本发明涉及基因检测技术领域，具体来说，涉及一种人脊髓性肌萎缩症致病基因拷贝数检测荧光定量pcr试剂盒。
背景技术：
脊髓性肌萎缩症(spinalmuscularatrophy，sma)是一组较为常见的常染色体隐性遗传病，是由于脊髓前角细胞运动神经元退化变性所导致的神经肌肉疾病。临床表现为进行性、对称性肌无力、肌萎缩和瘫痪。新生儿发病率为1/6000～1/10000，在正常人群中致病基因携带者的发生率为1/40～1/80。sma为致死性疾病，神经肌肉疾病病情严重，目前临床上无有效治疗手段。脊髓性肌萎缩症国际协会根据sma患者的发病年龄和临床表现分为4型：
ⅰ型(又称werding-hoffman病)是最严重的亚型(重型)，约占sma患者的一半，发病急、进展快，一般在出生6个月之内发病，表现为严重的全身肌无力和肌张力降低，不能独坐或走，多于2岁内死于呼吸肌麻痹；ii型为慢性婴儿型(中间型)，出生后6～18个月间发病，患儿可独坐，但不能独立站立和行走，大多能存活2年以上；iii型(又称kugelberg-welander病)为青少年型(轻型)，出生18个月后才发病，病情发展缓慢，多数仅表现有肌力弱，可以保持独立行走和站立的能力，一般在成年后死亡。ⅳ型则为成年型(极轻型)，一般于20～30岁以后发病，主要表现为缓慢逐渐发生的上下肢近端无力和肌肉萎缩，成年期都能够行走。
研究发现，定位于染色体5q11.2～13.3区域的运动神经元存活基因(survivalmotorneurongene，smn)是sma发病的决定性基因。smn基因全长20kb，含8个外显子，其转录产物约1700bp，编码294个氨基酸。该基因在5号染色体上有2种拷贝，在端粒侧的称为smn1，在着丝粒侧的称smn2，两者间具有高度的同源性，仅有5个碱基的差异分别位于第7、8外显子和第6、7内含子中。sma发病主要是由于smn1基因发生缺失、点突变等基因异常所致。研究表明，smn1基因是sma的致病基因，大多数(90.0％以上)sma患者有smn1基因第7和(或)第8外显子的纯合缺失突变；而smn2基因是sma症状轻重的调节基因，其拷贝数与sma病情的严重程度有关，轻型sma患者通常比重型sma具有更多的smn2拷贝数，即smn2能在一定程度上弥补smn1缺失所造成的功能缺陷。由于sma属于染色体隐性遗传病，若夫妻皆为sma致病基因携带者，则胎儿无论男女皆有1/4的概率为sma患者，1/2的概率为sma致病基因携带者，另1/4的概率为正常。因此，筛查具有sma家族病史者的sma致病基因存在状态，对夫妻双方均为sma致病基因携带者的胎儿进行产前诊断，对于预防sma患儿出生、推进优生优育、提高人口素质具有重要意义。
临床上对sma的辅助分子检测，目前常用的方法有聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性法，即pcr-rflp法。该方法利用smn1基因和smn2基因在第7和第8外显子上2个碱基差别区分smn1和smn2，检测smn1外显子7，8的纯合缺失确定sma诊断。但该方法无法对smn1基因杂合缺失进行检测，不能区分sma携带者和正常人及杂合缺失smn1基因的sma患者。
另一常用的方法是多重连接探针扩增技术，即mpla法。2002年荷兰的schouten等设计发明了mlpa技术，该技术是一种高通量、针对待测核酸中靶序列进行定性和定量分析的新技术，仅需少量的dna，即可通过变性、杂交、连接、pcr扩增及毛细管电泳步骤，在同一反应管中对几十个不同的靶基因进行检测和定量分析。与以往的检测技术相比，该技术可对待检测基因的所有外显子进行缺失、重复等异常改变进行全面检测。虽然mlpa法能够检测到smn1基因的纯合突变和杂合突变，但是该方法学实验步骤较为繁琐，操作过程中容易出现失误导致实验失败。而且该方法学要在pcr反应结束后，开管对pcr产物进行后处理，在操作过程中易发生实验室污染。目前mlpa法进行sma的分子检测，多采用荷兰mrc公司的mlpa检测试剂盒，该方法试剂成本较高，需要特定的分析仪器(基因测序仪，价格昂贵)，耗时长(从dna提取完成到数据分析得到结果至少需要2个工作日)，难以在临床上进行大规模人群筛查和技术推广。
近年来，已有学者在研究基于实时荧光定量聚合酶链式反应技术的sma检测方法，即real-timepcr法。real-timepcr法可有效应用于sma致病基因拷贝数检测，其最大优点是可对基因拷贝数进行定量分析，且实验过程操作简便快捷，可有效避免pcr产物遗留污染。然而对目前采用real-timepcr技术进行sma检测的一些文献进行分析发现，这些技术均大部分是基于smn1与smn2基因间的有限核苷酸差异(第7外显子与第8外显子各有一个核苷酸的差异)，采用传统的扩增阻抗原理设计相应的引物与探针。以第7外显子为例，即将smn1基因与smn2的差异碱基置于pcr引物3’端最后一位(smn1第7外显子为c，smn2第7外显子为t)，而检测探针采用smn1与smn2公用探针。然而，研究表明，这样的设计并不足以有效区别smn1第7外显子和smn2第7外显子。从而使对smn1或smn2基因拷贝数的相对定量出现偏差，影响其结果的临床参考价值。real-timepcr法的另一设计策略是，依据smn1与smn2的差异碱基(如第7外显子的c和t、第8外显子的g和a)，在差异碱基位置设计特异性的探针，但这一设计无法避免的是smn1与smn2的pcr扩增引物将是公用的。大样本的研究表明，在携带者群体中，smn2基因拷贝数可多达4个以上，对于只有1个拷贝smn1的携带者而言，当smn1与smn2采用公用引物进行扩增时，将无法避免多拷贝smn2基因优势扩增对单拷贝smn1基因的影响(因为此时二者的pcr引物相同)，同样会导致相对定量结果的偏差。
随着以降低sma患儿出生率为目标的预防计划与措施的相继实施，以及sma发病分子机制及分子流行病学的深入研究，开发准确可靠、简单实用、能够实现自动化和标准化、适合大规模人群筛查和常规分子诊断的快速检测smn1基因拷贝数，从而确诊sma的新型分子诊断试剂盒为当前迫切之需。
针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。
技术实现要素：
针对相关技术中的上述技术问题，本发针对目前人运动神经元基因拷贝数定量检测方法存在的问题与不足，提供一种检测快速、简便，检测结果可靠的用于人类脊髓性肌萎缩症致病基因拷贝数检测的荧光定量pcr试剂盒。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种人脊髓性肌萎缩症致病基因拷贝数检测荧光定量pcr试剂盒，包括扩增引物和荧光探针，所述的扩增引物为，一对特异性扩增smn1和smn2基因第7外显子的共用引物、一对特异性扩增smn1和smn2基因第8外显子的共用引物、一对特异性扩增内参基因cftr基因的特异性引物；所述的荧光探针为，特异性检测smn1基因第7外显子的荧光探针、特异性检测smn1基因第8外显子的荧光探针、特异性检测smn2基因第7外显子的荧光探针、特异性检测smn2基因第8外显子的荧光探针、特异性检测内参基因cftr基因的荧光探针；其中，
所述的一对特异性扩增smn1和smn2基因第7外显子的共用引物中，上游引物smn-ex7-f和下游引物smn-ex7-r序列分别如seqno.1和seqno.2所示；
所述的一对特异性扩增smn1和smn2基因第8外显子的共用引物中，上游引物smn-ex8-f和下游引物smn-ex8-r序列分别如seqno.3和seqno.4所示；
所述的一对特异性扩增内参基因cftr基因的引物中，上游引物cftr-f和下游引物cftr-r序列分别如seqno.5和seqno.6所示；
所述的特异性检测smn1基因第7外显子的荧光探针smn1-ex7-p的序列如seqno.7所示；
所述的特异性检测smn1基因第8外显子的荧光探针smn1-ex8-p的序列如seqno.8所示；
所述的特异性检测smn2基因第7外显子的荧光探针smn2-ex7-p的序列如seqno.10所示；
所述的特异性检测smn2基因第8外显子的荧光探针smn2-ex8-p的序列如seqno.11所示；
所述的特异性检测内参基因cftr基因的荧光探针cftr-p的序列如seqno.9所示。
进一步地，
所述的特异性检测smn1基因第7外显子的荧光探针smn1-ex7-p，其5’端的荧光基团为fam，3’端的荧光淬灭基团为mgb-nfq；
所述的特异性检测smn1基因第8外显子的荧光探针smn1-ex8-p，其5’端的荧光基团为fam，3’端的荧光淬灭基团为mgb-nfq；
所述的特异性检测smn2基因第7外显子的荧光探针smn2-ex7-p，其5’端的荧光基团为ned，其3’端的荧光淬灭基团为mgb-nfq；
所述的特异性检测smn2基因第8外显子的荧光探针smn2-ex8-p，其5’端的荧光基团为ned，其3’端的荧光淬灭基团为mgb-nfq；
所述的特异性检测内参基因cftr基因的荧光探针cftr-p，其5’端的荧光基团为vic，3’端的荧光淬灭基团为mgb-nfq。
进一步地，所述试剂盒还包括pcr反应试剂、smn1基因0拷贝质控品、smn1基因1拷贝质控品、smn2基因0拷贝质控品和smn2基因1拷贝质控品。
进一步地，所述pcr反应试剂包括：pcr反应缓冲液、dntps、氯化镁、dna聚合酶、ung酶。
进一步地，所述smn1基因1拷贝质控品为含2拷贝cftr基因序列与1拷贝smn1基因序列的质粒dna溶液；所述所述smn2基因1拷贝质控品为含2拷贝cftr基因序列与1拷贝smn2基因序列的质粒dna溶液。
进一步地，所述smn1基因0拷贝质控品为含cftr基因与smn1基因第7、第8外显子完全缺失的基因质粒dna溶液；所述smn2基因0拷贝质控品为含cftr基因与smn2基因第7、第8外显子完全缺失的基因质粒dna溶液
本发明的另一方面，提供了一种人脊髓性肌萎缩症致病基因拷贝数检测方法，包括如下步骤：
s1.准备受验dna样本：提取受验人细胞基因组dna，进行紫外分光定量，满足od260nm/od280nm的比值在1.8-2.0之间的作为样本dna模板；
s2.准备对照品：将smn1/smn2基因1拷贝质控品分别建立1:2:4三个浓度梯度备用，smn1/smn2基因0拷贝质控品不做梯度稀释，去离子水替代dna作为空白对照，共计5组对照；
s3.smn1/smn2基因第7外显子反应：样本dna模板、smn1/smn2基因第7外显子引物探针组合物和pcr反应试剂混合形成pcr反应体系进行pcr扩增反应，其中，所述smn1/smn2基因第7外显子引物探针组合物包括smn-ex7-f、smn-ex7-r、cftr-f、cftr-r、smn1-ex7-p/smn2-ex7-p及cftr-p，序列分别如seqno.1、seqno.2、seqno.5、seqno.6、seqno.7/seqno.10、seqno.9所示；
s4.smn1/smn2基因第8外显子反应：样本dna模板、smn1/smn2基因第8外显子引物探针组合物和pcr反应试剂混合形成pcr反应体系进行pcr扩增反应，其中，所述smn1/smn2基因第8外显子引物探针组合物包括smn-ex8-f、smn-ex8-r、cftr-f、cftr-r、smn1-ex8-p/smn2-ex8-p及cftr-p，序列分别如seqno.3、seqno.4、seqno.5、seqno.6、seqno.8/seqno.11、seqno.9所示；
s5.smn1/smn2基因第7外显子反应对照反应：将步骤s3中的pcr反应体系中的样本dna模板替换为相同体积的步骤2中准备的对照品，进行pcr扩增反应；
s6.smn1/smn2基因第8外显子反应对照反应：将步骤s4中的pcr反应体系中的样本dna模板替换为相同体积的步骤2中准备的对照品，进行pcr扩增反应；
s7.结果分析：对实时荧光pcr检测得到的数据进行分析，计算smn1/smn2基因拷贝数，从而判别所述基因样本是否来源于脊髓性肌萎缩症基因携带者。
进一步地，所述步骤s3中的pcr反应体系为，
pcr反应试剂：10μl，
smn1/smn2基因第7外显子引物探针组合物：3μl，
样本dna模板：4μl，
去离子水：3μl；
所述步骤s4中的pcr反应体系为，
pcr反应试剂：10μl，
smn1/smn2基因第8外显子引物探针组合物：3μl，
样本dna模板：4μl，
去离子水：3μl。
进一步地，所述步骤s3和所述步骤s4中的pcr反应包括如下反应：ung消化，变性反应和pcr循环扩增反应。
进一步地，所述ung消化的条件为，温度为37-50℃，时间为2-5min；所述变性反应条件为，温度为92-97℃，时间为5-10min；所述pcr循环扩增反应条件为，温度为92-97℃，时间5-20s变性，温度为56-62℃，时间为20-60s退火和延伸，共40个循环，每一循环实时采集fam和vic荧光信号。
本发明的有益效果：本发明的人脊髓性肌萎缩症致病基因拷贝数检测荧光定量pcr试剂盒利用荧光定量pcr技术在检测smn1基因拷贝数时，能够有效避免smn2基因拷贝数的干扰。本发明设计高度特异性的引物和荧光标记的taqman-mgb探针。使用fam信号标记smn1基因第7外显子探针，使用ned信号标记smn2基因第7外显子探针。由于smn1基因第7外显子探针smn1-ex7-p和smn2基因第7外显子探针smn2-ex7-p在序列上仅有1个碱基的差异，因此二者能够通过相互的竞争性抑制作用，消除smn1-ex7-p探针与smn2基因第7外显子结合而产生的干扰荧光信号，以及smn2-ex7-p探针与smn1基因第7外显子结合而产生的干扰荧光信号。依据与smn1第7外显子检测引物探针相似的设计策略，使用fam信号标记smn1基因第8外显子探针，使用ned信号标记smn2基因第8外显子探针。由于smn1基因第8外显子探针smn1-ex8-p和smn2基因第8外显子探针smn2-ex8-p在序列上仅有1个碱基的差异，因此二者能够通过相互的竞争性抑制作用，消除smn1-ex8-p探针与smn2基因第8外显子结合而产生的干扰荧光信号，以及smn2-ex8-p探针与smn1基因第8外显子结合而产生的干扰荧光信号，有效防止假阴性和假阳性的存在。
具体实施方式
下面将结合具体实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，实施例中所涉及的各种试剂及仪器设备均为本领域常用试剂和仪器设备，未经特殊说明均可从商业途径获得。
实施例一：试剂盒的组成
1.特异性扩增smn1和smn2基因第7外显子的共用引物：
上游引物smn-ex7-f；
下游引物smn-ex7-r。
2.特异性扩增smn1和smn2基因第8外显子的共用引物：
上游引物smn-ex8-f；
下游引物smn-ex8-r。
3.内参基因cftr的pcr扩增引物：
上游引物cftr-f，
下游引物cftr-r。
4.检测smn1基因第7外显子的探针：smn1-ex7-p。
5.检测smn1基因第8外显子的探针：smn1-ex8-p。
6.检测smn2基因第7外显子的探针：smn2-ex7-p。
7.检测smn2基因第8外显子的探针：smn2-ex8-p。
8.检测内参基因cftr的探针：cftr-p。
9.pcr反应试剂包括：
pcr反应缓冲液；
dntps；
氯化镁；
extaqdna聚合酶；
ung酶。
10.荧光染料：rox背景荧光染料。
11.smn1基因0拷贝质控品，smn2基因0拷贝质控品。
12.smn1基因1拷贝质控品，smn2基因1拷贝质控品。
13.去离子水。
其中smn1基因1拷贝质控品为含2拷贝cftr基因与1拷贝smn1基因质粒dna溶液，smn2基因1拷贝质控品为含2拷贝cftr基因与1拷贝smn2基因质粒dna溶液；smn1基因0拷贝质控品为含cftr基因与smn1基因第7、第8外显子完全缺失的基因质粒dna溶液，smn2基因0拷贝质控品为含cftr基因与smn2基因第7、第8外显子完全缺失的基因质粒dna溶液；去离子水为经过高温灭菌的去离子水。
实施例二：基因组dna制备
按医疗常规操作采集人外周静脉血1ml，加入edta抗凝。采用qiagen公司的人外周血基因组抽提试剂盒抽提基因组dna，洗脱体积为100μl，采用紫外分光定量仪定量，od260nm/od280nm的比值应在1.8-2.0之间，使用去离子水稀释基因组dna浓度至10-20ng/μl。
实施例三：对照品梯度稀释
smn1基因对照品准备：将smn1基因1拷贝质控品分别建立1:2:4三个浓度梯度备用，smn1基因0拷贝质控品不做梯度稀释，去离子水替代dna作为空白对照，一共准备5组对照。
smn2基因对照品准备：将smn2基因1拷贝质控品分别建立1:2:4三个浓度梯度备用，smn2基因0拷贝质控品不做梯度稀释，去离子水替代dna作为空白对照，一共准备5组对照。
将smn1基因1拷贝质控品1:2:4三个浓度梯度建立方法为，取100μlsmn1基因1拷贝对照品加入到1.5ml离心管中，再加入去离子水100μl，混匀后得到2倍稀释对照品；从2倍稀释对照品溶液中，取出100μl，加入至1只新的1.5ml离心管，再加入去离子水100μl，混匀后得到4倍稀释对照品。
将smn2基因1拷贝质控品1:2:4三个浓度梯度建立方法为，取100μlsmn2基因1拷贝对照品加入到1.5ml离心管中，再加入去离子水100μl，混匀后得到2倍稀释对照品；从2倍稀释对照品溶液中，取出100μl，加入至1只新的1.5ml离心管，再加入去离子水100μl，混匀后得到4倍稀释对照品。
实施例四：pcr反应体系配制
按以下体系配制pcr反应体系：
smn1第7外显子反应体系(总反应体系为20μl)：
pcr反应试剂：10μl；
smn1基因第7外显子引物探针组合物(smn-ex7-f、smn-ex7-r、cftr-f、cftr-r、smn1-ex7-p及cftr-p)：3μl；
样本dna模板：4μl；
去离子水：3μl。
smn1第8外显子反应体系(总反应体系为20μl)：
pcr反应试剂：10μl；
smn1基因第8外显子引物探针组合物(smn-ex8-f、smn-ex8-r、cftr-f、cftr-r、smn1-ex8-p及cftr-p)：3μl；
样本dna模板：4μl；
去离子水：3μl。
smn2第7外显子反应体系(总反应体系为20μl)：
pcr反应试剂：10μl；
smn2基因第7外显子引物探针组合物(smn-ex7-f、smn-ex7-r、cftr-f、cftr-r、smn2-ex7-p及cftr-p)：3μl；
样本dna模板：4μl；
去离子水：3μl。
smn2第8外显子反应体系(总反应体系为20μl)：
pcr反应试剂：10μl；
smn2基因第8外显子引物探针组合物(smn-ex8-f、smn-ex8-r、cftr-f、cftr-r、smn2-ex8-p及cftr-p)：3μl；
样本dna模板：4μl；
去离子水：3μl。
对于smn1基因对照反应的pcr反应体系，分别取1:2:4三个浓度梯度的smn1基因1拷贝质控品和smn1基因0拷贝质控品4μl替换样本dna模板；空白对照反应采用4ul去离子水替换样本dna模板，其他成分与上述smn1第7外显子反应体系和smn1第8外显子反应体系一致。
对于smn2基因对照反应的pcr反应体系，分别取1:2:4三个浓度梯度的smn2基因1拷贝质控品和smn2基因0拷贝质控品4μl替换样本dna模板；空白对照反应采用4ul去离子水替换样本dna模板，其他成分与上述smn2第7外显子反应体系和smn1第8外显子反应体系一致。
实施例五：pcr反应
采用abisteponeplus实时荧光pcr仪进行pcr反应。pcr反应在多通道实时荧光pcr仪上进行，每一循环实时采集fam和vic荧光信号。本发明采用含u(尿嘧啶)体系，ung可以消除产物带来的污染。pcr扩增条件如表1所示：
表1.pcr反应扩增条件
实施例六：结果分析
6.1检验结果分析要求
检验结果应满足以下条件：
a)空白对照反应在任一检验通道ct值35之前无信号。若信号升起，且ct值＜35，则此次实验结果无效，建议重新实验。
b)smn1基因1拷贝对照品的最小梯度的目的基因和内标基因的ct值≤28；smn2基因1拷贝对照品的最小梯度的目的基因和内标基因的ct值≤28。
c)调整荧光信号阈值至正常对照品三个梯度的fam通道信号和vic通道信号线性相关系数均＞0.95。通常在荧光信号阈值在0.1左右时可获得理想的线性关系。
d)smn1基因0拷贝对照品的第7外显子和第8外显子反应的检测结果均应为缺失；smn2基因0拷贝对照品的第7外显子和第8外显子反应的检测结果均应为缺失。
e)待测样本内标基因的ct值≤28。
f)分别计算各个梯度对照品smn1和smn2基因第7外显子反应、第8外显子反应中目的基因与内标基因间的△ct值，△ct＝ct_fam-ct_vic。计算e7反应和e8反应1拷贝对照品三个梯度的△ct的平均值，记为△ct_a。
g)分别计算待测样本e7反应、e8反应中目的基因与内标基因间的△ct值，△ct＝ct_fam-ct_vic，记为△ct_s。△△ct＝△ct_s-△ct_a
6.2检验结果分析
smn1和smn2第7外显子、第8外显子pcr反应中的空白对照ct均值在35以上。相应pcr反应中，smn1基因1拷贝对照品3个稀释度取以2为底的对数，与对应的ct值的相关系数应均大于0.99。对照品反应与样本反应中，vic通道ct值均应小于或等于28，实验结果满足数据分析通用要求。
smn1和smn2基因第7外显子、第8外显子拷贝数的分析，采用δδct值法相对定量方式，其依据是每个模板的ct值与该模板的起始拷贝数的对数线性关系，起始拷贝数越多，ct值越小。因此，比较不同待检样本中dna的ct值与smn1基因1拷贝对照品ct值的变化，就可对未知标本目的基因的原始拷贝数做出判断。正常人群中，smn1第7外显子、第8外显子拷贝数均＝2，定量检测时目的基因与参比序列的拷贝数相等而δct值恒定(δδct＝-1)，2-δδct值为2.0；如果某个体目的基因缺失了其中1个，定量检测时此基因的ct值增高幅度为1，与参比序列比较所得的δct值增幅也为1(δδct＝0)，所计算的2-δδct值为1.0，也就说明目的基因拷贝数只有参比序列的一半；反之如果两个都缺失，则不会有目的序列扩增。所以，根据此数值变化规律，以δδct值法相对定量方式，直接分析smn1基因第7外显子和第7外显子目的序列的相对拷贝数，实现缺失型sma的快速分子诊断及分型。
smn1/smn2第7外显子和第8外显子拷贝数定量数据分析结果判定条件分别如表2和表3所示。
表2.smn1/smn2基因第7外显子反应
表3.smn1/smn2基因第8外显子反应
实施例七：结果验证
采用荷兰mrc公司的p060smaprobemix100rxn检测试剂盒(技术原理为mlpa，cat.no.p060-100r)对检测结果进行验证。操作按试剂盒说明书进行。产物采用abi3500遗传分析仪进行检测。
使用本发明试剂盒对临床23例sma患儿、23例sma患儿父母以及150例随机人群，共219例样本进行检测，检测结果与mlpa完全一致，准确率达100％。对上述smn1基因不同拷贝数(smn1基因拷贝数为0、1，或≥2)样本进行重复性检测实验。选取3个批号产品，不同人(2人)操作，每次试验每个样本重复3次检测，评价试剂盒重复性，检测结果一致，试剂盒检测重复性良好。
本发明通过上述引物对和taqman-mgb探针组合物可以实现smn1与smn2基因第7和第8外显子的相对拷贝数定量。
本发明提出的引物与探针组合物中，目标基因taqman-mgb探针分别使用fam和ned标记，内参基因taqman-mgb探针使用vic标记，显然可以选用其它合适荧光标记。在对smn1和smn2第7和第8外显子进行拷贝数相对定量时，单拷贝内参基因仅仅是作为拷贝数相对定量的内参标记，显然选择其它的单拷贝内参基因并不影响目的基因的拷贝数相对定量结果。
本发明提出的引物与探针组合物，其工作浓度已依据相应的pcr缓冲液及pcr循环参数进行优化。显然依据其它合适的pcr缓冲液及pcr循环参数同样可以获得理想的目的基因拷贝数相对定量检测结果。另外，更改引物与探针组合物的储存液浓度并不影响本发明的性质。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
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<223>下游引物cftr-r
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