一种基于荧光探针的新型基因SNP分型方法与流程

本发明涉及分子生物学基因检测领域，尤其涉及一种基于荧光探针的新型基因snp分型方法。

背景技术：

snp(singlenucleotidepolymorphism)，即单核苷酸多态性，是由单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列多态性。一般而言，普通的snp位点有两种等位基因。在人类基因组中平均每1000个碱基左右就有一个snp多态性位点。

snp位点会影响基因的功能，从而导致生物的性状改变，有些甚至会导致遗传疾病致病。单核苷酸多态性是研究人类家族遗传变异的重要依据，广泛用于群体遗传学研究和疾病相关基因的研究，在药物基因组学、诊断学和生物医学研究中起重要作用。目前基因snp分型检测方法主要是桑格测序、二代高通量测序、飞行时间质谱、荧光定量taqman探针法。

桑格测序、二代高通量测序和飞行时间质谱这三种基因snp分型检测方法采用的检测设备昂贵，检测试剂不具有开放性，只能采用仪器购买公司的试剂和耗材，受限较大。检测周期长，桑格测序、飞行时间质谱检测法需要3天以上，而二代高通量测序则需要15天以上，过程较为复杂，操作过程步骤繁多，对操作人员要求较高，污染风险较大，对实验室要求高。

荧光定量技术采用的设备较为低廉，检测周期短，一天之内即可完成，检测试剂具有开放性，可以采用目前大部分pcr试剂厂商的相关试剂和耗材，非常灵活。同时，操作简单，可以实现一步pcr反应检测，对实验室的要求较低，减少了污染的可能性。

但是一般的基于taqman水解探针的荧光定量pcr基因分型方法存在许多不足之处，如：探针成本高，需要设计两条探针；检测效率低，一个反应可集成检测的snp位点较少；检测产量较低；需要全程在荧光定量pcr仪上运行，对荧光定量pcr仪的利用度低。

技术实现要素：

本发明旨在解决现有技术的不足，而提供一种基于荧光探针的新型基因snp分型方法，具体为一种分段高效pcr(fh-pcr)基因分型方法。

本发明为实现上述目的，采用以下技术方案：

一种基于荧光探针的新型基因snp分型方法，具体步骤为

(1)模板dna提取：

采用dna提取试剂盒进行模板dna的提取；

(2)fh-pcr第一阶段：目的片段扩增

①pcr扩增体系成分包括：

taqhsdna聚合酶；

taqhsdna聚合酶10x缓冲液；

荧光探针；

上游引物；

下游引物；

模板dna；

由datp、dctp、dgtp和dttp组成的4种dntp混合物；

高纯水；

②pcr扩增体系的配制：

将1unit的taqhsdna聚合酶、taqhsdna聚合酶10倍浓度的缓冲液、0.05-0.5umol/l的上游引物和下游引物、0.2umol/l的荧光探针、0.2mmol/l的4种dntp混合物在体系配制专区进行配制；在另外一个专区进行模板dna的添加，模板dna的添加量为10-100ng，最后用高纯水补足至20ul；

③扩增

在普通pcr仪上进行目的片段的扩增；pcr引物与基因组dna结合，经过pcr循环，以半保留复制的形式，实现指数级扩增；各个步骤及控制参数如下：

第一步，温度为95℃、循环数为1，时间为3分钟；

第二步，温度为95℃、循环数为50，时间为15秒；

第三步，温度为60℃、循环数为50，时间为20秒；

第四步，温度为72℃、循环数为50，时间为20秒；

第五步，温度为95℃、循环数为1，时间为1分钟；

第六步，温度为40℃、循环数为1，时间为1分钟；

第七步，温度为4℃、循环数为1；

(3)fh-pcr第二阶段：溶解曲线信号收集

将扩增完的pcr的反应板直接放置在荧光定量pcr仪上进行反应，根据检测的荧光探针基因团的数目，选择荧光通道模式，不需开盖；各个步骤及控制参数如下：

第一步，温度为40℃、循环数为1，探针与目的片段结合，时间为3分钟；

第二步，温度为50℃逐渐升高到85℃，循环数为1，探针与目的片段解离，形成2级结构，在这个过程中收集荧光信号，得到溶解曲线；

第三步，温度为95℃、循环数为1，时间为30秒；

第四步，温度为25℃、循环数为1；

(4)结果判读：

根据设计的荧光探针的类型，如果目的片段的多态性与设计的吻合，且为纯合型，则溶解曲线tm值为高温型，显示的峰型为单一峰；如果目的片段的多态性与设计的不吻合，且为纯合型，则溶解曲线tm值为低温型，显示的峰型为单一峰；如果是杂合型，则溶解曲线会出现两个峰型。

模板dna的浓度为：od260/280比值为1.9-2.1。

模板dna提取时采用的是天根dna提取试剂盒dp331。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种新型探针，实现一条探针即可检测一个snp位点；优化了pcr反应体系和配方，提高检测的准确度；改进了荧光定量pcr的流程，提高了荧光定量仪利用度；优化了反应流程，提高了基于探针法和荧光定量pcr仪的snp检测产量。

附图说明

图1为目的片段的多态性与设计探针吻合且为纯合型时实时荧光定量检测结果图；

图2为目的片段的多态性与设计探针吻合且为纯合型时桑格测序验证结果图；

图3为目的片段的多态性与设计探针不吻合且为纯合型时实时荧光定量检测结果图；

图4为目的片段的多态性与设计探针不吻合且为纯合型时桑格测序验证结果图；

图5为目的片段为杂合型时实时荧光定量检测结果图；

图6为目的片段为杂合型时桑格测序验证结果图；

以下将结合本发明的实施例参照附图进行详细叙述。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：

具体实施例：

其中，引物及荧光探针的序列如下：

snp位点：

rs2253206[a/g]；

荧光探针序列：

5’-fam-ccattcctcctactaactgtaacttatgg-bhq1-3’；

5’端标记fam荧光基团，3’端标记bhq1基团，snp位点rs2253206位置处设计为c，为a/g多态性中的g型；

引物序列：

上游引物

5’-cgtggtccttacctgcacaa-3’；

下游引物

5’-ggctctcacttcagggcatt-3’；

目的片段大小：159bp。

其中，操作步骤为：

(1)模板dna提取：

采用天根dna提取试剂盒dp331，并严格按照此试剂盒说明书进行操作提取模板dna；

(2)fh-pcr第一阶段：目的片段扩增

①pcr扩增体系成分包括：

②pcr扩增体系的配制：

将1unit的taqhsdna聚合酶、10倍浓度的taqhsdna聚合酶缓冲液、0.05-0.5umol/l的上游引物和下游引物、0.2umol/l的荧光探针、0.2mmol/l的4种dntp混合物在体系配制专区进行配制；在另外一个专区进行模板dna的添加，模板dna的添加量为10-100ng，最后用高纯水补足至20ul；

③扩增

在普通pcr仪上进行目的片段的扩增；

按照pcr反应的原理，设计的pcr引物与基因组dna结合，经过pcr循环，以半保留复制的形式，实现指数级扩增，最终，通过引物的特异性结合和扩增反应，使目的片段增加了数百万倍以上，从而在溶解曲线反应过程中产生足够的荧光强度；

各个步骤及控制参数如下：

(3)fh-pcr第二阶段：溶解曲线信号收集

将扩增完的pcr的反应板直接放置在荧光定量pcr仪上进行反应，此步是溶解曲线反应；低温状态下(40℃)，探针与目的片段结合，探针的受体与供体集团分离，供体能量没有转移，因此荧光强度高；在溶解曲线升温过程中，从50℃升温至85℃，探针与目的片段解离，形成2级结构，探针的供体和受体集团接近，供体荧光基团分子发生淬灭；由于探针序列包含snp位点，当探针与目的片段完全匹配或不完全匹配时，解离温度不一样，会体现为溶解曲线峰型的差异，因此可以实现一条探针检测一个snp位点的目的；

根据检测的荧光探针基因团的数目，选择荧光通道模式，在此选择sybr单通道模式，全程不需开盖；各个步骤及控制参数如下：

(4)结果判读：

根据设计的探针类型，如果目的片段的多态性与设计探针吻合，且为纯合型，则溶解曲线tm值为高温型，显示的峰型为单一峰，如图1所示，出现单一峰且tm＝65℃，为高温，探针设计型为c，故此目的片段为gg纯合型，结果与桑格测序验证结果一致，见图2。

如果目的片段的多态性与设计探针不吻合，且为纯合型，则溶解曲线tm值为低温型，显示的峰型为单一峰，如图3所示，出现单一峰且tm＝58℃，为低温，探针设计型为c，故此目的片段为aa纯合型，结果与桑格测序验证结果一致，见图4。

如果是杂合型，则溶解曲线会出现两个峰型，高温与低温同时出现，如图5所示，出现双峰，而且两个峰的tm值分别为58℃和65℃，故此目的片段为ag杂合型，结果与桑格测序验证结果一致，见图6。

本发明采用的是fret原理，即距离很近的两个荧光分子间产生能量转移。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，且两个分子的距离在10nm内时，会发生非放射性的能量转移，供体分子能量转移至受体分子，因此使得供体的荧光强度降低(即荧光发生淬灭)，而受体的荧光增强(荧光的敏化)。低温状态下(40度以下)，探针与目的片段结合，受体与供体分离，供体能量没有转移，因此荧光强度高。在溶解曲线升温过程中，探针与目的片段解离，形成2级结构，供体和受体接近，荧光发生淬灭。由于探针序列包含snp位点，当探针与目的片段完全匹配和不完全匹配时，解离温度不一样，会体现为溶解曲线峰型的差异，因此可以实现一条探针检测一个snp位点的目的。由于仍然采用闭管操作，中途不需要开盖，以避免污染。但与传统的荧光定量反应不同，fh-pcr分为两步进行，充分提高荧光定量pcr仪的使用效用。

本发明取得了很好的有益效果，主要包括：

snp分型结果稳定，重复性好；

一条探针即可实现对snp位点的检测；

大大提高了荧光定量pcr仪的效率和利用度；

使基于探针法和荧光定量pcr仪的snp检测产量提高了3-5倍。

上面结合附图对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>北京凡知医学科技有限公司

<120>一种基于荧光探针的新型基因snp分型方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>29

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ccattcctcctactaactgtaacttatgg29

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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cgtggtccttacctgcacaa20

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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ggctctcacttcagggcatt20