前列腺癌特异性外泌体、lncRNA及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物技术和肿瘤分子生物技术领域，具体涉及前列腺癌特异性外泌体、lncrna及其制备方法和应用，尤其涉及用双抗体偶联免疫磁珠的方法分离前列腺癌患者血浆中肿瘤来源外泌体及其lncrnasap30l-as1和lncrnaschlap1作为前列腺癌诊断标志物及用于前列腺癌早期诊断的试剂盒。

背景技术：

根据最新的癌症统计数据分析，前列腺癌(pca)是世界上男性癌症死亡的主要原因之一，2016年，美国新增前列腺癌病例约占新诊断癌症患者人数的21％，我国前列腺癌的发病率也迅速上升。在早期阶段前列腺癌的主要治疗方法是去势治疗，但是在晚期阶段进展为去势抗性前列腺癌(crpc)，中位生存期仅约为2至3个月。目前，前列腺特异性抗原(psa)的血浆定量检测使众多前列腺癌患者得以诊断，但由于psa具有前列腺组织特异性，因此在某些良性病变如良性前列腺增生(bph)和前列腺炎中升高，导致其特异性下降，假阳性会引起患者不必要的有创活检和过度治疗。因此寻找早期诊断前列腺癌的分子标志物是前列腺癌研究的重点。

外泌体是一种由多种细胞分泌并可以在多种组织细胞间传递的30～100nm的囊泡，存在于血液、尿液、唾液和乳汁等多种体液中，其含有脂质、供体细胞来源的特异性蛋白质、以及longnon-codingrna、microrna等非编码rna和dna等。长链非编码rna(longnon-codingrna，lncrna)是长度大于200个核苷酸、不具备蛋白编码能力的转录本。随着癌症转录组研究的进展，发现lncrna在人类基因转录、转录后调节、细胞生长、增殖、分化及表观遗传方面起着重要作用，且具有复杂的生物学功能，与疾病的发生、发展、诊断及治疗密切相关。而外泌体可以为细胞外核酸提供保护，还能作为有效的载体将其转运到靶细胞中，肿瘤来源的外泌体由于rna含量较高，且在肿瘤自身的遗传信息传递中发挥重要作用，调控细胞功能与肿瘤微环境，影响肿瘤发生、发展、转移。以往研究表明，在乳腺癌中，lncrna-21a可能通过调节着丝粒蛋白f(cenp-f)的表达而影响细胞的增殖,当乳腺癌细胞吞噬富lncrna-21a的外泌体后，癌细胞的侵袭能力会有所下降；在肝癌中，外泌体来源的lncrnaror可促进肝癌细胞在缺血环境下的存活且在对化疗的抵抗性中也发挥重要作用；在胃癌中，血浆中lnc00152主要存于外泌体中，相较传统的生物学标志物癌胚抗原和cal99，血浆外泌体的lnc00152更具诊断优势。因此，这些肿瘤细胞来源外泌体中特异性lncrna标志物就会成为肿瘤诊断检测的高特异性指标，能克服直接从血液中提取rna进行检测过程中非检测物质的干扰，并且可以暗示出肿瘤发展情况和侵袭程度，通过检测体液尤其是外周血中的外泌体的情况使基于外泌体的诊断和随访更加容易。

外泌体常用的分离方法有超速离心法、磁珠免疫捕获法、沉淀法。超速离心法耗时耗力，需要大量初始样本；磁珠免疫捕获法特异性高，操作方便，但目前基于外泌体的标志物(cd63、cd9蛋白)的方法不能反映肿瘤的特异性；沉淀法时间短，可行性强，但外泌体特异性差，纯度低。

目前，用于前列腺癌的诊断主要依赖于临床病征、直肠指检联合psa检测的筛查、超声影像、前列腺穿刺活检等,有创检查无疑会给患者带来痛苦,而且还存在组织异质性和感染等风险。基于血液的液体活检方法对疾病进行分析已成为近些年的流行趋势,目前主要包括血浆游离dna、肿瘤血小板、外泌体和循环肿瘤细胞的检测。随着外泌体内部核酸成分的深入研究，开启了外泌体内lncrna作为肿瘤诊断和治疗的全新标志物的大门，但现有技术中,还缺乏对前列腺癌肿瘤特异性外泌体内的lncrna对前列腺癌诊断的技术应用。

技术实现要素：

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种前列腺癌特异性外泌体的制备方法。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种前列腺癌特异性外泌体。

本发明还要解决的技术问题是提供了前列腺癌外泌体中的长链非编码rnasap30l-as1和schlap1的制备方法。

本发明还要解决的技术问题是提供了前列腺癌特异性外泌体中的长链非编码rnasap30l-as1和schlap1表达量的试剂在制备用于前列腺癌诊断试剂中的应用。

本发明最后要解决的技术问题是提供了一种前列腺癌诊断试剂盒。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种前列腺癌特异性外泌体的制备方法，包括以下步骤：

1)血液处理：将血浆经离心分离后，取上清备用；

2)血浆总外泌体的分离：按照invitrogentm血浆外泌体提取试剂盒说明书提取血浆总外泌体；

3)双抗体偶联免疫磁珠的制备：取磁珠用磷酸盐缓冲液清洗后，用磷酸盐缓冲液重悬得到悬液；向悬液中加入epcam和psma抗体进行孵育；孵育后用磁力架分离磁珠，用磷酸盐缓冲液进行清洗，分离的磁珠用磷酸盐缓冲液重悬得到悬浮液备用；该磁力架是用来分离磁性颗粒的，分离的方法是将ep管置于磁力架上，静置2-3min，待磁珠完全贴到壁上，液体变澄清；

4)磁珠特异性捕获：用磁力架分离步骤3)的悬浮液得到双抗体偶联免疫磁珠，将步骤2)得到的血浆总外泌体加入双抗体偶联免疫磁珠中孵育；

5)前列腺癌特异性外泌体的制备：孵育完成后，用磷酸盐缓冲液清洗，再次用磁力架分离磁珠，即得到磁珠-双抗体-血浆前列腺癌特异外泌体复合物即为前列腺癌特异性外泌体。

其中，上述磁珠为链霉素亲和修饰的磁珠，磁珠直径为2.8μm。

其中，上述epcam和psma抗体为生物素标记的epcam和psma抗体。

本发明内容还包括一种所述方法制备得到的前列腺癌特异性外泌体。

本发明内容还包括一种前列腺癌外泌体中的长链非编码rnasap30l-as1和schlap1的制备方法，包括以下步骤：

1)外泌体rna的提取：按照takara公司的rnaisoblood试剂说明书要求的步骤方法提取外泌体rna；

2)外泌体rna反转录合成cdna：采用toyobo试剂盒revertraaceqpcrrtkit对步骤1)的外泌体中的rna反转录合成cdna；

3)长链非编码rna的扩增：使用toyobo的greenrealtimepcrmastermix试剂，按照其说明书所规定的操作步骤以步骤2)反转录的cdna为模板进行实时荧光定量pcr扩增获得长链非编码rnasap30l-as1和schlap1。

其中，上述实时荧光定量pcr的扩增引物为：

sap30l-as1正向引物：5’-tgaatgggctcacctgttcc-3’

sap30l-as1反向引物：5’-aggtccggaagggagacttt-3’

schlap1正向引物：5’-tggacacaatttcaagtcctca-3’

schlap1反向引物：5’-catggtgaaagtgccttataca-3’。

本发明内容还包括上述外泌体中的长链非编码rnasap30l-as1和schlap1表达量的试剂在制备用于前列腺癌诊断试剂中的应用。

其中，上述检测长链非编码rnasap30l-as1和schlap1表达量的试剂为实时荧光定量pcr检测试剂。

其中，上述实时荧光定量pcr检测试剂包括根据长链非编码rnasap30l-as1和schlap1的核苷酸序列设计并合成出特异性用于实时荧光定量pcr的检测引物：

sap30l-as1正向引物：5’-tgaatgggctcacctgttcc-3’

sap30l-as1反向引物：5’-aggtccggaagggagacttt-3’

schlap1正向引物：5’-tggacacaatttcaagtcctca-3’

schlap1反向引物：5’-catggtgaaagtgccttataca-3’。

本发明内容还包括一种前列腺癌诊断试剂盒，所述试剂盒包括所述的双抗体偶联免疫磁珠和所述的实时荧光定量pcr的检测引物。

其中，上述检测试剂盒还包括总外泌体提取试剂、逆转录试剂和rt-qpcr试剂。

有益效果：本发明相对于现有技术，具有以下优点：本发明可以成功分离前列腺癌患者血浆特异性外泌体，并进行长链非编码rnasap30l-as1和schlap1的检测。前列腺癌患者中长链非编码rnasap30l-as1和schlap1均明显增高，长链非编码rnasap30l-as1在早期前列腺癌患者中明显增高，与前列腺癌的进展有关；长链非编码rnaschlap1与患者gleason评分有关，可以反映疾病的发展，且在psa浓度为4-10ng的诊断灰区中能有效区分前列腺增生和前列腺癌患者。两个长链非编码rna联合诊断前列腺癌的auc(areaundercurve)值为0.922(95％ci：0.852-0.992)，与经典标志物psa联合诊断前列腺癌的auc值分别为0.972(95％ci：0.918-0.99)和0.952(95％ci：0.887-0.99)，灵敏度和特异度显著提高，因此它们可以作为一种评判前列腺癌的诊断和进展的标志物。

附图说明

图1是本发明的血浆前列腺癌特异性外泌体的分离和鉴定；a.透射电镜观察的血浆总外泌体的形态和大小(bar＝200nm)；b.动态光散射(dynamiclightscattering，dls)检测血浆总外泌体粒径及粒径分布；c.westernblot检测外泌体标志蛋白cd63和tsg101在血浆总外泌体中的表达；d.westernblot检测双抗体偶联免疫磁珠分离的正常人和前列腺癌患者血浆前列腺癌特异性外泌体cd63表达；e.血浆总外泌体和双抗体偶联免疫磁珠方法分离的前列腺癌特异性外泌体中长链非编码rnasap30l-as1和schlap1的表达情况；n代表正常对照组即normal，b代表前列腺增生组即bph，p代表前列腺癌病人组即pca；n1-n4代表正常对照组的不同样本检测结果，b1-b3代表前列腺增生组的不同样本的检测结果，p1-p5前列腺癌病人组的不同样本的检测结果；

图2本发明中所涉及sap30l-as1和schlap1实时荧定量pcr产物检测；所得产物大小分别为159bp和88bp左右，与设计引物时预测的产物片段大小一致；泳道1为dnamaker：lowladder，分子量大小为20-700bp；泳道2～5为schlap1的荧光定量pcr产物片段；泳道6～9为sap30l-as1的荧光定量pcr产物片段；

图3本发明中血浆前列腺癌特异性外泌体中sap30l-as1和schlap1表达量；normal-正常人组；bph-前列腺增生组；pca-前列腺癌组；relativeexpression用2^-δδct表示，多组间比较用非参数检验，p<0.05代表差异具有统计学意义；a：目的基因sap30l-as1在血浆前列腺癌特异性外泌体中的表达情况；b：目的基因schlap1在血浆前列腺癌特异性外泌体中的表达情况；

图4本发明中血浆前列腺癌特异性外泌体中目的基因sap30l-as1和schlap1诊断前列腺癌roc曲线图；sensitivity-敏感性，specificity-特异性；a：血浆前列腺癌特异性外泌体中sap30l-as1在前列腺癌的roc曲线；b：血浆前列腺癌特异性外泌体中schlap1在前列腺癌的roc曲线；c：血浆前列腺癌特异性外泌体中sap30l-as1和schlap1在前列腺癌联合诊断的roc曲线；d:血浆前列腺癌特异性外泌体中sap30l-as1和psa在前列腺癌联合诊断的roc曲线；e：血浆前列腺癌特异性外泌体中schlap1和psa在前列腺癌联合诊断的roc曲线；

图5本发明中血浆前列腺癌特异性外泌体中目的基因sap30l-as1和schlap1与临床病理参数的关系分析图；a：血浆前列腺癌特异性外泌体中sap30l-as1与t(肿瘤原发灶的情况)关系分析图，t表示的是肿瘤分期中的肿瘤原发灶情况，t2代表肿瘤局限在前列腺内，t3及t4代表突破了前列腺，侵袭其他组织的情况，用t2表示未侵袭，t3+t4表示已侵袭，说明疾病的进展；b：血浆前列腺癌特异性外泌体中schlap1与gleason评分(生物学行为和预后情况)关系分析图；c：血浆前列腺癌特异性外泌体中schlap1在血液psa浓度为4-10ng/ml的检测灰区时的表达情况；在psa为4-10ng/ml时，能够区分bph和pca；

当gleason评分＜7时，相当于高分化腺癌，当gleason评分≥7是，相当于低分化腺癌，可以反映疾病的预后，分化越低，恶性程度越高。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，通过结合实施例和附图进一步详述本发明的特点和优点。所该实施例仅是对本发明的解释，不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

实施例1：

血浆样本共收集110例，其中34例组织病理学确诊的前列腺癌患者血浆、46例前列腺增生患者血浆和30例健康对照者血浆。所有血浆样本均来自于武汉大学中南医院，溶血、脂血和其他异常血清被排除在外。

具体检测步骤如下：

1、血液样本预处理及保存

分别采集以上受试者静脉血于edta抗凝管中，静置后，吸取上层血浆于ep管中，然后室温2000g离心20分钟，收集上清于新的ep管中，室温10000g离心20min，吸取上清于无酶ep管中，储存于-80℃备用。

2、血浆总外泌体提取及保存(血浆总外泌体分离试剂盒(totalexosomeisolationkit，货号4484450，invitrogen)

若血浆样本处于冰冻状态，需37℃水浴，解冻后冰上放置待用。取血浆样本400μl，加入200μlpbs，充分混匀，加入20μl蛋白酶k，37℃孵育10min，加入120μlexosomeprecipitationreagent，充分混匀，置于4℃孵育30min，室温环境下10000g离心5min，弃上清，10000g离心30s，吸出弃掉残余液体，沉淀即为血浆总外泌体，加30μlpbs重悬后，置于-80℃保存。

3、透射电镜观察血浆总外泌体形态

取1滴血浆总外泌体悬液，滴在含碳铜网上，晾干后加1滴2％磷钨酸，静置5min，用滤纸吸去多余的液体，加1滴pbs漂洗1min，后用滤纸吸去多余液体，共清洗3次，晾干。用220kv电压透射电镜观察血浆总外泌体形态，结果如图1a显示。

4、动态光散射研究

对于外泌体粒径分布的研究，采用动态光散射方法进行检测。这里，采用英国马尔文公司zetasizernano-zs90仪器，激发光波长λ＝532nm进行实验。将血浆总外泌体样品经pbs稀释至适当的光学信号检测水平(即比例为1：50)，混匀后进行检测，检测结果如图1b显示。

5、westernblot检测外泌体标志蛋白

用细胞裂解缓冲液ripa裂解血浆总外泌体，冰上裂解30min，12000g离心20min，收集上清，bca法测定蛋白浓度，然后取1μg蛋白，经12％sds-page分离后，湿法转至pvdf膜上，用5％脱脂牛奶封闭pvdf膜，用抗cd63和tsg101兔多克隆抗体(1:1000稀释)4℃孵育过夜，tbst清洗后，再加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔igg孵育室温孵育2h，用持久性化学发光底物试剂处理并曝光显示，结果如图1c所示。

6、双抗体偶联磁珠进行前列腺癌特异性外泌体捕获

1)用涡旋仪将链霉亲和素修饰的dynabeadstmm-280streptavidin2.8μm磁珠震荡均一后，吸取20μl磁珠加入200μl磷酸盐缓冲液(1×的磷酸盐缓冲液，ph值为7.4)中，悬浮清洗，用磁力架分离磁珠，共清洗三遍。加入200μl磷酸盐缓冲液(1×的磷酸盐缓冲液，ph值为7.4)重悬；

2)向上述步骤1)所得悬液中分别加入4μl生物素化抗人epcam单克隆抗体(r&dsystems，usa)和生物素化抗人psma单克隆抗体(biolegend，usa)，颠倒混匀，置于mx-rd-pro旋转混匀仪上孵育2h(参数为混合角度0°，速度30rpm)；孵育后用磁力架分离磁珠，用400μl磷酸盐缓冲液(1×的磷酸盐缓冲液，ph值为7.4)进行清洗，分离的磁珠用200μl磷酸盐缓冲液(1×的磷酸盐缓冲液，ph值为7.4)重悬备用；

3)用磁力架分离步骤2)中的磁珠，将提取的血浆总外泌体加入步骤2)分离的磁珠中，混合均匀，置于4℃条件下mx-rd-pro旋转混匀仪上孵育过夜(参数为混合角度0°，速度30rpm)。孵育完成后，用磁力架分离磁珠，用400μl磷酸盐缓冲液(1×的磷酸盐缓冲液，ph值为7.4)清洗三遍，再分离，即得到磁珠-双抗体-血浆前列腺癌特异外泌体复合物。

7、westernblot检测前列腺癌特异性外泌体cd63表达

取2个正常对照组和5个前列腺癌组血浆样本，用步骤6的方法获得前列腺癌特异性外泌体，用步骤5的方法进行检测，结果如图1d所示。

8、血浆外泌体rna提取和保存

1)血浆外泌体(悬液中加入500μlrnaisoblood(takara)，吹打裂解，静置5min；

2)加入100μl氯仿，盖紧ep管盖，振荡15s，室温静置10min；

3)4℃条件下，12000g离心15min，取上清至新的无酶ep管中；

4)加入等体积异丙醇，盖紧ep管盖，振荡15s在室温下孵育10min；

5)4℃条件下，12000g离心10min，弃上清；

6)加入1ml由rnasefreewater配制的75％乙醇，颠倒混匀；

7)12000g离心5min后弃上清；

8)重复步骤6)和7)一次；

9)4℃条件下，12000g离心30s，小心吸出ep管中残余液体；

10)室温晾干后，加入10μl已65℃水浴的rnasefreewater，充分溶解后，对总rna浓度和纯度测定，-80℃保存。

9、cdna合成(revertraaceqpcrrtkit，toyobo)

1)将步骤8的总rna分别置于65℃变性5min，立即放于冰上冷却(以破坏rna的高级结构)；

2)以总rna为模板，primermix(oligodt和randomprimer，可直接用于mrna和非编码rna逆转录)为逆转录引物，反应体系如下：

3)按照以下温度条件进行实验：37℃，15min；98℃，5min；-20℃保存备用。

10、实时荧光定量pcr(greenrealtimepcrmastermix，toyobo)

反应体系如下：

反应条件是：95℃，1min；(95℃，15s；58.8℃，20s；72℃，45s)×40个循环；72℃，2min，设置在72℃，45s处采集荧光信号。

引物序列如下：

sap30l-as1正向引物：5’-tgaatgggctcacctgttcc-3’

sap30l-as1反向引物：5’-aggtccggaagggagacttt-3’

schlap1正向引物：5’-tggacacaatttcaagtcctca-3’

schlap1反向引物：5’-catggtgaaagtgccttataca-3’

分别对sap30l-as1和schlap1实时荧定量pcr产物用3％琼脂糖(biowest公司，西班牙)凝胶电泳进行鉴定，电泳图参见图2；所得产物大小分别为159bp和88bp左右，与设计引物时预测的产物片段大小一致。

本实施例的结果分析：

1)westernblot检测前列腺癌特异性外泌体cd63表达量的分析

由图1d结果看出，运用双抗体偶联磁珠进行前列腺癌特异性外泌体捕获方法，正常对照组cd63表达明显低于前列腺癌组，说明在正常对照组中几乎不能捕获前列腺癌特异性外泌体，而在前列腺癌组中可以捕获前列腺癌特异性外泌体，捕获方法有效。

2)目的基因sap30l-as1和schlap1表达量分析

由图1e结果看出，通过实时荧光定量pcr得到表达量的结果，目的基因sap30l-as1和schlap1在血浆总外泌体和前列腺癌特异性外泌体中表达有显著差异，具有富集的现象。采用2^-δδct对两目的基因定量数据分析，δct＝目的基因的ct值-内参基因的ct，δδct＝目的基因δct-对照组基因δct，目的基因ct值为用实时荧光定量技术检测到的目的基因sap30l-as1和schlap1的ct值，结果如图3所示，normal-正常人组；bph-前列腺增生组；pca-前列腺癌组；目的基因sap30l-as1和schlap1在前列腺癌患者前列腺癌特异性外泌体中的表达水平高于于健康对照组，且差异有显著性；与前列腺增生患者比较，也具有显著差异。

3)roc诊断效能分析：

roc分析外泌体中目的基因sap30l-as1和schlap1在前列腺癌的诊断价值；结果如图4和表1所示，外泌体中schlap1诊断效能好，具有较高的灵敏度；当两种lncrna联合诊断时，诊断效能明显高于单独的lncrna的诊断效能，敏感性和特异性均较高；当二者分别与psa联合诊断时，诊断效能、灵敏度、特异度均显著提高，表明血液psa浓度检测联合sap30l-as1和schlap1检测能较好的诊断前列腺癌。psa作为前列腺癌经典的诊断标志物，存在较高的假阳性率，而且也会在前列腺增生的时候水平增加，因而会导致过度医疗的发生。本发明的sap30l-as1和schlap1分子可以优化前列腺癌的诊断，以及同时对bph和pca有一个鉴别诊断。

表1各种诊断的灵敏度、特异性

4)lncrna与临床病理参数关系分析：

用非参数检验分析sap30l-as1和schlap1与年龄、psa水平、tnm分期中的t(肿瘤原发灶的情况)、n(区域淋巴结受累情况)、m(远处转移情况)及gleason评分的关系，图5展示了有表达差异的分析结果，用2^-δδct表示relativeexpression，t表示肿瘤原发灶情况；结果表明sap30l-as1与前列腺癌的t呈负相关，随着肿瘤原发灶的进展，sap30l-as1表达越低；而schlap1除与前列腺癌的gleason评分呈正相关，还可以在psa诊断灰区时有效区分前列腺增生和前列腺癌，在癌组织中表达明显增高。

实施例2制备长链非编码rnasap30l-as1和schlap1用于前列腺癌患者诊断的试剂盒

1、实时荧光定量pcr特异性引物序列

sap30l-as1正向引物：5’-tgaatgggctcacctgttcc-3’

sap30l-as1反向引物：5’-aggtccggaagggagacttt-3’

schlap1正向引物：5’-tggacacaatttcaagtcctca-3’

schlap1反向引物：5’-catggtgaaagtgccttataca-3’

2、实施例1制备的双抗体偶联免疫磁珠

3、总外泌体提取试剂

4、逆转录试剂

5、rt-qpcr试剂

以上所述内容，仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>武汉大学

<120>前列腺癌特异性外泌体、lncrna及其制备方法和应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(sap30l-as1正向引物)

<400>1

tgaatgggctcacctgttcc20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(sap30l-as1反向引物)

<400>2

aggtccggaagggagacttt20

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(schlap1正向引物)

<400>3

tggacacaatttcaagtcctca22

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(schlap1反向引物)

<400>4

catggtgaaagtgccttataca22