一种快速检测抗性杂草的Ile-2041-Asn突变的分子检测方法与流程

本发明属于农业科学技术领域，具体涉及一种快速检测抗性杂草的ile-2041-asn突变的分子检测方法和制备方法。

背景技术：

环介导恒温扩增反应(lamp)是2000年由日本学者notomi等发明的一种新颖的恒温核酸体外扩增技术，该方法利用一套(4种)特异性引物，以识别靶基因的六个特定区域。该技术原理是：在bst大片段聚合物的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围60min内，大量合成目标dna的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生。sybrgreenⅰ是一种荧光染料，根据反应液中成分的变化而呈现出不同的颜色，阴性(没有扩增产物)时为橙色，阳性(有扩增产物)时为绿色。lamp的方法优势是在恒温条件下进行，不需要pcr仪等昂贵的仪器；扩增反应极快，一般在1小时内完成；扩增产生的产物量大，通过肉眼即可判定结果，不需要繁琐的电泳过程；灵敏度高、特异性强；操作简便、快捷，适于抗性杂草突变情况的快速诊断及检测。

棒头草(polypogonfugax)是我国范围内普遍存在的一年生杂草，其生活史与冬季作物(如小麦和油菜)相似，并逐渐侵入农田，可使这些作物产量和质量显著下降。

乙酰辅酶a羧化酶(accase)抑制剂类除草剂，如精噁唑禾草灵、炔草酯等常用于包括棒头草在内的小麦、油菜田禾本科杂草的防除，且此类除草剂中的一种药剂若对杂草产生了抗性，往往其它药剂也会表现出抗性，尽管这些药剂并未在该区域施用。炔草酯是防止麦田类禾本科杂草的主导药剂，目前在小麦田大面积推广应用。在生产上发现长期单一使用炔草酯，其用药量逐年增加，药效降低，杂草对炔草酯逐渐产生抗性。

经过本研究团队多年跟踪调查，发现带有ile-2041-asn突变的抗炔草酯的棒头草种群。但经检索，目前国内外尚未有对抗炔草酯棒头草的ile-2041-asn突变的lamp快速分子检测的相关报道。

技术实现要素：

针对上述现有技术的不足之处，本发明提出了一种快速检测抗性杂草的ile-2041-asn突变的分子检测方法，经本研究团队多年跟踪调查，发现带有ile-2041-asn突变的抗炔草酯的棒头草种群。为了能够及时控制田间抗性棒头草种群的蔓延及指导田间农民正确用药，以lamp技术为基础的分子生物学技术能够快速检测抗炔草酯棒头草的ile-2041-asn突变情况，该方法具有简单、快速、成本低，灵敏性高等特点。本申请克服已有的抗炔草酯棒头草ile-2041-asn突变的鉴定及检测方法中存在费时、费力、成本高、准确性低的缺点，提供一种具有简便、快速、省时省力、灵敏度高的检测方法，从而大大提高检测效率，且由于accase基因的高保守性，在多个禾本科杂草中(如菵草、看麦娘等)基因序列同源性高，因此该检测方法同样适用于长期施用乙酰辅酶a羧化酶抑制剂类除草剂的禾本科杂草。本申请根据含有ile-2041-asn突变的抗炔草酯的棒头草基因型，优化反应条件，能对含有该突变的棒头草叶片进行检测，可以及时发现该突变是否存在于田间，从而指导正确田间用药，及时控制含有该种突变的棒头草种群的蔓延，可以减少农民的经济损失，具有很强的实用价值。

本发明的一种快速检测抗性杂草的ile-2041-asn突变的分子检测方法，基于lamp技术对该突变进行快速鉴定，包括以下步骤：

(1)分别提取待测样品的基因组dna；

(2)运用特异性引物进行lamp恒温扩增；

(3)lamp扩增产物中加入荧光染料，观察其颜色变化，和/或，在琼脂糖凝胶电泳上分离，观察扩增效果；

(4)鉴定是否为具有ile-2041-asn突变的棒头草种群。

优选的是，所述步骤(2)中的特异性引物为两对，分别为

f3:5’-cctctgttcatccttgctaactgg-3’，b3:5’-gctctgcagccttggggatat-3’

和fip:5’-gcaattatccttcaaaaggcttctctggtgggcaaag-3’，

bip:5’-gagaacctgaggacgtaccaaaggcaggctgatt-3’。

上述任一方案优选的是，所述步骤(2)中的特异性引物的设计方法为：在含有ile-2041-asn突变的抗炔草酯的棒头草基因的accase基因的ct区上设计1对外引物和1对内引物。

上述任一方案优选的是，所述步骤(2)中恒温扩增时的反应体系为：

上述任一方案优选的是，所述步骤(2)中恒温扩增时的反应参数为：56℃-60℃，60min，80℃10min。

上述任一方案优选的是，所述步骤(2)中恒温扩增时的反应参数为：58℃60min，80℃10min。为了保证该检测方法的高效性，对反应参数中的反应温度进行了优化，得出最适反应温度为58℃。

上述任一方案优选的是，步骤(3)中的荧光染料为sybrgreenⅰ。

上述任一方案优选的是，所述步骤(5)鉴定时，若lamp扩增产物显示绿色，和/或，电泳图谱为梯状条带，判定为带有ile-2041-asn突变的棒头草种群；若lamp扩增产物为橙色，和/或，电泳图谱无条带扩增，判定为不带有ile-2041-asn突变的棒头草种群。

一种用于快速检测抗性杂草的ile-2041-asn突变的试剂盒，其包含以下反应体系：

。

有益效果

本发明是基于lamp技术快速鉴定含有ile-2041-asn突变的抗炔草酯的棒头草乙酰辅酶a羧化酶(accase)基因型的分子检测方法，可用于含有该位点突变的棒头草的早期预警和流行监测，具有灵敏度高，特异性强等特点，与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)简便易行：该检测方法通过恒温水浴锅或有稳定热源的设备就能进行实验，通过反应产物验收变化即可判定结果，不需要昂贵的仪器设备以及繁琐的电泳过程；

(2)检测高效性：该检测方法所用检测时间仅需1小时左右，而pcr扩增时间较长，大大提高了检测的效率；

(3)灵敏度高：以dna为模板，该方法的检测下限为5×10-3ng/μl，是常规pcr的100倍；

(4)准确性高：该方法几乎不受反应混合液中存在的大量外源dna和杂质的影响，不需要从样本中纯化dna，可直接利用粗提的dna进行快速检测，大大提高检测的准确性；

(5)特异性强：该方法通过2对引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，相对于pcr引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性大大提高，假阳性出现的概率也随之减低；

(6)本发明是国内外首次利用lamp技术对含有ile-2041-asn突变的抗炔草酯的棒头草进行检测，这种方法快速简便，对指导农民正确科学用药，减少除草剂使用量、降低成本和减少环境污染具有重要的现实意义。

附图说明

图1：含有ile-2041-asn突变的抗炔草酯的棒头草lamp反应电泳图谱，其中：m-2000bpmarker:ck-未加dna的清水对照；s-加入不含ile-2041-asn突变的敏感棒头草dna；r-加入含有ile-2041-asn突变的棒头草抗性dna；

图2：含有ile-2041-asn突变的抗炔草酯的棒头草lamp反应正常光照下的产物颜色；

图3：含有ile-2041-asn突变的抗炔草酯的棒头草lamp反应紫外光照下的产物颜色；

图4：含有ile-2041-asn突变的抗炔草酯棒头草lamp灵敏度检测反应中紫外灯下及正常光照下的产物颜色，其中：m-2000bpmarker：ck-为未加dna的清水对照；2-7依次为50，5，5×10-1，5×10-2，5×10-3，5×10-4，5×10-5ng/μl：

a.紫外灯下及正常光照下的产物颜色；

图5.含有ile-2041-asn突变的抗炔草酯棒头草lamp灵敏度检测电泳图谱；

图6：含有ile-2041-asn突变的抗炔草酯棒头草普通pcr灵敏度检测电泳图谱；

图7：含有ile-2041-asn突变的抗炔草酯棒头草lamp反应条件优化电泳图谱.

具体实施方式

下述实施例是对于本发明内容的进一步说明以作为对本发明技术内容的阐释，但本发明的实质内容并不仅限于下述实施例所述，本领域的普通技术人员可以且应当知晓任何基于本发明实质精神的简单变化或替换均应属于本发明所要求的保护范围。

实施例1lamp反应组合物的特异性实验

为了验证lamp反应引物组合物的特异性，以抗炔草酯棒头草种群accase基因第2041位突变类型(即ile-2041-asn，为2041处氨基酸序列由ile突变为asn)为依据，设计lamp引物，其突变位点位于内引物fip的5’端，在突变位点上下游各2个碱基间进行任一或任二碱基错配突变，并以棒头草敏感型和抗药型种群dna为模板进行lamp实验，优选出能特异性鉴定含有ile-2041-asn突变的抗炔草酯棒头草种群的lamp引物组合物。

各引物序列具体如下：

fip:5’-gcaattatccttcaaaaggcttctctggtgggcaaag-3’

bip:5’-gagaacctgaggacgtaccaaaggcaggctgatt-3’

f3:5’-cctctgttcatccttgctaactgg-3’

b3:5’-gctctgcagccttggggatat-3’

其中，在内引物fip的5’端碱基中，加粗标记的“t”(引物fip序列的第6个碱基)为棒头草对炔草酯抗性的点突变碱基。

实施例2lamp反应体系及检测试剂盒体系优化

为了节省检测成本，保证本申请检测方法的稳定性和可靠性，对反应体系中的bstdna聚合酶(8u/μl)(4-16u)、mg²⁺(100mm)浓度(1-3μl)、引物fip/bip(20μm)及f3/b3(10μm)浓度(0.5-4μl)、甜菜碱(4m)浓度(2-8μl)进行了优化，确定了试剂盒最佳反应体系如表1所示，bstdna聚合酶(8u/μl)1μl，10×thermopolbuffer2.5μl，100mmmgso42μl，10mmdntp3μl，20umfip2μl，20umbip2μl，10umf31μl，10umb31μl，4m甜菜碱6μl，加入无菌超纯水制备，100次包装(即25ul一个体系)，低温运输，-20℃保存，有效期1年。

表1试剂盒最佳反应体系

图1为含有ile-2041-asn突变的抗炔草酯的棒头草lamp反应电泳图谱，图2为含有ile-2041-asn突变的抗炔草酯的棒头草lamp反应正常光照下的产物颜色，从左至右(ck、敏感种群、抗性种群)依次为橙色、橙色、绿色；

图3为含有ile-2041-asn突变的抗炔草酯的棒头草lamp反应紫外光照下的产物颜色，从左至右(ck、敏感种群、抗性种群)依次为橙色、橙色、绿色；图4为含有ile-2041-asn突变的抗炔草酯棒头草lamp灵敏度检测反应中紫外灯下(上图)及正常光照下(下图)的产物颜色，从左至右：ck橙色、50ng亮绿色、5ng亮绿色、5×10^-1ng绿色、5×10^-2ng绿色、5×10^-3ng淡绿色、5×10^-4ng极淡绿色、5×10^-5ng橙色。

实施例3lamp反应条件优化

为了得到最适的反应温度，保证该检测方法的高效性，对反应参数中的反应温度进行了优化，图7为含有ile-2041-asn突变的抗炔草酯棒头草lamp反应条件优化电泳图谱，在反应温度为56℃--60℃的条件下均有dna条带扩增，因此从高效性考虑，得出最适反应温度为58℃。

实施例4lamp反应灵敏度检测

为了确定lamp反应的检测下限，本实验中用试剂盒提前纯化的基因组dna作为模板以10倍梯度稀释。以上述稀释的基因组dna为模板，分别进行lamp及pcr扩增。从图5和图6可知，本实验中lamp技术的最低检测下限为5×10^-3ng，而普通pcr检测下限为5×10^-1ng。图5为含有ile-2041-asn突变的抗炔草酯棒头草lamp灵敏度检测电泳图谱，图6为含有ile-2041-asn突变的抗炔草酯棒头草普通pcr灵敏度检测电泳图谱。

本发明所建立的检测方法能准确、快速的检测出含有ile-2041-asn突变的抗炔草酯棒头草种群，为科学研究和生产实践提供一种简便、快速、成本低廉的检测技术，也为该抗性杂草的早期预警及合理用药提供了理论基础和技术指导，对增加生态、社会和经济效益都具有现实而深远的意义。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。