一种用PPARγ基因评定牛肌内脂肪中甘油三酯含量的方法与流程

技术领域：

本发明属于分子营养学技术领域，具体是一种用pparγ基因评定牛肌内脂肪中甘油三酯含量的方法。

背景技术：
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牛肉具有高蛋白、低脂肪、低胆固醇等特点，营养丰富，一直是世界肉业发达国家、肉类消费的首选，而我国的牛肉消费量也在逐年上升。影响牛肉品质的一个核心因素就是肌内脂肪，肌内脂肪的主要成分为甘油三酯，为保障牛肉的适口性，牛肉的肌内脂肪一般要求不低于3％，饲料的配方、环境因子以及管理方法都会对牛的肌内脂肪沉积产生影响。如何能够在养牛生产中实现对牛肉内甘油三酯的动态监测，从而及时的调整饲料配方、环境因素和管理方法被视为现代养牛业中急需解决的一种技术。

过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisomeproliferationsactiratedreceptorγ,pparγ)基因属于核受体超家族成员基因之一，在脂肪沉积和脂肪细胞分化中行使着重要的作用。众多不同调控信号通路的研究结果表明：pparγ基因在成年机体组织中广泛表达，但主要在脂肪组织中表达，pparγ基因在诱导脂肪细胞分化的同时能够显著提高相关脂肪因子的表达量，如：lpl、plin1、gata1、cebpa、fabpa、fas等等，因此，pparγ基因在脂肪细胞分化过程中的表达对于启动和维持脂肪沉积起着重要作用。鉴于此，提供一种用pparγ基因来监测和评定牛肌内脂肪中甘油三酯含量的方法。

技术实现要素：
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本发明的目的旨在提供一种快速准确、操作方便用pparγ基因评定牛肌内脂肪中甘油三酯含量的方法。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

本发明的方法是通过监测牛pparγ基因的表达量，根据牛pparγ基因的表达量与肌内脂肪中甘油三酯含量成正相关的特征，通过荧光定量实时pcr技术度量牛肉中甘油三酯的含量，从而实现牛肉肌内脂肪中甘油三酯的检测。

具体包括如下步骤：

1)从被检测的牛肉组织中提取总rna，再通过反转录反应制备cdna样品；反转录反应按照takara反转录试剂盒标准流程进行；

2)将制备的cdna样品进行荧光定量实时pcr检测，反应条件采用两步法pcr扩增标准程序；

反应体系为：sybr10ul，dye0.4ul，上下游引物各0.25ul，cdna模版1ul，ddh2o8.1ul，总体积为20；

反应条件采用两步法pcr扩增标准程序：预变性95℃4min，95℃5s，61℃15s，72℃30s，共35个循环；

采用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)作为内参基因，其退火温度为61℃，内参基因与目的基因的扩增程序一致。

3)在abi7500定量pcr仪上进行检测，荧光信号在每个循环结束时检测，每个样品3个重复，得到牛pparγ基因的原始表达量；

4)将牛pparγ基因的原始表达量经反正弦转换后，采用statistics软件对实验数据和其他数据进行t检验，通过数据分析即检测到牛肉肌内脂肪中甘油三酯的含量。

上述定量pcr引物序列为：cctgttccgtgctgtgat(上游引物)；aaaggcatgggagtggtc(下游序列)。

本发明的有益效果在于：本发明的方法根据pparγ基因表达量与肌内脂肪中甘油三酯含量成正相关的特征，建立了通过荧光定量实时pcr技术来度量牛肉中甘油三酯的含量，该方法不影响牛的正常生长，而且快速准确，操作方便，养殖者可以根据检测结果针对性的对饲料配方、环境因素或管理方法进行改善，从而实现对牛肉品质的有效控制。

附图说明：

图1是pparγ基因相对表达量与牛肌内脂肪中的甘油三酯相对含量的相关性；

图2是gata2基因相对表达量与牛肌内脂肪中的甘油三酯相对含量的相关性；

图3是mc1r基因相对表达量与牛肌内脂肪中的甘油三酯相对含量的相关性；

图4是牛肌内脂肪中的甘油三脂的相对含量；

图5是kegg数据库中牛ppar基因信号通路。

具体实施方式：

下面结合具体实施方式及附图对本发明的技术方案进行详细说明。

以柴达木福牛为研究对象，在相同条件正常饲养条件下，挑选5头年龄差在一个月的公牛，分别在第15月龄、16月龄、17月龄、18月龄、19月龄对pparγ、gata2和mc1r基因表达情况进行检测，确定它们与牛肌内脂肪甘油三脂含量的关系。

表1：引物序列

1.样品来源

实验用牛皆来自青海省海西州柴达木福牛养殖基地，每栏牛数为10头，性别相同，年龄差在一个月内，饲料及其他主要管理条件保持一致。对相同的牛在15月龄、16月龄、17月龄、18月龄、19月龄对背部最长肌进行肌肉采样，将采集的背部皮下牛肌肉组织样品立刻用液氮保存，然后放在-80℃冰箱以备分析。牛背部最长肌肌肉组织样品的甘油三酯检测按照mak040|sigma试剂盒标准流程进行检测。

2.rna分离与反转录

从-80℃冰箱取出一块儿约0.1g牛肌肉组织，然后参照purelink^tmrnaminikit标准流程进行rna提取，提取后的rna保存于-80℃，然后用nd2000对rna进行浓度和纯度检测。反转录过程按照takara反转录试剂盒标准流程进行。

3.对pparγ、gata2和mc1r基因用步骤2中的cdna进行定量pcr检测，内参基因为gapdh。

反应体系：syb10ul，dye0.4ul，上下游引物各0.25ul，cdna模板1ul，ddh2o8.1ul，总体积20ul。

反应条件：预变性95℃4min，95℃5s，61℃15s，72℃30s；共35个循环。

4.在abi7500定量pcr仪上进行检测，荧光信号在每个循环结束时检测，每个样品3个重复，得到牛pparγ基因的原始表达量。

5.数据分析

rt-pcr得出的pparγ基因的原始表达量经反正弦转换后，得到pparγ基因的相对表达量，利用statistics软件对实验数据进行t检验，p<0.05为差异显著；其他数据直接利用statistics软件进行t检验，p<0.05为差异显著。

如图1所示，pparγ基因的相对表达量与牛肌内脂肪中的甘油三酯相对含量的相关性，得到：r²＝0.8766；

如图2所示，gata2基因的相对表达量与牛肌内脂肪中的甘油三酯相对含量的相关性，得到：r²＝0.4462；

如图3所示，mc1r基因的相对表达量与牛肌内脂肪中的甘油三酯相对含量的相关性，得到：r²＝0.296；

由上可知：pparγ基因的相对表达量与牛肌内脂肪中的甘油三酯相对含量的相关性最为显著。

如图4可知，15月龄的牛的牛肌内脂肪中的甘油三酯相对含量最高。

综上所述，由pparγ的基因表达量与牛肌内脂肪中甘油三酯含量成正相关的特征，可以快速准确地检测到牛肉中甘油三酯的含量，因此，针对性的对饲料配方、环境因素或管理方法进行改善，从而实现对牛肉品质的有效控制。

此外，本发明以pparγ基因为例说明如何通过基因表达量的监测来判断牛肌内脂肪中的甘油三脂的含量，但该方法的应用不局限于pparγ基因，其余和肌内脂肪甘油三脂含量呈正相关的基因都可以应用该方法。

如图5所示：kegg数据库中牛ppar基因信号通路(来自网址：http://www.kegg.jp/kegg-bin/show_pathway？bta03320)：图中的实线箭头表示增强和激活效应，从图中可以看到fabp3基因即可以受到pparγ基因的增强与激活，也可以受到pparα和pparβ基因的正调控，同样的thiolaseb基因(即acaa1基因)也同时受到pparα、pparβ、pparγ的正调控，所以从图中可以得知pparα、pparβ、pparγ下游信号中用实线箭头链接的基因都是具有脂肪代谢作用正调控的基因。因此，除pparγ基因外，其余基因包括：pparα、pparβ、hmgcs2、apoa1、apoa2、apoc3、me1、scd1、scd5、cyp7a1、nr1h3、cyp8b1、cyp27a1、cyp8b1、dbi、fabp1、fabp3、slc27a1、slc27a4、cd36、lpl、olr1、acsl3、acsl6、acsl5、acsbg1、acsbg2、acsl4a、acsl1、ehhadh、cyp4a22、acaa1、scp2、acox3、acox1、acox2、cpt1a、cpt1b、cpt1c、cpt2、acadl、acadm、angptl4、fabp4、sorbs1、plin2、plin4、plin1、plin5、apipoq、mmp1、fas都可以作为可利用的分子标记来实现饲料配方、环境因子对肌肉中甘油三脂影响效果的评价措施。