本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种凝血因子ⅻ的突变体及其应用。
背景技术：
凝血因子是参与血液凝固过程的各种蛋白质组分。其生理作用在血管出血时被激活，和血小板粘连在一起并且补塞血管上的漏口。世界卫生组织按其被发现的先后次序用罗马数字编号，有凝血因子ⅰ，ⅱ，ⅲ，ⅳ，ⅴ，ⅶ，ⅷ，ⅸ，ⅹ，ⅺ，ⅻ,ⅹⅲ等。凝血因子ⅻ(fⅻ)又称接触因子、表面因子或hageman因子，位于5号染色体上，主要字肝脏合成，是一个由596个氨基酸组成的单链糖蛋白。fⅻ在凝血中的作用是参与内源性凝血途径的接触相激活，它还参与纤溶系统的激活。
凝血因子缺乏性疾病，因血浆中某一凝血因子缺乏而影响凝血过程、导致凝血障碍性出血的一类疾病。凝血因子ⅻ缺陷症是一种常染色体隐性遗传性疾病，部分患者可表现为显性遗传，患者无临床出血表现，多在术前凝血筛查aptt延长时发现，发病率并不十分清楚。据统计，国际已报道的遗传性fⅻ缺陷的基因突变只有二十多种，主要为错义突变和无义突变，其次为剪接异常和小缺失。寻找非同义突变对fⅻ缺陷综合症的检测以及发病机制的研究具有重要的意义。
急性心肌梗死是一种以起病急、变化快、致死率高为临床特点的疾病，其是由易损斑块破裂引起的血栓形成，导致冠状动脉血流减少或中断，时间达到20-30min以上即可使心肌长时间缺血、缺氧而发生损伤、坏死的一种疾病。临床上凝血因子ⅻ缺陷症的患者有形成血栓的倾向，认为fⅻ与血栓性疾病存在一定的关系。
本发明基于临床研究，收集凝血因子ⅻ缺乏症合并急性下壁心肌梗死病例样本，通过高通量测序分析，凝血因子ⅻ基因第14外显子存在非同义突变a1685g(p:d562g)，说明该突变具有致病性，为疾病致病机制以及临床应用的研究提供分子基础。
技术实现要素：
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于，提供一种诊断凝血因子ⅻ缺陷综合症合并急性下壁心肌梗死的手段和产品。
本发明提供了一种突变的凝血因子ⅻ蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示，具有p.d562g突变。
本发明提供了一种如上面所述的突变的凝血因子ⅻ蛋白的核苷酸，所述核苷酸序列如seqidno.2所示，具有a1685g突变。
本发明提供了上面所述的蛋白或核苷酸在制备诊断心肌梗死产品中的应用。
进一步，所述心肌梗死为凝血因子ⅻ缺乏症合并急性下壁心肌梗死。
进一步，所述产品包括试剂盒、芯片或制剂。
本发明提供了一种检测凝血因子ⅻ基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括检测如seqidno.2所述的核苷酸的试剂。
进一步，所述试剂包括核酸探针、或引物。
本发明提供了一种检测心肌梗死的试剂盒，所述试剂盒包括检测凝血因子ⅻ第1685位核苷酸的试剂，或检测凝血因子ⅻ蛋白第562位氨基酸的试剂。
进一步，所述心肌梗死为凝血因子ⅻ缺乏症合并急性下壁心肌梗死。
进一步，所述试剂包括：引物或引物对、探针、抗体、或核酸芯片。
进一步，所述引物对可以特异性扩增出含第1685位突变的g的核酸扩增产物。
进一步，所述的探针可以特异性的结合于第1685位突变的g的核酸片段。
进一步，所述的抗体可以特异性结合于含第562位突变的甘氨酸的多肽。
本发明提供了一种检测样本中凝血因子ⅻ基因是否存在突变的方法，包括步骤：
1)检测待测样本中凝血因子ⅻ基因或cdna的核苷酸序列；
2)将步骤1)的核苷酸序列与野生型的凝血因子ⅻ基因的核苷酸序列进行比较，如果对应于野生型的凝血因子ⅻ基因的低1685位核苷酸不为a，则表示该样本中的凝血因子ⅻ基因存在突变。
“样本”是指出于体外评估目的自个体获得的生物学样本，本发明中样本或患者样本可以包括任何体液。优选的样本是血液，诸如血清、血浆或全血。
在本发明中，术语“外显子”一词是指在成熟mrna中被保留下的部分，即成熟mrna对应于基因中的部分。内含子是在mrna加工过程中被剪切掉的部分，在成熟mrna中不存在。外显子和内含子都是对于基因而言的，编码的部分为外显子，不编码的为内含子，内含子没有遗传效应。
术语“引物”指的是能与模板互补配对，在dna聚合酶的作用合成与模板互补的dna链的寡聚核苷酸的总称。引物可以是天然的rna、dna，也可以是任何形式的天然核苷酸，引物甚至可以是非天然的核苷酸如lna或zna等。引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3’端与模板互补的引物的5’端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行扩增。
术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括(但不限于)：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。
所述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是dna，也可以是rna，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过pna(polyamidenucleicacid，肽核酸)、lna(注册商标，lockednucleicacid，bridgednucleicacid，交联化核酸)、ena(注册商标，2′-o,4′-c-ethylene-bridgednucleicacids)、gna(glycerolnucleicacid，甘油核酸)、tna(threosenucleicacid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸
术语“芯片”、“阵列”、“生物芯片”可互换使用，而且指在共同基片上排列的多种探针、标志物的集合，该基片可以是硅片、尼龙带、塑料带、或玻璃载片。
“阵列”、“宏阵列”或“微阵列”指有意创建的物质(诸如分子、标志物、开口、微线圈、检测仪和/或传感器)集合，其附着至基片或固体表面(诸如玻璃、塑料、硅片或其它形成阵列的材料)或在基片或固体表面(诸如玻璃、塑料、硅片或其它形成阵列的材料)上装配。阵列可用于同时测量大量(例如数十、数千或数百万)反应或组合的水平。阵列也可含有少量物质，例如一个、少数或一打。阵列中的物质可以彼此相同或不同。阵列可以采取多种形式，例如可溶性分子的文库、固定化分子的文库、固定化抗体的文库、拴系至树脂珠、硅片、或其它固体支持物的化合物的文库。阵列可以是宏阵列或微阵列，取决于阵列上的垫的大小。宏阵列一般含有约300微米或更大的垫大小，而且能容易地通过凝胶和印迹扫描仪来成像。微阵列一般会含有小于300微米的垫大小。
“固体支持物”指不溶性、官能化、聚合材料，可以对其附着或共价结合(常常经由接头)文库成员或试剂，从而固定化或容许它们易于与过量的试剂、可溶性反应副产物、或溶剂分开(通过过滤、离心、清洗等)。
本发明中，试剂盒包括一种或多种无菌容器，这样的容器可以是盒、安瓿、瓶子、管形瓶、管、袋、小袋、泡罩包装、或本领域已知的其它合适的容器形式。这样的容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔、或适于容器药物的其它材料。
术语“dna文库”是指对基因组的目的片段进行打断，获得一组具有一定大小的dna片段混合物。
dna文库的制备方法为本领域技术人员所熟知，包括(但不局限于)步骤：
1.提供一待检测样本，所述样品含有经打断的、源自基因组dna的双链核酸片段，并且所述核酸片段具有平末端；
2.在双链核酸片段的末端添加接头连接序列；通过所述接头连接序列，在所述双链核酸片段的两端添加接头，其中所述接头具有引物结合区以及连接互补区，所述的连接互补区与所述的接头连接序列互补；两侧3’端和5’端的接头的引物结合区序列不同。
3.对上一步骤获得的带有接头的dna双链核酸片段，用第一引物和第二引物进行扩增，从而获得pcr扩增产物的混合物，其中所述引物具有对应于所述接头的引物结合区的接头结合区，并且位于接头结合区外侧的测序探针结合区。
在一个优选例中，还可以对打断产物、末端修复产物、接头产物和富集产物进行纯化。纯化条件及参数为本领域技术人员所熟知，对反应的条件进行一定的变化或优化也在本领域技术人员能力范围之内。
术语“外显子捕获”，“芯片杂交”可互换使用，指的是探针对文库中外显子区域的dna片段进行特异性选择和结合的过程。
dna分子正常情况下是双链，因此捕获之前，dna分子必须变为单链，一般是通过加热使其变性而达到解链目的，解链的dna分子被迅速冷却，即保持单链状态。文库变性后在杂交平台与芯片进行捕获杂交。含有外显子区域的dna片段与固定在芯片上的探针之间在严格的条件下进行分子杂交。较佳地，芯片上探针分子的浓度要远远高于靶分子浓度。待杂交完毕后，通过变性等方法收集捕获的序列并纯化，得到来自捕获后的序列混合物。
本发明可以利用本领域内已知的任何方法对基因进行检测。本领域技术人员应当理解，检测基因的手段不是本发明的重要方面。本发明中的基因使用本领域普通技术人员已知的多种检测技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、免疫检测技术。
有益效果：
本发明首次发现了凝血因子ⅻ基因缺乏综合症的致病基因，可以用于疾病的早期诊断，为开发疾病的治疗药物提供科学依据。
同时本发明提供了一种凝血因子ⅻ缺乏症合并急性下壁心肌梗死的诊断产品和手段，有利于疾病的早期发现，提高患者的生存和生活质量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1患者信息
患者男性，51岁，因“间断胸闷3天，加重12小时”入院。入院3天前患者活动后出现胸闷、气短、大汗、咽部堵塞感等症状，持续15min可自行缓解，未予以重视。10小时前获得后胸闷症状再次发作，就诊于我院急诊，心电图示ⅲ、avf导联st段稍抬高；肌钙蛋白i(tni)2.11ng/ml；肌酸激酶同工酶(ckmb)92u/l；活化部分凝血活酶时间(aptt)160s(25.4s-38.4s)。既往高血压病史8年，最高达140/100mmhg，长期口服降压药，血压控制在130/90mmhg左右。发现凝血因子ⅻ缺乏症病史3年。否认高脂血症、糖尿病、高脂血症、川崎病和风湿性疾病史，无外伤手术史，无吸烟和饮酒史。
入院查体：左上肢血压115/75mmhg，右上肢血压109/69mmhg(1mmhg＝0.133kpa)；神清，颈静脉无怒张，肝颈静脉回流征阴性，未见颈动脉异常搏动；全身皮肤、粘膜无出血点、瘀点及瘀斑；双肺呼吸音粗，未闻及干湿性啰音；心率61次/min，心律齐，未闻及病理性杂音，无心包摩擦音；腹软，肝脾肋下未触及；双下肢无水肿。入院后复查心电图示ⅲ、avf导联st段较前回落，肌钙蛋白i2.58ng/ml。
实验室检查：凝血常规示aptt190.3s；低密度脂蛋白胆固醇3.22mmol/l；血常规示中性粒细胞百分比80.7％，血红蛋白正常；血气分析、肝肾功能、血糖、d-二聚体正常。x线胸片：主动脉硬化。超声心电图：左室节段性室壁运动异常。凝血因子ⅻ(fⅻ)活性2.3％(50％～150％)，fⅻ抗原为1％，其他凝血因子(ⅱ、ⅴ、ⅶ、ⅷ、ⅸ、ⅹ、ⅺ)活性均正常。诊断为冠心病急性下壁心肌梗死killipⅰ级；高血压2级很高危；凝血因子ⅻ缺乏症。
冠状动脉造影：冠状动脉右优势型，左主干无明显狭窄，前降支中段最重85％弥漫性狭窄，回旋支从近段完全闭塞，右冠脉中段50％局限性狭窄。向患者家属说明上述情况后，决定行回旋支介入治疗。将6febu3.5导引导管至左冠状动脉开口，应用ns导丝通过闭塞病变部位到达回旋支远端，应用1.5mm×15mmminitrek球囊以10atm×10s预扩张病变处，远端血管显影，以14atm×10s植入resolute3.0mm×24mm支架1枚。择期性前降支介入治疗，将导引导管至左冠状动脉开口，应用2根bmw导丝到达前降支和第二对角支远端，应用2.5mm×20mmsprinter球囊以10-12atm×10s预扩张病变处，由远及近依次以10atm×10s和12atm×10s植入resolute3.0mm×24mm和xiencex3.0mm×28mm支架2枚，支架相连接，应用3.5mm×9mmncsprinter球囊以8-14atm×5s对支架连接处和近端支架后扩张。术后多次复查aptt波动于200-300s之间。术后随访3个月，患者无胸闷等不适，无皮肤、粘膜出血倾向。
实施例2测序分析
1、样本采集
采集患者的外周血样本，患者签署知情同意书，并获得伦理委员会的同意。
2、标本dna制备
按dna提取试剂盒(qiaampdnabloodminikit，qiagen)提取基因组dna，用1％琼脂糖凝胶电泳和nanodrop2000分光光度计进行dna定量检测。
3、样本文库构建：采用超声打断仪(covariss2，massachusetts，usa)将基因组dna随机打断成主带200-300bp的片段，取500ng提纯的dna片段进行末端修复并连接上标记性接头，构建dna测序文库。按照illumina标准建库方法进行3步酶促反应：通过末端修复，加“a”和连接illumina测序接头(通过pcr反应，将一个8bp的barcode连接至dna片段上)，形成样本文库。
4、序列捕获：序列捕获采用定制的罗氏固相芯片进行(nimblegensequencecapture芯片，roche)。取12个样本文库，按1:1混合后，取其中5μg进行序列杂交捕获。捕获实验过程按照罗氏固相序列捕获芯片标准实验流程进行，混合后的文库在42℃条件下杂交16-20h。然后进行洗脱，纯化后进行pcr扩增，即得到序列捕获后的产物。
5、测序：采用illuminahiseqx10高通量测序仪对上述产物连续测90个循环，用illuminapipelinesoftware(version1.3.4)读出原始测序数据。数据信息处理及突变分析参考dbsnp数据库、hapm印数据库、千人基因组数据库及reference：hg19提供的正常对照人群snp数据库，利用soapsnp软件和samtoolspileup软件查找患者基因突变及其他异常。同时应用sift在线预测工具(http://sift.icvi.org/)和polyphen-2软件预测突变对蛋白质功能的影响。
6、结果
测序结果显示患者fⅻ基因第14个外显子存在1个非同义突变a1685g，导致编码的第562位氨基酸由天冬氨酸变为甘氨酸。
实施例3pcr验证
采集3名fⅻ缺乏症合并急性下壁心肌梗死患者、3名家系内正常成员的外周血样本进行验证，所有血样均签署知情同意书，并获得伦理委员会的同意。
1、dna提取步骤同实施例2
2、针对a1685g突变位点所在区域的核苷酸序列设计引物，由上海生工合成。
3、pcr反应
1)配置50μl反应体系
taqdna聚合酶1μl，dntps2μl，正反向引物各2μl，dna模板200ng，10×taqbuffer5μl，mgcl23μl，加水至50μl。
2)反应条件
95℃5min，(95℃30s，62℃30s，72℃30s)×36个循环，72℃7min，4℃保持。
4、dna测序
将获得的pcr扩增产物用qiaquickpcr扩增试剂盒进行纯化，然后进行测序。
5、结果
结果显示，3名患者的fⅻ基因第1685位均存在非同义突变a1685g，对应编码蛋白的氨基酸突变d562g，而在3名家系内正常人中，fⅻ基因第1685位为a，不存在突变。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110>河北医科大学第二医院
<120>一种凝血因子ⅻ的突变体及其应用
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>615
<212>prt
<213>homosapiens
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