次后收集沉淀细胞，用含10％fbs的rpmi-1640完全培养基重悬，调整细胞浓度达8×10⁵个细胞/cm²，加入到25cm²培养瓶中，于37℃温箱培养(或以2×10⁷个细胞/ml冻存)。贴壁细胞即为pam，培养6小时左右，更换含10％fbs的新鲜rpmi-1640完全培养基。

2、病毒接种：将vr2332毒株以moi为0.1接种于pam细胞，同时设未接病毒mock对照，接毒1小时后加入含2％fbs的rpmi-1640培养基至5ml。mock接种采用未接毒的marc-145细胞培养物，所有操作与接毒组相同。

3、总rna提取，第一链cdna合成及实时荧光定量pcr：接毒后24小时收集细胞，用qiagenrneasyminikit提取总rna，具体步骤按照说明书操作。采用宝生物工程(大连)有限公司的primescript^tmrtmastermix(perfectrealtime)反转录总rna，每20μl体系加入1μg总rna；反转录体系为：5×primescriptrtmastermix(perfectrealtime)，2μl；总rna500ng，补充无rna酶水至10μl反转录应用的程序为37℃15分钟，85℃5秒；以反转录得到的cdna为荧光定量pcr的模板；引物采用随机引物，引物稀释为10μm；采用宝生物工程(大连)有限公司的premixextaq^tmii(tlirnasehplus)荧光定量pcr试剂盒并根据说明书配置体系和和设定程序；具体体系如下：sybrpremixextaqii(tlirnasehplus)(2×)，10μl；正向引物(10μm)，0.8μl；反向引物(10μm)，0.8μl；roxreferencedye(50×)，0.4μl；dna模板2μl；灭菌蒸馏水6μl。pcr反应程序：95℃30s(1个循环)；95℃5s；60℃30s；72℃30s(40个循环)溶解曲线反应程序：95℃15s；60℃1h；95℃30s；60℃15s(1个循环)

根据荧光定量pcr实验的ct值，以gapdh为内参，用2^{^-△△ct}公式计算出接毒组和对照组之间的tcons_00179042分子表达变化倍数。结果如图2所示，rt-qpcr结果显示tcons_00179042在vr2332感染的pam细胞中下调表达。tcons_00179042上下游引物序列分别见序列表seqidno.3和seqidno.4，gapdh上下游引物序列见序列表seqidno.5和seqidno.6。

实施例3sirna在通过敲低tcons_00179042抑制prrsv复制中的应用。pam细胞转染sitcons_00179042和阴性对照sirna后24小时，用moi为0.1的vr2332接种细胞，24小时后收获病毒，弃上清后收集细胞，用qiagenrneasyminikit提取总rna；利用宝生物工程(大连)有限公司的试剂盒(rr036a)反转录，然后用实时荧光定量pcr测定prrsv病毒orf7的表达量，以gapdh为内参计算prrsvorf7mrna相对表达量。prrsvorf7上下游引物序列分别见序列表seqidno.7和seqidno.8。阴性对照sirna的序列如seqidno.9所示，为：5’-uucuccgaacgugucacgu-3’。结果如图3所示，sirna敲低tcons_00179042的pam细胞中，prrsv的复制水平下降。由此可见sirna可应用于抑制prrsv病毒在pam细胞中的复制。

实施例4lncrnatcons_00179042的全长克隆

提取pam细胞总rna后采用宝生物工程(大连)有限公司的试剂盒(rr6210a)进行反转录。反应体系及条件均按照说明书操作，具体如下：microtube中配制下列反应混合液。随机引物(50μm)1μl，dntpmixture(10mmeach)1μl，模板rna1μg，补充无rna酶水至总体积为10μl。65℃保温5min后，冰上迅速冷却。在上述microtube管中配制下列反转录反应液，总量为20μl。上述变性后反应液，10μl；5×primescriptiibuffer，4μl；rnaseinhibitor(40u/μl)，0.5μl(20u)；primescriptiirtase(200u/μl)，1μl(200u)；补充无rna酶水至总体积为20μl。

采用随机引物进行反转录。根据拼接得到的序列设计全长克隆引物，所述全长克隆序列的正向引物序列如seqidno.10所示，为gcggctagcgaggctgcgatgctggga，反向引物序列如seqidno.11所示，为ccggaattcaggaaaaggtgtggaccg。以反转录产物为模板进行pcr扩增，采用宝生物工程(大连)有限公司primestar(r010)高保真聚合酶进行扩增，具体体系如下：5×primestarbuffer(mg²⁺plus)，10μl；dntpmixture(2.5mmeach)，4μl；primer1，10pmol；primer2，10pmol；cdna，2μl；primestarhsdnapolymerase(2.5u/μl)，0.5μl；补充灭菌水至50μl。反应条件为98℃10秒,55℃5秒,72℃1分钟,30个循环。扩增产物进行sanger测序与二代测序得到的序列一致，其凝胶电泳图如图4所示。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>一种prrsv感染相关的lncrna及其sirna在抑制病毒复制中的应用

<160>11

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>19

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gcgcuuucagaacugcaau19

<210>2

<211>430

<212>dna/rna

<213>susscrofa

<400>2

gaggctgcgatgctgggatgctgagaagctactttcgcgacaggttggggatgccaacca60

atgatactcatctgaaccaaagacgggggcgcccaagaccccaaaggctccctggcctgc120

tggagcagaaccaggcgtccgccgtgcagggcgagggttgtgatgatgccagacgcgctt180

tcagaactgcaatcccacacagatcgccgccagctcgctgtgtgacctggggcgaatcac240

ttaacctttccgtgcctgagtcttccctcccccgatcagctggagggtggcgcccctggg300

tgtcccatcacgtaccccggcgcagcccacctcggacctgcccgcactcccgccctctct360

gaggctccaagtccgcggagactctggcgctgcgggtccctttcctctcccgcggtccac420

accttttcct430

<210>3

<211>20

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cgatgctgggatgctgagaa20

<210>4

<211>20

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

cagttctgaaagcgcgtctg20

<210>5

<211>18

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

caagaaggtggtgaagca18

<210>6

<211>19

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

aagtggaagagtgagtgtc19

<210>7

<211>19

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

cggcaaatgataaccacgc19

<210>8

<211>19

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

ttctgccacccaacacgag19

<210>9

<211>19

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

uucuccgaacgugucacgu19

<210>10

<211>27

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

gcggctagcgaggctgcgatgctggga27

<210>11

<211>27

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

ccggaattcaggaaaaggtgtggaccg27