一种提取酱类产品中微生物宏基因组的方法与流程

本发明涉及一种提取酱类产品中微生物宏基因组的方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术：

酱类产品，如沙拉酱、榴莲酱、芥末酱等，是我们生活中常用的调味品。随着经济发展，人民生活水平的提高，我们对食物的味道要求更高，酱类产品成为日常生活中重要的调味品。日常生活中，市面上销售的酱类产品(例如沙拉酱、榴莲酱、芥末酱等)主要是植物油、鸡蛋、白砂糖、再加上调味料等调制而成。市售酱类产品保质期短，并且在保质期内还经常会发生胀袋等变质现象。这些现象主要是由产品中的某些微生物大量生长繁殖造成的。

为了找出导致酱类产品变质的微生物，通常采用微生物的分离和筛选技术，然而，传统的实验室分离培养技术有一定局限性，因为许多微生物是不可培养的，无法通过传统的分离和筛选手段有效获得目的微生物。随着宏基因组测序技术的发展，可以快速方便的鉴定出产品中微生物的多样性，以便分析导致变质的微生物。

宏基因组测序需要符合测定要求的质和量的dna，但由于酱类产品通常是质地浓厚粘稠，从酱类产品中提取微生物的总dna存在以下两个难点。首先，酱类产品主要就是大量油和蛋打发乳化形成的粘度大、质地厚重的膏状物质，在提取过程中不易混匀和分离。第二，酱类产品生物量少，且都被包裹在粘稠的酱中不易分离出来。

目前，已经有许多方法讲述了如何从混合物(如土壤、酱油)中提取微生物宏基因组，但现有的方法要么适用于生物量大的样品，要么价格昂贵，也没有适用于酱类产品的检测试剂盒。因此，建立一种经济而又实用的高效提取酱类产品微生物宏基因组的方法显得尤为必要。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种从酱类产品提取宏基因组的方法，该方法通用、高效、简便，解决了现有技术难以从粘度高、生物量小的样品中提取宏基因组的问题。

本发明的第一个目的是提供一种从酱类产品提取宏基因组的方法，将酱类产品和无菌氯化钠溶液混合进行破乳化，再进行基因组dna的提取。

在本发明的一种实施方式中，所述氯化钠溶液经过灭菌处理。

在本发明的一种实施方式中，所述氯化钠溶液的浓度为60～260g/l。

在本发明的一种实施方式中，所述氯化钠溶液的浓度为160～260g/l。

本发明提供从酱类产品中提取微生物宏基因组的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将酱类样品与氯化钠溶液，按质量体积比为1g：(1-2)ml，漩涡震荡混匀1～5min；

(2)将步骤1得到的混合液，在60～65℃加热超声0.5～1.5h；

(3)将通过步骤1和2去乳化后的混合液与提前在60～65℃下预热的抽提液按体积比1：1.5～3混合，加入适量无菌石英砂混匀；

(4)配平后，机械破碎法震荡1～2min，重复3～4次，室温8000～10000r/min离心8～15min中后取上清；

(5)上清加2～3倍体积的体积比为24～25：24～25：1的苯酚-氯仿-异戊醇混合溶液，摇匀，8000～10000r/min离心15～25min，取上清；

(6)清中加1～2倍体积高盐溶液，摇匀；

(7)用吸附柱过滤，直至滤完；

(8)用体积分数为60～75％的乙醇洗脱，重复两次；

(9)8000～10000r/min空离2～5min，弃滤液；

(10)60～65℃下烘3～5min，用无菌ddh20洗脱，离心，收集所得离心液，即得基因组。

在本发明的一种实施方式中，所述高盐溶液含有4mol/l盐酸胍和0.5mol/l乙酸钾(即382.12g盐酸胍、49.07g乙酸钾溶于1l水中)。

在本发明的一种实施方式中，所述抽提液含有20g/l溴化十六烷三甲基铵(ctab)81.82g/lnacl，0.01mol/ltris-hcl和20mol/ledta。

在本发明的一种实施方式中，所述抽提液含有20g/l溴化十六烷三甲基铵(ctab)81.82g/lnacl，0.01mol/ltris-hcl和20mol/ledta。

在本发明的一种实施方式中，所述方法具体是：

(1)将酱类样品与氯化钠溶液，按质量体积比为1g：(1-2)ml，漩涡震荡混匀2min；

(2)将步骤1得到的混合液，加热超声1h；

(3)将通过步骤1和2去乳化后的混合液与提前在65℃下预热的抽提液按体积比1：2混合，加入适量无菌石英砂混匀；

(4)配平后，机械破碎法震荡1min，重复4次，室温10000r/min离心10min中后取上清；

(5)加2倍体积的体积比为25：24：1的苯酚-氯仿-异戊醇混合溶液，摇匀，10000r/min离20min，取上清；

(6)清中加2倍体积高盐溶液，摇匀；

(7)用15ml吸附柱过滤，直至滤完；

(8)吸附柱中加5ml70％乙醇洗脱，重复两次；

(9)10000r/min空离2min，弃滤液；

(10)65℃下烘5min，加100μl无菌ddh20，离心，收集所得离心液，即得基因组。

本发明的第二个目的是提供一种适用于酱类产品的dna提取试剂盒，所述试剂盒用于实施从酱类产品提取宏基因组dna的方法；所述试剂盒含有多个容器，所述容器中分别装有浓度为60～260g/l的nacl溶液、抽提液、洗涤液和洗脱液。

在本发明的一种实施方式中，所述抽提液含有溴化十六烷三甲基铵、nacl、tris-hcl和edta。

在本发明的一种实施方式中，所述洗涤液含有乙醇。

在本发明的一种实施方式中，所述洗涤液含有体积分数为50～80％乙醇。

在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒还含有体积比为25：24：1的苯酚-氯仿-异戊醇的混合溶液。

在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒还含有玻璃珠、磁珠、石英砂中的至少一种。

在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒还含有裂解液。

在本发明的一种实施方式中，所述裂解液中含有10～100u/ml的溶菌酶。

本发明还提供所述方法在食品、生物、化工领域的应用。

本发明有益效果是：本发明是一种从酱类产品提取微生物宏基因组的方法，提取之前先加入了盐溶液溶液并且加热超声处理，破乳化之后，再进行提取，有利于最大限度减小膏状样品对后面提取分离的影响，并且使样品中微生物最大限度的释放到抽提液中，提高生物量；苯酚：氯仿：异戊醇按一定比例配合使用有利于弥补单独使用的不足，苯酚使蛋白质变性，同时抑制了dnase的降解作用，但缺点是能溶解10-15％的水，从而溶解一部分poly(a)rna且不能完全抑制rnase的活性，而氯仿不但能克服酚的缺点，而且加速有机相与液相分层，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含dna的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。本发明提取到的宏基因组纯度比传统方法提高了7～9倍，分子大小足够满足后续实验的需要，且从操作上来说，本方法简单容易实行，所需试剂都比较普通，能够节省实验室经济成本。

附图说明

图1为实验组和对照组16srdnav4区pcr扩增产物电泳图；其中，m为100bpladder，阴为阴性对照，泳道1为实施例1从芥末酱中提取的宏基因组pcr扩增产物；泳道5为实施例2从榴莲酱中提取的宏基因组pcr扩增产物；泳道7为实施例3从沙拉酱中提取的宏基因组pcr扩增产物；泳道2为对比例1从芥末酱中提取的宏基因组pcr扩增产物，泳道3为对比例2从榴莲酱中提取的宏基因组pcr扩增产物为对比例3从沙拉酱中提取的宏基因组pcr扩增产物；

图2为实验组和对照组真菌its1区pcr扩增区产物电泳图；注：图中m为100bpladder，阴为阴性对照；泳道1为实施例1从芥末酱中提取的宏基因组pcr扩增产物；泳道2为实施例2从榴莲酱中提取的宏基因组pcr扩增产物；泳道3为实施例3从沙拉酱中提取的宏基因组pcr扩增产物；泳道4为对比例1从芥末酱中提取的宏基因组pcr扩增产物；泳道5为对比例2从榴莲酱中提取的宏基因组pcr扩增产物；泳道6为对比例3从沙拉酱中提取的宏基因组pcr扩增产物。

具体实施方式

本发明所用的15ml吸附柱购于上海生工；本发明涉及的抽提液、苯酚：氯仿：异丙醇溶液、氯化钠溶液，高盐溶液、70％的乙醇都是实验室试剂自行配制。

试剂配制：

氯化钠溶液：6～36gnacl溶于100ml水中，灭菌；

高盐溶液：4m盐酸胍和0.5m乙酸钾(ph5.0)溶于1l水中，灭菌；

抽提液：准确称取4gctab(溴化十六烷三甲基铵)和16.364gnacl，并添加20ml的1mol/ltris-hcl和8ml的0.5mol/ledta搅拌溶解，最后用水定容到200ml。

苯酚：氯仿：异丙醇溶液的体积比为25：24：1

实施例1

芥末酱中微生物宏基因组的提取，具体步骤如下所示：

1)称取7.5g芥末酱加入50ml离心管，加入7.5ml16％的氯化钠溶液，漩涡震荡混匀2min。

2)将步骤1得到的混合液，加热超声1h.

3)再加入20ml提前在65℃下预热的抽提液，并且加入18.5g灭过菌的石英砂混匀。

4)配平后，机械破碎法震荡1min，重复4次，室温10000r/min离心10min中后取上清。

5)转移上清到新的离心管，加2倍体积的苯酚-氯仿-异戊醇混合溶液，摇匀，10000r/min离20min，取上清。

6)转移上清到新的离心管，加2倍体积高盐溶液，摇匀。

7)用15ml吸附柱过滤，直至滤完。

8)吸附柱中加5ml70％乙醇洗脱，重复两次

9)10000r/min空离2min，弃滤液；所述空离是不向吸附柱中加入溶液直接离心，以更大程度地去除膜上残留的溶液；

10)65℃下烘5min，加100μl无菌ddh20，离心，收集所得离心液，即得基因组。

实施例2

榴莲酱中微生物宏基因组的提取，具体步骤如下所示：

1)称取7.5g榴莲酱加入50ml离心管，加入7.5ml16％的氯化钠溶液，漩涡震荡混匀2min。

2)将步骤1得到的混合液，加热超声1h.

3)再加入20ml提前在65℃下预热的抽提液，并且加入18.5g灭过菌的石英砂混匀。

4)配平后，机械破碎法震荡1min，重复4次，室温10000r/min离心10min中后取上清。

5)转移上清到新的离心管，加2倍体积的苯酚-氯仿-异戊醇混合溶液，摇匀，10000r/min离20min，取上清。

6)转移上清到新的离心管，加2倍体积高盐溶液，摇匀。

7)用15ml吸附柱过滤，直至滤完。

8)吸附柱中加5ml70％乙醇洗脱，重复两次

9)10000r/min空离2min，弃滤液

10)65℃下烘5min，加100微升无菌ddh20，离心，收集所得离心液，即得基因组。

实施例3

沙拉酱中微生物宏基因组的提取，具体步骤如下所示：

1)称取7.5g沙拉酱加入50ml离心管，加入7.5ml16％的氯化钠溶液，漩涡震荡混匀2min。

2)将步骤1得到的混合液，加热超声1h.

3)再加入20ml提前在65℃下预热的抽提液，并且加入18.5g灭过菌的石英砂混匀。

4)配平后，机械破碎法震荡1min，重复4次，室温10000r/min离心10min中后取上清。

5)转移上清到新的离心管，加2倍体积的苯酚-氯仿-异戊醇混合溶液，摇匀，10000r/min离20min，取上清。

6)转移上清到新的离心管，加2倍体积高盐溶液，摇匀。

7)用15ml吸附柱过滤，直至滤完。

8)吸附柱中加5ml70％乙醇洗脱，重复两次

9)10000r/min空离2min，弃滤液

10)65℃下烘5min，加100微升无菌ddh20，离心，收集所得离心液，即得基因组。

对比例1

称取称取7.5g芥末酱，采用常规的catb法,对样品的宏基因组进行提取,常规的catb法与实施例1的区别在于，没有进行nacl破乳化，而是用等量的水稀释。

对比例2

称取称取7.5g榴莲酱，采用常规的catb法对样品的宏基因组进行提取,常规的catb法与实施例2的区别在于，没有进行nacl破乳化，而是用等量的水稀释。

对比例3

称取称取7.5g沙拉酱，采用常规的catb法对样品的宏基因组进行提取，常规的catb法与实施例3的区别在于，没有进行nacl破乳化，而是用等量的水稀释。

实施例4

实施例1～3及对比例1～3提取的基因组质量鉴定

将提取所得的dna用nanodrop2000测定浓度，本发明(实例1～3)与常规方法(对比例1～3)提取酱类产品微生物宏基因组的效果分别如表1所示。从表可以看出按照本发明方法提取的浓度高于常规方法提取所得基因组浓度，可满足测序等分子生物学操作的浓度要求，其次a260/a280的比值均位于1.8～2.0范围内，说明本发明提取所得纯度高，表明本发明提取酱类微生物宏基因组提取率高且提取提取效果良好。

表1两种方法提取酱类宏基因组比较

实施例5

分别以实施例1、2、3以及对比例1、2、3所提的宏基因组为模板进行16srdnav4区和its1区pcr扩增，并进行琼脂糖凝胶电泳验证。结果如图1和2所示。

细菌16srdnav4区引物：

515f：gtgccagcmgccgcggtaa

806r：ggactachvgggtwtctaat

真菌its1区引物：

its5-1737f：ggaagtaaaagtcgtaacaagg

its2-2043r：gctgcgttcttcatcgatgc

凝胶电泳条件：胶浓度：2％；电压：100v；电泳时间：20min；

图1～2显示，实例组扩增产物条带单一、长度符合预期值且条带比对比例组亮，说明过程特异性高、扩增效果好，满足后续分子生物学研究使用，该结果进一步论证了本发明达到了理想的技术效果。

实施例7

具体实施方式同实施例1，区别在于，氯化钠溶液的浓度分别为50～360g/l。

表2不同浓度氯化钠溶液对提取效果的影响

如表所示，以实施例1中的芥末酱为样品，用不同浓度氯化钠破乳化，提宏基因组，随着氯化钠浓度的增加，提取效果越好，当氯化钠浓度达到16％以后，提取效果变化不大，浓度超过26％甚至达到36％时氯化钠达到饱和。因此，以浓度为16％的氯化钠破乳化，效果最好。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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<110>珠海天禾食品有限公司，江南大学

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