一种氧化石墨烯和壳聚糖微球固定双功能酸性脲酶的方法与流程

本发明涉及一种氧化石墨烯和壳聚糖微球固定双功能酸性脲酶的方法，属于酶制剂技术领域。

背景技术：

氨基甲酸乙酯(ec)已被认定为一种致癌物质，具有多位点致癌性和基因毒性被证实广泛存在于发酵食品及酒精饮料中。在发酵酒中，ec主要有乙醇和尿素生成，因此食品和酒中ec和尿素的去除至关重要。

发明人前期通过表达和复性获得了重组双功能酸性脲酶《expressionofanacidureasewithurethanaseactivityine.coliandanalysisofureasegene.[j].molecularbiotechnology,2017,59(2-3):84-97.》，能够降解尿素和ec，在酒精饮料中的酸性环境保持很高的活性，但是此酶的获得率较少，应用环境较为复杂，因此有必要对酶进行固定化，来提高酶的稳定性和回收效率，脲酶的固定化已报道，固定化方法的多种多样，但效率各有差异。

壳聚糖由2-氨基-2-脱氧-β-d-葡萄糖单元以β1,4糖苷键连接而成的二元线型聚合物，壳聚糖是一种天然氨基多糖，具有良好的生物降级性、生物相容性，且无毒副作用，对环境无污染。容易进行化学改造，引入基团使其功能化，以用来固定各种各样的酶。

氧化石墨烯是石墨粉经化学氧化及剥离后的产物，是单一的原子层，可以随时在横向尺寸上扩展到数十微米，经过氧化处理后，氧化石墨仍保持石墨的层状结构，但在每一层的石墨烯单片上引入了许多氧基功能团，这些氧基功能团的引入使得单一的石墨烯结构变得非常复杂，在氧化石墨烯单片上随机分布着羟基和环氧基，而在单片的边缘则引入了羧基和羰基。因此可以作为一种很好地固定化载体。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供一种氧化石墨烯和壳聚糖微球固定双功能酸性脲酶的方法，克服以往的固定材料所固定酶的酶量较少、温度稳定性较差、ph稳定性弱等缺点。

为实现上述目的，本发明提供的固定化方法主要包括以下步骤：

步骤一、首先进行氧化石墨烯(go)的活化，将go在缓冲液中超声分散，然后加入edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)和nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)在上述分散液中，震荡活化；然后将壳聚糖用醋酸溶液活化，按壳聚糖和氧化石墨烯质量比1：(1/3～3)，将壳聚糖和氧化石墨烯载体的溶液混合反应4～12h；

步骤二、通过离心获得氧化石墨烯和壳聚糖的沉淀物，加入戊二醛水溶液交联，交联时间4～12h，去离子水清洗去除为未联物质，收集沉淀物并用冷冻干燥机中-65℃冷冻干燥，得到固定化载体；

步骤三、向氧化石墨烯/壳聚糖交联载体加入双功能酸性脲酶溶液，低温反应1～36h，分离得到记载了酶的载体。

在本发明的一种实施方式中，所述go-cs的戊二醛交联浓度1％～5％。

在本发明的一种实施方式中，所述戊二醛的交联时间4～12h。

在本发明的一种实施方式中，步骤一、称取go0.2g在缓冲液中，超声2h使其分散均匀，然后加入5ml0.5mmedc和5ml0.5mm的nhs在上述分散液中，震荡2h活化，称取0.2g壳聚糖用20ml2.0％的醋酸溶液活化，震荡2h活化。

在本发明的一种实施方式中，步骤二、通过离心获得氧化石墨烯和壳聚糖的沉淀物，按每0.03g沉淀物加入4ml1％～5％(v/v)戊二醛水溶液交联，交联时间4～12h，去离子水清洗去除为未联物质，收集沉淀物，用冷冻干燥机中-65℃冷冻干燥。

在本发明的一种实施方式中，步骤三、向0.03g氧化石墨烯/壳聚糖交联载体加入4ml浓度为1mg/ml(比酶活为2u/mg)的重组双功能酸性脲酶溶液，在4℃反应1～36h，收集固定化酶。

本发明还提供一种应用所得固定化双功能酸性脲酶去除黄酒中ec的方法，是将固定化重组双功能酸性脲酶装填层析柱中，然后让待处理酒样以一定速度流过柱子，使酒样与固定化酶接触，以降解酒样中的ec。

由于采用上述技术方案，本发明与现有技术相比具有如下积极效果：

(1)本发明以氧化石墨烯和壳聚糖为原料，壳聚糖由2-氨基-2-脱氧-β-d-葡萄糖单元以β1,4糖苷键连接而成的二元线型聚合物，壳聚糖是一种天然氨基多糖，具有良好的生物降级性、生物相容性，且无毒副作用，对环境无污染。

(2)氧化石墨烯是单一的原子层，可以随时在横向尺寸上扩展到数十微米，经过氧化处理后，氧化石墨仍保持石墨的层状结构，但在每一层的石墨烯单片上引入了许多氧基功能团，这些氧基功能团的引入使得单一的石墨烯结构变得非常复杂，在氧化石墨烯单片上随机分布着羟基和环氧基，而在单片的边缘则引入了羧基和羰基，不仅提高了交联物的机械强度，还丰富了交联载体的官能团。

(3)氧化石墨烯和壳聚糖交联载体明显提高了酶的固定量，以及ph稳定性和温度稳定性，克服了双功能酸性脲酶的使用的复杂条件，并且提高了酶的使用率，且固定的酶方便装柱，方便了黄酒的处理方式，且对黄酒中挥发性物质影响极小，对尿素和氨基甲酸乙酯去除效果较好。

附图说明

图1氧化石墨烯结构模拟图

图2壳聚糖结构模拟图

图3氧化石墨烯/壳聚糖比例和酶装载量

图44℃下酶所需的固定时间

图5黄酒泵进流过柱子的流速

图6、7固定酶和游离酶的温度稳定性

图8、9固定酶和游离酶的ph稳定性

图10黄酒处理前后挥发性风味物质图谱

具体实施方式

检测方法：

1、酶的固定化反应结束后，离心测定沉淀中的酶活和上清中酶活酶活：用ph4.5的柠檬酸缓冲液配成3％(w/v)的尿素和氨基甲酸乙酯作为底物。采用靛酚蓝比色法测定酶活；固定化酶活的测定方法：固定酶与底物的反应液离心，吸取上清加入靛酚蓝的反应液中测定酶活。

具体地，向一定质量的氧化石墨烯和壳聚糖固定化酶中，加入0.8ml的3％(w/v)的尿素和3％(w/v)ec溶液(由柠檬酸缓冲液配制)中，37℃恒温水浴保温20min后，离心取其上清，上清配成1ml，加入靛蓝反应液buffer1(15g苯酚加入0.625g亚硝基铁氰化钠定容至250ml)和buffer2(13.125g氢氧化钠和7.5ml次氯酸钠定容至250ml)各1ml，37℃恒温水浴保温20min后，用去离子水稀释到25ml，在625nm处测吸光值。

酶活的定义：每分钟分解底物产生1mol氨所需的酶的量为一个酶活单位。

酶活回收率＝固定化酶活/(总酶活-上清中的酶活)x(100％)。

2、采用顶空-固相微萃取-气质连用技术(gc-ms/scan)对黄酒中挥发物质进行检测：在20ml玻璃管中加入8ml黄酒，在其中加入3gnacl使挥发性物质析出，样品用气相色谱-质谱连用仪(gc-ms/scan)测定。

3、采用二乙酰一肟法测尿素浓度：二乙酰在强酸条件下与尿素缩合成红色的4，5-二甲基-2-氧咪唑化合物，颜色深浅与尿素含量成正比。因二乙酰不稳定，故由试剂中二乙酰一肟与强酸作用产生二乙酰，0.02ml待测液中5ml酸性试剂(在三角烧瓶中加去离子水约100ml，然后加入浓硫酸44ml、85％磷酸66ml。冷至室温，加入氨基硫脲50mg及硫酸镉(cdso4·8h2o)2g，溶解后用去离子水稀释至1l)和0.5ml179.9mmol/l二乙酰一肟溶液，混匀，置沸水浴加热12min，取出置冷水中冷却5min，在540nm处读取吸光度。

4、采用气相色谱-质谱联用(gc-ms/sim)对ec进行定量分析：在20ml玻璃管中加入8ml黄酒，再其中加入3gnacl使挥发性物质析出，样品用气相色谱-质谱连用仪(gc-ms/sim)测定。

实施例1

步骤一、首先进行氧化石墨烯的活化，称取go0.2g在缓冲液(20ml50mmph7.0)中超声2h使其分散均匀，然后加入5ml0.5mmedc和5ml0.5mm的nhs在上述分散液中，震荡2h活化，称取0.2g壳聚糖用20ml2.0％的醋酸溶液活化，震荡2h活化。按壳聚糖和氧化石墨烯以质量比1：(1/3～3)，将壳聚糖和氧化石墨烯载体的溶液混合反应4～12h。

步骤二、通过离心获得氧化石墨烯和壳聚糖的沉淀物，按每0.03g沉淀物加入4ml1％～5％(v/v)戊二醛交联，交联时间4～12h，去离子水清洗去除为未交联物质，沉淀物-65℃冷冻干燥。

步骤三、向0.03g氧化石墨烯/壳聚糖交联载体加入4ml比酶活为2u/mg的重组双功能酸性脲酶，放在4℃冰箱反应1～36h，离心测定沉淀中的酶活和上清中酶活，测定酶活回收率。

如图3所示，在上述步骤的基础上，调整氧化石墨烯和壳聚糖的重量比例，然后将制备的氧化石/墨烯壳聚糖交联载体进行酸性脲酶的固定化，测定酶活，计算酶活回收率，得到氧化石墨烯和壳聚糖的重量比例在3/2时，固定化酶活的相对回收率最高，达到74％。

实施例2

步骤一、首先进行氧化石墨烯的活化，称取go0.2g在缓冲液(20ml50mmph7.0)中超声2h使其分散均匀，然后加入5ml0.5mmedc和5ml0.5mm的nhs在上述分散液中，震荡2h活化，称取0.2g壳聚糖用20ml2.0％的醋酸溶液活化,震荡2h活化。按氧化石墨烯和壳聚糖的重量比例3/2，将壳聚糖和氧化石墨烯载体的溶液混合反应4～12h。

步骤二、通过离心获得氧化石墨烯和壳聚糖的沉淀物，按每0.03g沉淀物加入4ml1％～5％(v/v)戊二醛交联，交联时间4～12h，去离子水清洗去除为未交联物质，沉淀物-65℃冷冻干燥。

步骤三、向0.03g氧化石墨烯/壳聚糖交联载体加入4ml比酶活为2u/mg的双功能酸性脲酶，放在4℃冰箱反应1～36h，离心测定沉淀中的酶活和上清中酶活，测定酶活回收率。

对本实施例制备的氧化石/墨烯壳聚糖交联载体进行酸性脲酶的固定化，并对戊二醛的浓度和交联时间进行调整，得出所用交联剂戊二醛的浓度为2.5％、交联时间8h时固定化酶活回收率可达74％±1.6。结果如表1。

表1go-cs反应时间、戊二醛浓度以及交联时间对酶活回收率的影响

实施例3

步骤一、首先进行氧化石墨烯的活化，称取go0.2g在缓冲液(20ml50mmph7.0)中超声2h使其分散均匀，然后加入5ml0.5mmedc和5ml0.5mm的nhs在上述分散液中，震荡2h活化，称取0.2g壳聚糖用20ml2.0％的醋酸溶液活化,震荡2h活化。按壳聚糖和氧化石墨烯以质量比3/2，将壳聚糖和氧化石墨烯载体的溶液混合反应8h。

步骤二、通过离心获得氧化石墨烯和壳聚糖的沉淀物，按每0.03g沉淀物加入4ml2.5％(v/v)戊二醛交联，交联时间8h，去离子水清洗去除为未交联物质，沉淀物-65℃冷冻干燥。

步骤三、向0.03g氧化石墨烯/壳聚糖交联载体加入4ml比酶活为2u/mg的双功能酸性脲酶，放在4℃冰箱反应1～36h，离心测定沉淀中的酶活和上清中酶活，测定酶活回收率。

对本实施例制备的氧化石/墨烯壳聚糖交联载体进行酸性脲酶的固定化，测得固定化酶在4℃与氧化石墨烯和壳聚糖的反应时间20h以后酶活相对回收率可达74％以上。结果如图4。

实施例4

将固定化双功能酸性脲酶装填层析柱中，测尿素时在市售黄酒中加入25mg/l尿素，测ec时在市售黄酒中加入100μg/l的ec，然后让样品黄酒流过柱子，在3x12cm的柱子中装10iu以上酶活的固定化酶，然后将酒液以流速1-3ml/min流速过柱子。先测定过柱子以后对黄酒成分的影响，采用顶空-固相微萃取-气质连用技术对黄酒中挥发物质经行检测。采用二乙酰一肟法测尿素浓度，用气相色谱-质谱联用对ec进行定量分析。

对本实施例制备的氧化石/墨烯壳聚糖交联载体固定化酸性脲酶进行应用，泵黄酒流过柱子的流速在0-0.6ml/min，固定酶与底物反应较为充分，尿素和ec去除效果较好。结果如图5，随着流速增加尿素和ec的去除效果明显降低，流速需要控制在0.6ml/min以下。

图10表明：处理前后挥发性风味的变化微小，对黄酒的风味基本不会造成影响。

实施例5

称取相同湿重的固定化载体壳聚糖、氧化石墨烯、氧化石墨烯和壳聚糖复合物，每g载体中加入100ml1mg/ml的双功能酸性脲酶在最优条件下进行酶的固定反应，测定未结合蛋白含量。

蛋白质加载量＝((总蛋白量-未结合蛋白量)/载体质量)x100

对本实施例三种载体的酶加载量进行比较，发现在每g相同湿重的不同载体中，氧化石墨烯和壳聚糖复合物的酶加载量最高，每g可以达到51±2.7mg。如表2。这可能是由于氧化石墨烯和壳聚糖复合物较壳聚糖和氧化石墨烯所含功能基团较多。

表2

实施例6

对采用本发明方法制备得到的go-cs-酸性脲酶的酶学性质进行分析，分别将固定酶和游离酶在ph2～7和水浴温度15～85℃下测定酶活，分析酶对ph稳定性和温度稳定性。结果表明，固定化酶活在15～85℃略高于游离酶，尤其温度在40℃以后，如图6、7；在ph2～7下略高于游离酶，如图8、9。说明氧化石墨烯和壳聚糖具有一定机械强度和柔韧性，能够在复杂环境中保持酶的稳定性。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。