一种耐热裂解酶MMPpgh和编码此酶的多核苷酸的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种耐热裂解酶mmppgh以及编码此酶的核酸序列。

背景技术：

裂解酶为噬菌体感染宿主后表达释放的一类细胞壁水解酶，通过水解细胞壁肽聚糖而使细菌裂解，并释放出子代噬菌体。根据作用于细胞壁肽聚糖共价键位点不同，可以将噬菌体裂解酶分为三类，葡萄糖苷酶(glucoseidase)、酰胺酶(amidase)、内肽酶(endopeptidase)，它们分别水解氨基糖之间的糖苷键，n-乙酰胞壁酸和l-丙氨酸之间的酰胺键以及肽交联桥。

目前，很多裂解酶的结构得到了深入研究，分歧杆菌噬菌体裂解酶蛋白分为3个区域，典型的c-端区，与噬菌体内肽酶的c-端细胞壁结合区功能相关；中心区域，包含一个与肽聚糖水解酶相关的结构及n-端区域，常为一系列编码肽酶功能的蛋白，它们每个结构域类型均有明显差别，研究已发现6种可能的n-端肽酶结构区，5种酰胺酶/糖苷酶结构区和4种c-端细胞壁结合结构区，可能出现的组合至少120种，其中绝大多数结构分布包含一个n-端肽酶结构区，一个中心酰胺酶/胞壁质酶或糖苷转移酶区及c-端区，但是有一个例外，myrnagp243没有c-端结合区。

近年来，随着抗生素大量滥用，逐渐出现了很多耐药性菌株带来的各种问题，人们迫切需要研究新型的抗菌试剂，而细菌的天敌噬菌体给人们提供了一个全新的思路，使人们逐渐开始多方面探索噬菌体裂解酶的抗菌作用。其中裂解酶作为新型抗菌制剂，能够对细菌进行防治、治疗并具有独特的优点。首先，噬菌体裂解酶不会对动物产生毒副作用，因为它只能作用于病原菌宿主而对其他细菌不产生作用。其次，噬菌体裂解酶的催化结构作用于病原宿主菌的细胞壁肽聚糖，病菌对它不会产生耐药性，同时能够与抗生素联合用药，共同发挥作用。nelson等人实验证明通过重组噬菌体裂解酶纯化能够预防和治疗a型链球菌引起的小鼠粘膜感染。裂解酶能高效裂解细菌，可以抑制细菌的生长，使其有望取代传统的抗生素治疗，特别是对多重耐药性致病菌，也可作为抑菌剂使用于环境的杀菌。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种耐热裂解酶mmppgh，该裂解酶能够抑制革兰氏阳性和阴性细菌的生长，其在37~75℃范围内具有催化活性，其来源于亚栖热菌（meiothermus）噬菌体mmp17，该耐热裂解酶mmppgh的氨基酸序列如seqidno：1所示，或具有与seqidno：1所示的氨基酸序列至少90%的相同性的多肽、类似物或衍生物。

本发明的另一个目的是提供编码耐热裂解酶mmppgh的多核苷酸，其核苷酸序列如seqidno：2所示，或其互补序列，或具有与seqidno：2所示的核苷酸序列至少80%相同性的多核苷酸及其互补序列。

本发明的有益效果：

本发明提供的耐热裂解酶能高效裂解细菌，可以抑制细菌的生长，使其有望取代传统的抗生素治疗，特别是对多重耐药性致病菌，也可作为抑菌剂使用于环境的杀菌。

目前报道的裂解酶多为常温型裂解酶，在常温下具有较高活性，本发明所述裂解酶在37~75℃范围内均具有催化活性，在56~65℃催化活性最高，可适用于高温环境的杀菌，其核苷酸序列可用于构建生产此裂解酶的基因工程菌株。

附图说明

图1是本发明耐热裂解酶mmppgh基因pcr产物电泳示意图，其中泳道1为marker，泳道2为阴性对照，泳道3为mmppgh基因pcr产物，其大小为633bp；

图2是本发明中重组质粒mmppgh/pet28a双酶切图谱示意图，其中泳道1为marker，泳道2为未经双酶切的重组质粒mmppgh/pet28a条带；泳道3为重组质粒mmppgh/pet28a双酶切后的两个条带；

图3是本发明中耐热裂解酶mmppgh的蛋白表达检测示意图，泳道1为genstarm221-01蛋白marker，泳道2、3为诱导后的表达菌株超声破碎后的上清液；

图4是本发明耐热裂解酶mmppgh蛋白的纯化结果检测示意图，其中泳道1为genstarm221-01蛋白marker，泳道2为总蛋白，泳道3为空载总蛋白，泳道4为挂柱透过液，泳道5为30mm咪唑洗脱液，泳道6为150mm咪唑洗脱液，泳道7为750mm咪唑洗脱液；

图5是本发明中温度对耐热裂解酶mmppgh活性的影响结果示意图；

图6是本发明不同ph值对耐热裂解酶mmppgh活性的影响结果示意图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。

实施例1：耐热裂解酶mmppgh的克隆和表达

1、裂解酶基因的扩增，（以meiothermustg17的噬菌体mmp17基因组dna为模板）

（1）嗜热噬菌体mmp17裂解酶mmppgh基因的扩增所用引物序列如下：

正向引物：5'-ccggaattcatgcgcatcgttcatccc-3'

反向引物：5'-cccaagcttttgcaatgcgcgatttgt-3'；

（2）扩增体系如下：

表1：扩增反应体系

；

（3）扩增条件如下：

将反应体系混匀，先在95℃预变性3min，然后在95℃变性40s，58℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环后，72℃延伸8min。反应完后取产物3μl，在1％琼脂糖凝胶中进行电泳分析（见图1），mmppgh基因pcr产物大小为633bp。

2、裂解酶基因mmppghpcr产物的胶回收

（1）在电泳仪中灌制1.0％琼脂糖凝胶；

（2）将待分离纯化的pcr产物点样电泳，于适当位置停止电泳；

（3）在紫外灯下切下含该目的片断的凝胶，转移到1.5ml的ep管中；

（4）用百泰克生物公司胶回收试剂盒进行目的片段的回收，回收方法按说明书操作进行。3、重组表达载体的构建

为了把目的基因片断连接到表达载体pet28a，就需要使目的片断带有粘性末端的片断，即带有酶切位点；

（1）带有粘性末端线性载体pet28a的制备

为了将目的基因片断连接到表达载体pet28a上，就需要使目的片断带有粘性末端的片断，即带有酶切位点；同样，为了使目的片断能插入载体中，也需要使载体带有粘性末端，并且使它们的酶切位点相同。

a、质粒抽提：用质粒提取试剂盒（百泰克），操作步骤如下：

①菌种活化：无菌接种环蘸取-80℃冻存的菌种保存液，三线法接种于氨苄lb平板，37℃培养12-16小时；

②增菌并收集菌体：取氨苄青霉素5μl(终浓度100μg/ml)加入5mllb培养基中；用接种环挑取阳性克隆，接种于amp+-lb培养基中；然后放入37℃培养箱中，摇床培养，过夜；去3ml培养的菌液，5000rpm，室温离心5min，使菌体沉淀，弃上清液；

③用250μl溶液p1（含rna酶）重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮；

④加250μl的溶液p2，温和地上下翻转8次使菌体充分裂解，直到溶液变得清亮；

⑤加400μl溶液p3，立即温和地上下翻转7次，室温放置5分钟，室温13,000rpm离心10分钟，小心取上清；

⑥将吸附柱安置于收集管上，将上一步所得上清液加入吸附柱ac中（吸附柱放入收集管中，溶液太多分可分两次加入），13,000rpm离心1分钟，弃滤液；

⑦加入500μl去蛋白液pe，13,000rpm离心60秒，弃滤液；

⑧加入500μl漂洗液wb，13,000rpm离心60秒，弃滤液；

⑨重复步骤⑦一次，13,000rpm离心60秒，弃滤液，空柱13,000rpm离心2分钟，室温放置5分钟，除去残留乙醇；

⑩取出吸附柱ac，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加70μl洗脱缓冲液eb(65℃预热)，室温放置1分钟，13,000rpm离心1分钟洗脱质粒。

（2）耐热裂解酶mmppgh基因片段和pet-28a质粒的双酶切

①酶切体系如下：

表2：酶切体系

；

②反应条件：37℃烘箱酶切5h左右，回收mmppgh基因片段和酶切后的pet-28a质粒。（3）重组表达载体的构建、mmppgh蛋白的诱导表达和纯化

①将前面实验得到的带有粘性末端的线性载体pet28a和mmppgh裂解酶基因片段，通过连接转化并用菌落pcr、酶切鉴定（见图2）及测序验证，即可得到重组表达载体。

②耐热裂解酶mmppgh蛋白在大肠杆菌中的诱导表达

将构建好的重组载体mmppgh/pet28a转化至e.colirosetta菌株，得到表达菌株pet28a-mmppgh/rosetta；含重组质粒的菌株经培养过夜，菌液按1%比例接种到kan^＋(终浓度50μg/ml)的lb液体培养基，37℃摇床培养至其od值0.6-0.8；取出5ml菌液用作对照实验；向余下的菌液加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷iptg（终浓度为1mm），放入37℃、28℃，80rpm摇床诱导培养6小时，取样5ml。

4、耐热裂解酶mmppgh蛋白sds-page检测

将取出的5ml菌液，6000rpm，离心10min，弃上清，加入终浓度为30mm咪唑溶液悬浮菌体，超声波破碎菌体（功率25%，打3s，停4s，共3min），98℃热裂解10min使菌体破释放菌体内蛋白；配制sds-page胶，浓缩胶5%，分离胶12%；按照顺序上样进行电泳（浓缩胶80v，30min；分离胶120v，120min）；将sds-page胶取出，加入r-250考马斯亮蓝染色液，沸水浴30min；染色完成后，进行脱色液脱色，脱色2次每次沸水浴30min，观察结果并拍照分析（见图3）。

5、耐热裂解酶mmppgh重组蛋白的纯化

利用上述方法大量诱导含重组质粒mmppgh/pet28a的rossetta菌株，菌液经离心收集大肠杆菌菌体(4℃，4,500rpm，20min)。用30mm咪唑溶液悬浮菌体后进行超声波破碎，4℃，13,000rpm离心10min，上清用镍柱进行手工纯化，先用10倍柱体积ddh2o清洗柱子，再用10倍柱体积30mm咪唑平衡柱子，样品上柱，分别用10倍柱体积的（150mm、500mm、750mm）咪唑洗脱柱子，再用10倍柱体积ddh2o清洗柱子，最后用20%无水乙醇填充柱子，用缓冲液（50mmtris-hcl，ph7.9）透析，酶2小时更换一次透析液，共透析10小时，纯化的重组蛋白组分进行sds-page检测（见图4）。

6、耐热裂解酶mmppgh重组蛋白的浓度及活性测定

（1）bradford法测定裂解酶mmppgh重组蛋白的浓度

取干净的4ml离心管，按顺序标号，空白、标1、标2、标3、标4、标5、标6。分别加入标准蛋白溶液（1mg/ml的标准蛋白bsa溶液）、待测样品溶液、ddh2o、考马斯亮蓝g-250储存液，混匀。用紫外分光光度计测其波长为600nm处的吸光度值，以浓度为0mg/ml的bsa溶液作为空白对照。以蛋白浓度为横坐标，od600值为纵坐标，绘制标准曲线。计算公式：待测样品蛋白浓度（mg/ml）=测定样品的od600值/标准蛋白的od600值×标准蛋白的浓度×稀释倍数得标准曲线方程为：y=0.0253x+0.0053（r²=0.9967），将纯化后得裂解酶mmppgh测其od600吸光值，测得od值为0.122，计算得到蛋白浓度为0.231mg/ml。

（2）folin-酚法测定裂解酶mmppgh对酪蛋白水解酶活测定

①标准曲线制备

取干净的50ml离心管，按顺序标号，空白、标1、标2、标3、标4、标5。将100μg/ml酪氨酸（ml）标准液与不同体积的ddh2o配成不同标准浓度，总体积为10ml；分别吸取上表中不同浓度的酪氨酸溶液1ml，各加入0.4mol/l碳酸钠溶液5ml，再加入购买的福林试剂1ml；摇匀后放置于40℃水浴锅中，保温发色20min，测量od值600并记录；得到标准曲线方程y=0.0107x-0.0336（r²=0.9961）。

计算公式y=a×n×4/10（公式:y：样品的酶活力，单位u/ml；a:样品测得的od值，代入标准曲线后计算得到的酪氨酸微克数；n:酶液的稀释倍数；10:反应时间为10min，以1min计；4：反应试剂的总体积，ml）

酶活单位定义：1ml酶液，在一定温度和ph条件下，1min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活单位，以u/ml表示。

②酶活测定

吸取样品稀释液1ml，置于40℃水浴锅中预热2min，然后加入经同样预热的2%酪蛋白1ml，精确保温10min，时间到后，立即再各加入0.4mol/l的三氯乙酸2ml，以终止反应，继续置于水浴锅中保温20min，使得残余蛋白质沉淀。注射器吸取含有沉淀的溶液，将溶液使用0.45μm滤膜过滤，然后吸取滤液1ml，再加入0.4mol/l碳酸钠5ml，已稀释的福林试剂1ml摇匀，40℃保温发色20min后进行光密度(od)测定。

测定结果：od600值为0.215，代入标准曲线方程y=0.0107x-0.0336（r²=0.9961）计算得到酪氨酸含量23.2μg。将所得酪氨酸含量值代入公式y=a×n×4/10，计算得到酶活为223u/ml。

实施例2：耐热裂解酶mmppgh部分酶学性质及酶活性实验

1、耐热裂解酶mmppgh最适作用温度、ph值及金属离子对耐热裂解酶mmppgh的影响

为研究裂解酶mmppgh最适作用温度，ph值及金属离子对裂解酶的影响，采用培养至对数期的tg17菌液；将对数生长期的tg17菌液，4500rpm离心20min后，弃上清。沉淀以10mlpbs（ph7.4）悬浮后，超声破碎，离心得沉淀，将沉淀重新使用5mlpbs悬浮。此时tg17细胞壁均为细胞碎片，以此作为裂解酶mmppgh的反应底物。测得tg17反应底物的初始od600值=0.241。

（1）耐热裂解酶mmppgh的最适催化温度

将纯化后的裂解酶mmppgh加入制备好的tg17反应底物中，然后置于不同温度反应5h，反应温度分别是37℃、45℃、50℃、56℃、65℃、70℃、75℃。根据反应前后od600的变化量确定其最适催化温度（图5），如图5所示，其催化温度范围为37-75℃，在65℃催化活性最高，可见耐热裂解酶mmppgh具有明显的高温催化活性。

（2）耐热裂解酶mmppgh的最适催化ph

将纯化的裂解酶mmppgh加入制备好的tg17底物中，分别在不同ph值的磷酸盐缓冲液中，相同温度（最适作用温度）下，作用时间5小时，根据反应前后od600的变化量确定其最适ph（图6），如图6所示，其最适催化ph为7-8。

2、耐热裂解酶mmppgh对菌株生长的影响

按1%接种量，接种e.coli、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和耐药性肺炎克雷伯菌到lb液体培养基中，37℃150rpm培养至对数生长期。吸取20μl纯化后的mmppgh酶液与80μl处于对数生长期的菌液混合，37℃恒温培养50min后，将反应后的混合液稀释到合适的倍数，涂布平板，过夜培养后，统计实验组与空白对照组平板单菌落数，计算致死率。空白对照组为20μlddh2o代替酶液。

将反应后的混合液稀释后涂布平板，由涂布结果知，每组实验组和空白对照组平板上的单菌落数并不一致，计算后得大肠杆菌致死率为52.2%；沙门氏菌致死率为87.5%；金黄色葡萄球菌致死率为53.9%，耐药性肺炎克雷伯菌致死率为89.4%（表3）。

表3：裂解酶mmppgh对不同菌株生长的影响结果

；

3、不同金属离子对酶活的影响

将纯化的裂解酶mmppgh加入制备好的tg17底物中，混合液中加入不同金属离子mn²⁺、ca²⁺、mg²⁺、zn²⁺、cu²⁺、k⁺，并保持离子浓度为2mmol/l，最适作用温度和最适ph条件下，作用时间5小时，测定od600值。其中空白实验组中使用ddh2o代替金属离子。我们把能提高酶活的金属离子称为没得激活剂。反之，则称酶的抑制剂。mg²⁺、zn²⁺对酶有激活作用，尤其是mg²⁺离子。而ca²⁺、k⁺、mn²⁺对酶有抑制作用（表4）。

表4：金属离子对mmppgh酶活的影响

。

序列表

<110>昆明理工大学

<120>一种耐热裂解酶mmppgh和编码此酶的多核苷酸

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>210

<212>prt

<213>噬菌体mmp17(phagemmp17)

<400>1

metargilevalhispropheproglnproalaargalaargvalasp

151015

alaglypheleuaspproargtyrproglntrpargargalaalagly

202530

leualaproalagluhisthrglyvalasptyrasnleuvalglythr

354045

serglyaspalaaspleuglytyrprovalvalalametalaaspgly

505560

ilevalarghisalaargalahisargiletrpglyasnilevalleu

65707580

leugluhisproglnleuglyleutrpserglntyralahisleutyr

859095

glnleualavalaspalaglyglngluiletrpalaglygluproleu

100105110

glyserileglyargglyaspproargalapropheleualahisleu

115120125

hisphegluileargthrargproleuproalaaspasntrpprogly

130135140

metasnlysthralailelysgluglytyrleuaspprogluthrtrp

145150155160

leulysglnhismetalathrgluargargphethrargglnglyleu

165170175

valleutrpleuproaspglylyshissermetproglylysthrile

180185190

valasnleuaspaspprothrleuvalhisvalargthrasnargala

195200205

leugln

210

<210>2

<211>636

<212>dna

<213>噬菌体mmp17(phagemmp17)

<400>2

atgcgcatcgttcatcccttcccccaacctgcccgagcccgcgtagacgcgggcttttta60

gatccccgctatccccagtggcgacgggcagctgggctggccccggctgaacacacaggg120

gtggactacaacctggtaggcaccagcggtgatgctgacctgggttatccggtggtagca180

atggccgatggcattgttcggcatgcccgtgcgcaccgcatttggggaaatatcgttctg240

ctcgagcatccccaattgggcctgtggagccagtacgcccatctgtaccagttggccgta300

gatgcagggcaggaaatctgggccggggaaccgctgggcagcatcggcaggggggaccct360

cgagctcccttcctggcccacctgcatttcgagatacgcacgcgtccgctccccgccgac420

aactggccggggatgaacaaaactgcgataaaggagggatatctggatccggaaacatgg480

tggctgaagcagcatatggcgaccgagcggcggttcacccggcaggggctcgtcctgtgg540

ttgccagatggaaaacacagtatgcctggcaagacaatcgtcaatctagacgatccaacg600

ttagtgcatgtgcgtacaaatcgcgcattgcaatag636

<210>3

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>3

ccggaattcatgcgcatcgttcatccc27

<210>4

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>4

cccaagcttttgcaatgcgcgatttgt27