本发明属于天然物质提取技术领域，特别涉及一种利用贝肉制备ace抑制肽的方法。
背景技术：
高血压（hypertension）是指以体循环动脉血压（收缩压和/或舒张压）增高为主要特征（收缩压≥140毫米汞柱，舒张压≥90毫米汞柱），可伴有心、脑、肾等器官的功能或器质性损害的临床综合征。目前，临床常用的降血压药物虽有很好的降压效果，但同时存在一些毒副作用和不良反应。
从高血压的发病机制看，无活性的血管紧张素i在血管紧张素转化酶（angiotensini-convertingenzyme，ace)催化作用下转变为具有强血管收缩活性的血管紧张素ii，降解血管舒缓激肽，使小动脉血管平滑肌收缩，从而导致血压升高。oshima等从明胶的细菌胶原酶消化液中最早提取了食源性ace抑制肽，可以有效抑制ace活性，阻止血管紧张素ii的生成，从而达到降血压的作用。此后，学者们对ace抑制肽展开了广泛的研究，并在多种食物蛋白中发现了ace抑制肽。来源于食物的ace抑制肽降压效果显著，安全性高，无毒副作用，且成本低，易吸收，更符合患者的需求。
由于海洋生物生长环境的特殊性，从海洋生物中寻找降血压活性物质已成为海洋药物、海洋功能性食品研究的重要方向。蛤蜊是沿海地区常见的营养丰富且价格相对低廉的贝类产品，目前对蛤蜊ace抑制肽多采用酶解法提取，以微生物发酵法生产蛤蜊ace抑制肽的报道较少。
发明专利cn200710303512.5，连续酶膜反应制备马氏珠母贝降血压肽的方法，采用碱性蛋白酶水解马氏珠母贝肉和酶膜反应器，来制备马氏珠母贝降血压肽。其制备方法是：把马氏珠母贝肉粉碎制浆及加热变性，用水稀释得到反应液；将反应液连续加入酶膜反应器中，进行反应与分离，水解完成液连续透过膜流出酶膜反应器；将水解完成液喷雾干燥即得蛋白质水解收率为40～70％、ic50为0.3～0.6mg/ml的马氏珠母贝肉降血压肽产品。具有产品收率高，生产成本低，适合规模生产，产品达到一般功能食品的要求。
发明专利cn201610116627.2，一种利用纳豆菌发酵鲜贝肉制备降血压功能食品的方法，主体工艺包括鲜贝预处理、培养基配制与灭菌、纳豆菌菌悬液制备、液体发酵与后熟、冷冻干燥等工艺步骤。新鲜贝类清洗后蒸煮取肉，将肉切碎后经冷冻干燥、粉碎得贝肉干粉；按重量比1∶0.1∶25分别加入贝肉干粉、蔗糖和蒸馏水配制培养基，并在灭菌锅中121℃灭菌15min；将适量活化后的纳豆菌种转入装有种子培养基的三角瓶中，制成108cfu·ml-1的种子菌悬液；在灭菌后的培养基中接入占培养基体积分数为5％的纳豆菌种子菌悬液，于45℃摇瓶液体发酵24小时，接着于4℃后熟24小时，再将发酵液进行冷冻干燥处理即得粉末状降血压功能食品。本发明工艺简便，可高值化利用贝类，产品可作为降血压功能食品使用。
现有技术中，酶法提取贝类ace抑制肽方法较为成熟，但酶用量大，成本高；微生物发酵法成本低，ace抑制肽得率高，但技术不成熟。
技术实现要素：
针对现有技术中利用贝肉制备ace抑制肽存在的不足，本发明提供一种复合菌发酵贝肉制备ace抑制肽的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种利用贝肉制备ace抑制肽的方法，包括以下步骤：
a.取新鲜贝肉蒸煮切碎后，置于-20℃冰箱冷冻，6h后转入真空冷冻干燥机中，冷冻干燥48h，粉碎过40目筛得贝肉干粉；
b.将贝肉干粉按料液比1:（3~4）加入蒸馏水进行匀浆，调节ph为6.3~7.0，然后加入40~60mg/ml的磁性碳微球，高压灭菌20~30min后，得到培养基；
所述磁性碳微球的制备方法如下：
（1）将废豆渣与碳酸钾按照质量比1:2溶解于蒸馏水中，室温下浸渍4h，然后干燥至含水量为2%~5%，移入管式炉中，在400ml/min氮气保护下，以6℃/min的速率加热至600~650℃，保温75~100min，冷却后将样品洗至中性，干燥并磨成粉，过50~100目筛，得到活性碳粉末；
（2）按重量份数比，取1~3份fe3o4微球和20~60份活性炭粉末，超声分散于15~45份蒸馏水中，量取0.5~1.5份浓氨水加入上述体系中，超声搅拌10min；将上述混合液转移至反应釜中，于180˚c高温反应4h，用磁铁分离并收集所得磁性碳微球，依次用无水乙醇和蒸馏水洗涤若干次，于60˚c下烘干，得到磁性碳微球；
c.于培养基中接种8%~10%的复合菌液，在37~40℃，180~200r/min条件下摇床培养24~30h，得到发酵液；
所述复合菌液为枯草芽孢杆菌1389和黑曲霉as3.350；
d.将发酵液巴氏灭菌后，在外加磁场下分离出磁性碳微球，然后用蒸馏水反复洗涤磁性碳微球至洗涤液中无蛋白物质，收集洗涤液；将洗涤液和分离磁性碳微球后的发酵液进行混合得到混合液，按照混合液：磁性二氧化硅体积比=1:2、流速1bv/h条件下通过磁性二氧化硅吸附柱进行吸附，将所得洗脱液进行冷冻干燥，即可得到ace抑制肽；
所述磁性二氧化硅吸附柱制备方法如下：
（1）取fe3o4微球超声分散于甲苯中，350rpm电动搅拌，分别缓慢加入甲苯体积3%~5%的正硅酸乙酯和三乙胺，室温下搅拌反应24h，用磁铁分离并收集所得磁性二氧化硅微球，依次用无水乙醇和蒸馏水洗涤若干次，于60˚c下烘干，得到磁性二氧化硅微球；
（2）按重量份数比，称取20~40份磁性二氧化硅微球超声分散于400~600份ph为8.2的tris-hcl缓冲液中，350rpm电动搅拌，然后向体系中缓慢加入3-（异丁烯酰基）丙基三甲氧基硅烷（mps）和正硅酸乙酯（teos），室温下反应16h，用磁铁分离并收集所得丙烯酰基改性磁性二氧化硅微球，依次用无水乙醇和蒸馏水洗涤若干次，于60˚c下烘干，得到氨基改性磁性二氧化硅微球；
（3）将上述氨基改性磁性二氧化硅微球填充于吸附柱中，填充量为80%~90%，得到二氧化硅吸附柱。
优选的，所述fe3o4微球制备方法如下：
按重量份数比，称取2~4份fecl3·6h2o溶于60~80份乙二醇中，添加6~8份无水醋酸钠，再加入2~4份聚乙二醇，超声5min，磁力搅拌15min，将反应混合液加入高压反应釜，180˚c高温反应8h，用磁铁分离磁源微粒（fe3o4）产品，依次用无水乙醇，水洗涤3-5次，60˚c烘干，得到fe3o4微球。
在合成磁性微球过程中，增加带活性官能团硅烷偶联剂用量，制备得磁性微球对蛋白吸附量增加，而蛋白活性保持率下降，此外，活性基团硅烷偶联剂与正硅酸乙酯用量比增加至1~2:1时，磁性微球对蛋白吸附量明显上升，而固定化蛋白活性保持率轻微下降，原因是适当的固定蛋白没有造成很大的空间位阻。因此，合成改性磁性微球的最佳硅烷偶联剂用量比例为（1~2）:1。
以豆渣制备的活性炭具有很好蛋白的吸附功能，但不吸附肽，能有效吸附复合菌发酵产生的酶，提高酶活力和酶稳定性，豆渣活性炭表面的高纤维能提高芽孢杆菌和黑曲霉的繁殖速度，大大提高发酵效率，提高贝肉活性肽产率，利用磁性材料与豆渣活性炭制备成的磁性碳微球，利于ace抑制肽与杂蛋白的分离，提高了抑制肽的活性。
将豆渣碳化，制备成微孔结构的活性炭材料，能吸附贝肉发酵过程中的腥味，提高了产品的功能性。
豆渣属于豆制品生产过程的副产物，在存储过程中容易霉变、腐败，尤其是在夏天。变质的豆渣不能用作动物饲料，常被丢弃或焚烧，从而对环境构成威胁。本发明充分利用了豆渣，提高了原料利用率。
磁性二氧化硅具有稳定性高的特点，通过特定用量的氨基修饰后，能提高其对蛋白的吸附能力，但对肽分子相斥，从而分离杂蛋白和抑制肽，并且磁性二氧化硅吸附的杂蛋白活性高，吸附量高，使吸附后的蛋白（主要为复合菌产生的酶）可再次用于贝肉降解，或者可用于其他方面的产品生产；硅材料的稳定性使其可多次利用，磁性材料的引入易于分离，降低操作难度和成本。
优选的，步骤（3）所述复合菌液中枯草芽孢杆菌1389和黑曲霉as3.350比值为2:1。
枯草芽孢杆菌1389发酵贝肉，产生的中性蛋白酶能水解贝肉蛋白制备ace抑制肽，但酶活性不高，导致ace抑制肽水解率低，黑曲霉能利用贝肉发酵产生有机酸如柠檬酸和没食子酸，能激活磁性碳微球中碳表面的活性官能团，从而提高中性蛋白酶的活性，黑曲霉发酵还能产生酸性蛋白酶，与中性蛋白酶协同酶解贝肉蛋白，大大提高了ace抑制肽的水解率；黑曲霉发酵产的有机酸能去除贝肉的腥味，提高了ace抑制肽的功能性，但高浓度的有机酸会使体系酸值提高，不利于酶解，因此复合菌液中枯草芽孢杆菌1389和黑曲霉as3.350用量比值为2:1。
优选的，所述磁性碳微球的制备方法中，fe3o4微球和活性炭粉末质量比为1:20，蒸馏水和浓氨水体积比为30:1，蒸馏水加入量为15ml/g活性炭粉末。
优选的，所述磁性二氧化硅吸附柱制备方法中，体系中fe3o4微球含量为4mg/ml甲苯；正硅酸乙酯和三乙胺加入量比为1：1；
优选的，所述磁性二氧化硅吸附柱制备方法中，3-（异丁烯酰基）丙基三甲氧基硅烷（mps）和正硅酸乙酯（teos）用量比为（1~2）：1；体系中fe3o4微球：3-（异丁烯酰基）丙基三甲氧基硅烷（mps）=1mg：2~4ml。
作为本发明的进一步改进，步骤d中磁性二氧化硅吸附柱进行吸附2~3个生产周期后，利用2bv/h的蒸馏水洗涤吸附柱，收集洗脱液，干燥成粉末，然后加入到步骤b中与贝肉干粉混合制备培养基，加入量为贝肉干粉量的65~80%。
本发明的有益效果：
1、以复合菌发酵制备贝肉ace抑制肽，通过复合酶水解蛋白，提高ace抑制肽的活性，降低生产难度，提高了产品的安全度；
2、以磁性碳微球结合复合菌发酵制备的ace抑制肽纯度更高，提高了发酵效率，更易分离杂蛋白和抑制肽；
3、以磁性二氧化硅吸附柱进行ace抑制肽的分离纯化，降低操作难度，分离的蛋白活性高，主要为复合菌所产生的酶，可以用于循环降解贝肉制备ace抑制肽，可用于其他产品生产，提高了原料利用率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
a.取新鲜贝肉蒸煮切碎后，置于-20℃冰箱冷冻，6h后转入真空冷冻干燥机中，冷冻干燥48h，粉碎过40目筛得贝肉干粉；
b.将贝肉干粉按料液比1:3加入蒸馏水进行匀浆，调节ph为6.3，然后加入40mg/ml的磁性碳微球，高压灭菌20min后，得到培养基；
所述磁性碳微球的制备方法如下：
（1）将废豆渣与碳酸钾按照质量比1:2溶解于蒸馏水中，室温下浸渍4h，然后干燥至含水量为2%，移入管式炉中，在400ml/min氮气保护下，以6℃/min的速率加热至600℃，保温75min，冷却后将样品洗至中性，干燥并磨成粉，过50目筛，得到活性碳粉末；
（2）按重量份数比，取1份fe3o4微球和20份活性炭粉末，超声分散于15份蒸馏水中，量取0.5份浓氨水加入上述体系中，超声搅拌10min；将上述混合液转移至反应釜中，于180˚c高温反应4h，用磁铁分离并收集所得磁性碳微球，依次用无水乙醇和蒸馏水洗涤若干次，于60˚c下烘干，得到磁性碳微球；
c.于培养基中接种8%的复合菌液，在37℃，180r/min条件下摇床培养24h，得到发酵液；所述复合菌液中芽孢杆菌1389和黑曲霉as3.350比值为2:1；
d.将发酵液巴氏灭菌后，在外加磁场下分离出磁性碳微球，然后用蒸馏水反复洗涤磁性碳微球至洗涤液中无蛋白物质，收集洗涤液；将洗涤液和分离磁性碳微球后的发酵液进行混合得到混合液，按照混合液：磁性二氧化硅体积比=1:2、流速1bv/h条件下通过磁性二氧化硅吸附柱进行吸附，将所得洗脱液进行冷冻干燥，即可得到ace抑制肽；
所述磁性二氧化硅吸附柱制备方法如下：
（1）取fe3o4微球超声分散于甲苯中，350rpm电动搅拌，分别缓慢加入甲苯体积3%的正硅酸乙酯和三乙胺，室温下搅拌反应24h，用磁铁分离并收集所得磁性二氧化硅微球，依次用无水乙醇和蒸馏水洗涤若干次，于60˚c下烘干，得到磁性二氧化硅微球；
体系中fe3o4微球含量为4mg/ml甲苯；正硅酸乙酯和三乙胺加入量比为1：1；
（2）按重量份数比，称取20份磁性二氧化硅微球超声分散于400份ph为8.2的tris-hcl缓冲液中，350rpm电动搅拌，然后向体系中缓慢加入3-（异丁烯酰基）丙基三甲氧基硅烷（mps）和正硅酸乙酯（teos），室温下反应16h，用磁铁分离并收集所得丙烯酰基改性磁性二氧化硅微球，依次用无水乙醇和蒸馏水洗涤若干次，于60˚c下烘干，得到氨基改性磁性二氧化硅微球；
所述3-（异丁烯酰基）丙基三甲氧基硅烷（mps）和正硅酸乙酯（teos）用量比为1：1；体系中fe3o4微球：3-（异丁烯酰基）丙基三甲氧基硅烷（mps）=1mg：2ml；
（3）将上述氨基改性磁性二氧化硅微球填充于吸附柱中，填充量为90%，得到二氧化硅吸附柱；
所述fe3o4微球制备方法如下：
按重量份数比，称取2份fecl3•6h2o溶于60份乙二醇中，添加6份无水醋酸钠，再加入2份聚乙二醇，超声5min，磁力搅拌15min，将反应混合液加入高压反应釜，180˚c高温反应8h，用磁铁分离磁源微粒（fe3o4）产品，依次用无水乙醇，水洗涤3次，60˚c烘干，得到fe3o4微球。
步骤d中磁性二氧化硅吸附柱进行吸附3个生产周期后，利用2bv/h的蒸馏水洗涤吸附柱，收集洗脱液，干燥成粉末，然后加入到步骤b中与贝肉干粉混合制备培养基，加入量为贝肉干粉量的65%。
实施例2
a.取新鲜贝肉蒸煮切碎后，置于-20℃冰箱冷冻，6h后转入真空冷冻干燥机中，冷冻干燥48h，粉碎过40目筛得贝肉干粉；
b.将贝肉干粉按料液比1:4加入蒸馏水进行匀浆，调节ph为7.0，然后加入60mg/ml的磁性碳微球，高压灭菌30min后，得到培养基；
所述磁性碳微球的制备方法如下：
（1）将废豆渣与碳酸钾按照质量比1:2溶解于蒸馏水中，室温下浸渍4h，然后干燥至含水量为5%，移入管式炉中，在400ml/min氮气保护下，以6℃/min的速率加热至650℃，保温100min，冷却后将样品洗至中性，干燥并磨成粉，过100目筛，得到活性碳粉末；
（2）按重量份数比，取3份fe3o4微球和60份活性炭粉末，超声分散于45份蒸馏水中，量取1.5份浓氨水加入上述体系中，超声搅拌10min；将上述混合液转移至反应釜中，于180˚c高温反应4h，用磁铁分离并收集所得磁性碳微球，依次用无水乙醇和蒸馏水洗涤若干次，于60˚c下烘干，得到磁性碳微球；
c.于培养基中接种10%的复合菌液，在40℃，200r/min条件下摇床培养30h，得到发酵液；所述复合菌液中芽孢杆菌1389和黑曲霉as3.350比值为2:1；
d.将发酵液巴氏灭菌后，在外加磁场下分离出磁性碳微球，然后用蒸馏水反复洗涤磁性碳微球至洗涤液中无蛋白物质，收集洗涤液；将洗涤液和分离磁性碳微球后的发酵液进行混合得到混合液，按照混合液：磁性二氧化硅体积比=1:2、流速1bv/h条件下通过磁性二氧化硅吸附柱进行吸附，将所得洗脱液进行冷冻干燥，即可得到ace抑制肽；
所述磁性二氧化硅吸附柱制备方法如下：
（1）取fe3o4微球超声分散于甲苯中，350rpm电动搅拌，分别缓慢加入甲苯体积5%的正硅酸乙酯和三乙胺，室温下搅拌反应24h，用磁铁分离并收集所得磁性二氧化硅微球，依次用无水乙醇和蒸馏水洗涤若干次，于60˚c下烘干，得到磁性二氧化硅微球；
体系中fe3o4微球含量为4mg/ml甲苯；正硅酸乙酯和三乙胺加入量比为1：1；
（2）按重量份数比，称取40份磁性二氧化硅微球超声分散于600份ph为8.2的tris-hcl缓冲液中，350rpm电动搅拌，然后向体系中缓慢加入3-（异丁烯酰基）丙基三甲氧基硅烷（mps）和正硅酸乙酯（teos），室温下反应16h，用磁铁分离并收集所得丙烯酰基改性磁性二氧化硅微球，依次用无水乙醇和蒸馏水洗涤若干次，于60˚c下烘干，得到氨基改性磁性二氧化硅微球；
所述3-（异丁烯酰基）丙基三甲氧基硅烷（mps）和正硅酸乙酯（teos）用量比为2：1；体系中fe3o4微球：3-（异丁烯酰基）丙基三甲氧基硅烷（mps）=1mg：4ml；
（3）将上述氨基改性磁性二氧化硅微球填充于吸附柱中，填充量为80%，得到二氧化硅吸附柱。
所述fe3o4微球制备方法如下：
按重量份数比，称取4份fecl3•6h2o溶于80份乙二醇中，添加8份无水醋酸钠，再加入4份聚乙二醇，超声5min，磁力搅拌15min，将反应混合液加入高压反应釜，180˚c高温反应8h，用磁铁分离磁源微粒（fe3o4）产品，依次用无水乙醇，水洗涤5次，60˚c烘干，得到fe3o4微球。
步骤d中磁性二氧化硅吸附柱进行吸附2个生产周期后，利用2bv/h的蒸馏水洗涤吸附柱，收集洗脱液，干燥成粉末，然后加入到步骤b中与贝肉干粉混合制备培养基，加入量为贝肉干粉量的80%。
实施例3
a.取新鲜贝肉蒸煮切碎后，置于-20℃冰箱冷冻，6h后转入真空冷冻干燥机中，冷冻干燥48h，粉碎过40目筛得贝肉干粉；
b.将贝肉干粉按料液比4加入蒸馏水进行匀浆，调节ph为6.5，然后加入50mg/ml的磁性碳微球，高压灭菌30min后，得到培养基；
所述磁性碳微球的制备方法如下：
（1）将废豆渣与碳酸钾按照质量比1:2溶解于蒸馏水中，室温下浸渍4h，然后干燥至含水量为4%，移入管式炉中，在400ml/min氮气保护下，以6℃/min的速率加热至600℃，保温80min，冷却后将样品洗至中性，干燥并磨成粉，过80目筛，得到活性碳粉末；
（2）按重量份数比，取2份fe3o4微球和40份活性炭粉末，超声分散于30份蒸馏水中，量取1份浓氨水加入上述体系中，超声搅拌10min；将上述混合液转移至反应釜中，于180˚c高温反应4h，用磁铁分离并收集所得磁性碳微球，依次用无水乙醇和蒸馏水洗涤若干次，于60˚c下烘干，得到磁性碳微球；
c.于培养基中接种9%的复合菌液，在38℃，200r/min条件下摇床培养28h，得到发酵液；所述菌液中芽孢杆菌1389和黑曲霉as3.350比值为2:1；
d.将发酵液巴氏灭菌后，在外加磁场下分离出磁性碳微球，然后用蒸馏水反复洗涤磁性碳微球至洗涤液中无蛋白物质，收集洗涤液；将洗涤液和分离磁性碳微球后的发酵液进行混合得到混合液，按照混合液：磁性二氧化硅体积比=1:2、流速1bv/h条件下通过磁性二氧化硅吸附柱进行吸附，将所得洗脱液进行冷冻干燥，即可得到ace抑制肽；
所述磁性二氧化硅吸附柱制备方法如下：
（1）取fe3o4微球超声分散于甲苯中，350rpm电动搅拌，分别缓慢加入甲苯体积4%的正硅酸乙酯和三乙胺，室温下搅拌反应24h，用磁铁分离并收集所得磁性二氧化硅微球，依次用无水乙醇和蒸馏水洗涤若干次，于60˚c下烘干，得到磁性二氧化硅微球；
体系中fe3o4微球含量为4mg/ml甲苯；正硅酸乙酯和三乙胺加入量比为1：1；
（2）按重量份数比，称取30份磁性二氧化硅微球超声分散于500份ph为8.2的tris-hcl缓冲液中，350rpm电动搅拌，然后向体系中缓慢加入3-（异丁烯酰基）丙基三甲氧基硅烷（mps）和正硅酸乙酯（teos），室温下反应16h，用磁铁分离并收集所得丙烯酰基改性磁性二氧化硅微球，依次用无水乙醇和蒸馏水洗涤若干次，于60˚c下烘干，得到氨基改性磁性二氧化硅微球；所述3-（异丁烯酰基）丙基三甲氧基硅烷（mps）和正硅酸乙酯（teos）用量比为2：1；体系中fe3o4微球：3-（异丁烯酰基）丙基三甲氧基硅烷（mps）=1mg：3ml；
（3）将上述氨基改性磁性二氧化硅微球填充于吸附柱中，填充量为85%，得到二氧化硅吸附柱。
所述fe3o4微球制备方法如下：
按重量份数比，称取3份fecl3•6h2o溶于70份乙二醇中，添加7份无水醋酸钠，再加入3份聚乙二醇，超声5min，磁力搅拌15min，将反应混合液加入高压反应釜，180˚c高温反应8h，用磁铁分离磁源微粒（fe3o4）产品，依次用无水乙醇，水洗涤4次，60˚c烘干，得到fe3o4微球。
步骤d中磁性二氧化硅吸附柱进行吸附3个生产周期后，利用2bv/h的蒸馏水洗涤吸附柱，收集洗脱液，干燥成粉末，然后加入到步骤b中与贝肉干粉混合制备培养基，加入量为贝肉干粉量的70%；
实施例1~3制备的ace抑制肽工艺效果如表1。
表1实施例1~3制备的ace抑制肽工艺效果
由表1可知，有本发明制备的贝肉ace抑制肽具有很高的活性和抑制率，经过磁性二氧化硅吸附柱分离后的酶活保持率高，可用于循环发酵2~3次以上，具有很好的经济效益。
以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。