鸡血球抗氧化肽及其酶解制备方法与流程

本发明涉及动物源性抗氧化肽技术领域，具体地说，涉及一种鸡血球抗氧化肽及其酶解制备方法。

背景技术：

我国是畜牧养殖大国，家禽年出栏量已超过110亿羽，位居世界前三位。通常而言，每屠宰一只家禽约可收集0.1kg血液，则粗估家禽血液产量高达110万吨。由此可见，我国血液资源丰富，具有广阔的应用前景。作为肉类加工行业的主要副产物，血液本身营养价值高，蛋白质含量高达20％左右，必需氨基酸(lys、leu等)含量高，其营养价值可与畜禽胴体中6％～7％的瘦肉相媲美，素有“液态肉”、“养血之玉”的美誉。除营养特性外，血液经酶解后的水解液具有一定的生物学活性，如抗氧化、阿片样、调节免疫、抗菌、ace抑制和缓激肽增强等作用。

目前市场上血液产品多是以血粉、血豆腐、血球蛋白粉等初级加工形式存在，利用率较低，深加工技术落后，致使大量营养资源流失，并造成环境污染。此外，现有的生产加工技术多关注传统营养产品的制取，而对血球蛋白的分子资源挖掘不够，产品的功能性未得到充分发挥。因此，寻求适宜的加工处理方式，深度开发利用家禽血液的功能特性，对蛋白质资源的高值化利用与生态环境的可持续发展有重大意义。

抗氧化活性肽(antioxidative/antioxidantpeptide)是指生物体内源性的或由蛋白质降解后生成的且具有抗氧化活性的肽类物质。因其分子量较小(通常由2～20个氨基酸组成)、结构简单而较易被吸收。抗氧化肽具有抑制、延缓脂质过氧化并清除体内过剩自由基的作用，可有效保护机体免受自由基侵害，因此当机体内自由基过剩且自身无法及时清除时，摄入适量抗氧化肽可预防氧化应激并降低疾病的发病率。与具有毒副作用而限量添加的化学合成抗氧化剂(叔丁基对苯二酚、丁基羟基茴香醚、没食子酸丙酯、二丁基羟基甲苯等)相比，该类活性物质具有稳定性高、活性强、高营养、易吸收、安全低毒等优点。因此，从自然资源中获取抗氧化活性肽已成为当前营养、医药等领域的研究焦点。

目前，国内外对血液的研究多是集中在牛血和猪血的营养特性和生物活性方面，而对家禽血液的研究甚少，从新鲜鸡血中制备高活性抗氧化肽的技术和产品更是未见报道。因此，充分开发我国丰富的家禽血液资源，深入并系统挖掘其抗氧化活性，为高效利用家禽血球提供渠道和技术依据，也为家禽血球蛋白酶解物开发成抗氧化的功能性饲料和食品奠定理论基础。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种从鸡血中提取活性抗氧化肽的方法并制备得到两种抗氧化肽。

为了实现本发明目的，本发明提供的鸡血球抗氧化肽的酶解制备方法，包括以下步骤：(1)制备血球；(2)溶血破膜；(3)蛋白酶解；(4)超滤，去除3kda及3kda以上的蛋白分子，所得滤过液中含有鸡血球抗氧化肽。

步骤(3)蛋白酶解所用蛋白酶选自胃蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味酶(风味蛋白酶)中的至少一种。

本发明的鸡血球抗氧化肽的酶解制备方法，具体包括以下步骤：

(1)制备血球：采集鸡血，加入占血液总重量0.6％-0.8％的抗凝剂，采用连续离心法将鸡血分离为血浆和血球(血球蛋白)；

(2)溶血破膜：向血球中加入盐酸溶液和去离子水，得到血球稀释液，并将血球稀释液置于恒温反应器中，进行破膜处理；

(3)蛋白酶解：在破膜处理后的血球稀释液(蛋白浓度4-8％)中加入有机酸溶液或碱溶液调节ph至所选蛋白酶的最佳酶解ph(2.0-7.0)，然后加入所选蛋白酶，并在最佳酶解温度(35-55℃)下进行酶解；酶解反应结束后，加热使蛋白酶变性失活，终止反应；最后将酶解后的溶液离心，收集上清液；

(4)超滤：将酶解液过超滤膜，以去除活性弱的大分子蛋白，收集滤过液；在步骤(4)之后，还包括以下步骤(5)：

(5)分离纯化：将步骤(4)中收集的滤过液上样于离子交换色谱柱，用洗脱液进行洗脱，收集具有抗氧化活性的洗脱峰；利用sephadexg-25凝胶色谱或superdexpeptidehr10/30预装柱进一步分离，用洗脱液进行洗脱，收集抗氧化活性最强的洗脱峰；然后利用反相高效液相色谱(rp-hplc)进一步分离，乙腈洗脱，收集抗氧化活性最强的洗脱峰，冷冻干燥即得鸡血球抗氧化肽。

本发明中，鸡血可以为新鲜采集的鸡血，也可以是经过冷冻融化后的鸡血。冷冻的鸡血在使用前需进行低温解冻，尽量减少冷冻解冻过程对蛋白的破坏。

本发明所用抗凝剂为柠檬酸钠，超滤膜截留的分子量3-10kda；优选地，所述超滤膜截留的分子量为3kda。

前述的方法，步骤(2)中所述盐酸溶液浓度为0.05-1.0mol/l，血球蛋白与盐酸溶液的体积比为3:2，加入去离子水使血球蛋白浓度维持在4-10％，将血球稀释液置于恒温(30-50℃)反应器中反应30min。

前述的方法，步骤(3)中蛋白酶的添加量为1％-5％；优选地，所述蛋白酶的添加量为1.5-3.5％。

前述的方法，步骤(3)中在最佳酶解温度下以120-300rpm反应1-7h；酶解反应结束后，将酶解溶液在70-100℃下水浴5-40min，使蛋白酶变性失活，终止反应；最后将酶解后的溶液在2000-10000g条件下离心5-20min，收集上清液。

优选地，本发明所述离子交换色谱柱内径和长度之比为1:23；填充料为dowex50w×8(氢型)，洗脱液为0-1m甲酸铵溶液，流速为1.5ml/min；或者，填充料为dowex1×8(氯型)，洗脱液为含0-1mnacl的20mmtris缓冲液，流速为1.0ml/min。

优选地，本发明所述sephadexg-25凝胶色谱柱内径和长度之比为1:44，superdexpeptidehr10/30预装柱购自ge公司；洗脱液为去离子水，流速为1.0ml/min。

优选地，进行反相高效液相色谱所用rp-hplc柱为agilentzorbaxsb-c18column，洗脱液为含0.1％三氟乙酸的乙腈，流速为0.5ml/min。

本发明还提供按照上述方法制备的鸡血球抗氧化肽，其为氨基酸序列如seqidno:1或2所示的活性肽。

本发明进一步提供所述鸡血球抗氧化肽在制备食品、药品、保健品、化妆品和饲料中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(一)本发明提供的抗氧化肽具有强自由基清除活性，对dpph自由基、超氧阴离子、羟自由基等具有较强的清除作用，并具有较高的还原能力，其抗氧化能力可与谷胱甘肽相媲美，在抗氧化活性开发和应用方面具有重要价值。

(二)采用本发明方法制备的抗氧化肽，具有天然、无毒、无污染、无残留、无副作用且活性高的特点，还可有效耐受高温(100℃耐受10min)、强酸(最低耐受ph1.0)和胃肠消化(完全耐受胃蛋白酶消化，而在胰酶处理2h后活性略有下降)，具有良好的稳定性。

(三)本发明中，通过对鸡血球进行酶解，并优化了酶解的条件，充分利用血液蛋白，并将其转化为价值较高的抗氧化肽，实现家禽血液资源的高值化利用，具有成本优势，并为综合利用蛋白质资源提供了一条有效途径。

(四)本发明利用色谱柱对酶解液进行分离、提纯，得到的产品纯度高，操作简单，可规模化生产。

附图说明

图1为本发明实施例1中胃蛋白酶水解鸡血球制备抗氧化肽并鉴定其氨基酸序列。其中，(a)离子交换色谱层析图；(b)凝胶色谱层析图；(c)高效液相色谱层析图；(d)lc-esi-ms/ms鉴定氨基酸序列。

图2为本发明实施例2中酸性蛋白酶水解鸡血球制备抗氧化肽并鉴定其氨基酸序列。其中，(a)离子交换色谱层析图；(b)凝胶色谱层析图；(c)高效液相色谱层析图；(d)lc-esi-ms/ms鉴定氨基酸序列。

图3为本发明实施例3中双酶水解鸡血球制备抗氧化肽。其中，(a)离子交换色谱层析分离pfh-i；(b)凝胶色谱层析图；(c)高效液相色谱层析图。

图4为本发明实施例3中双酶水解鸡血球制备的抗氧化肽的氨基酸序列鉴定。其中，(a)为一级质谱图，(b)为二级质谱图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100ml溶液中含有溶质的克数。

以下实施例中所用胃蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味酶分别购自sigma(p6887)、北京东华强盛生物技术有限公司、广西南宁庞博生物工程有限公司以及诺维信生物技术有限公司(500mg)。

本发明中，dpph自由基清除力、超氧阴离子清除能力和还原力的测定方法分别如下：

1、dpph(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基清除能力测定

1.5ml样品液与等量的1mmol/ldpph乙醇溶液混合，25℃避光反应30min，在517nm测定其吸光值asample；以等量的无水乙醇替代dpph乙醇溶液，与1.5ml样品混合反应，于517nm波长测其吸光值asampleblank；不加待测样品液，于517nm波长下测定1.5mldpph乙醇与1.5ml水混合液的吸光值acontrol。

2、超氧阴离子清除能力测定

0.1ml待测样品加入2.8mltris-hcl-edta(ph8.2)缓冲液，25℃水浴保温10min后加入0.1ml3.0mm邻苯三酚溶液，迅速混匀，325nm每30s测吸光值，5min结束。作吸光值随时间变化的回归方程，求其斜率。超氧阴离子清除能力计算公式为：

清除能力(％)＝(v对照-v样品)/v对照×100％

式中，v对照是对照组邻苯三酚自氧化速率(δa/min)；v样品是样品组邻苯三酚氧化速率(δa/min)。

3、还原力测定

1.0ml样品与1.0ml磷酸钠溶液(ph6.6)及1.0ml1％铁氰化钾混合，50℃孵化20min。加入1.0ml10％tca溶液，5000×g离心10min。2.0ml上清液与2.0ml去离子水、0.4ml0.1％三氯化铁混合，室温静置10min，700nm测吸光值。

实施例1鸡血球抗氧化肽的制备方法

包括以下步骤：

(1)血球蛋白酶解：鸡血—分离得血球—破碎细胞制备得蛋白浓度为5％的血球底物—调节ph2.0—加入酶浓度2.5％胃蛋白酶—37℃水解3h—90℃高温处理20min灭酶—6000×g4℃条件下离心10min—取上清得到抗氧化肽粗液。

制备血球：采集新鲜鸡血加入占血液总重量0.8％的柠檬酸钠，并采用转速为14000r/min的高速离心机离心10分钟，将鸡血分离为血浆和血球。

溶血破膜：向血球中加入血球体积3％的0.1mol/l盐酸溶液和去离子水，以制备浓度5％的血球稀释液，并将血球稀释液置于40℃恒温反应器中，进行破膜处理30min。

蛋白酶解：将血球底物ph值调至2.0，加入2.5％胃蛋白酶(约20000u)，37℃水解3h，然后90℃高温处理20min灭酶，6000×g4℃条件下离心10min，取上清得到抗氧化肽粗液。

(2)超滤：将抗氧化肽粗液过3kda超滤膜，取滤过液并冷冻干燥。

(3)离子交换色谱层析：将步骤(2)中收集的组分溶解于20mm醋酸铵溶液(ph4.0)获得浓度为20mg/ml的样品，0.22μm滤膜过滤后上样于阳离子交换色谱柱dowex50w×8(氢型)，用0-1m甲酸铵溶液梯度洗脱并用自动部份收集器收集洗脱液，检测吸光值并混合相同洗脱峰的液体，冻干后分析抗氧化能力(洗脱曲线见图1-a)。

(4)凝胶色谱层析：将步骤(3)中获得的活性最强的组分b配制成20mg/ml的溶液，上样至superdexpeptidehr10/30柱，并以1.0ml/min的流速洗脱，检测吸光度并收集各洗脱峰，冷冻干燥后测定各组分的抗氧化能力(洗脱曲线图1-b)。

(5)rp-hplc：将步骤(4)中获得的活性最强的组分b5配制成10mg/ml的溶液，上样于agilentzorbaxsb-c18柱采用含0.1％三氟乙酸的乙腈进行洗脱，流速为0.5ml/min，收集抗氧化最强的洗脱峰b5-a，冷冻干燥即得本发明所述的抗氧化肽(洗脱曲线见图1-c)。

(6)氨基酸序列鉴定：高效液相色谱检验所得组分b5-a纯度可达95％，采用液相色谱与质谱联用技术(lc-ms/ms)方法测定氨基酸序列(图1-d)，得到本发明所述的抗氧化肽的氨基酸序列为met-gly-gln-lys-asp-ser-tyr-val-gly-asp-glu-ala-gln-ser-lys-arg-gly-ile-leu-thr(mgqkdsyvgdeaqskrgilt，seqidno:1)，分子量为2182.1da；目标肽在浓度0.1mg/ml时，其dpph自由基清除能力、超氧阴离子清除能力和还原力分别为85.36±0.32％、56.79±4.90％和0.20±0.00。

实施例2鸡血球抗氧化肽的制备方法

包括以下步骤：

(1)血球蛋白酶解：鸡血—分离得血球—破碎细胞制备得蛋白浓度为5％的血球底物—调节ph3.5—加入酶浓度2.0％酸性蛋白酶—45℃水解3h—沸水浴处理10min灭酶—6000×g4℃条件下离心10min—取上清得到抗氧化肽粗液。

制备血球：采集新鲜鸡血加入0.8％柠檬酸钠，并采用转速为14000r/min的高速离心机离心10分钟，将鸡血分离为血浆和血球。

溶血破膜：向血球中加入血球体积3％的0.1mol/l盐酸溶液和去离子水，以制备浓度5％的血球稀释液，并将血球稀释液置于40℃恒温反应器中，进行破膜处理30min。

蛋白酶解：将血球底物ph值调至3.5，加入2.0％酸性蛋白酶(约40000u)，45℃水解3h，然后沸水浴处理10min灭酶，6000×g4℃条件下离心10min，取上清得到抗氧化肽粗液。

(2)超滤：将抗氧化肽粗液过3kda超滤膜，取滤过液并冷冻干燥。

(3)离子交换色谱层析：将步骤(2)中收集的组分溶解于20mm醋酸铵溶液(ph4.0)获得浓度为20mg/ml的样品，过滤后上样于阳离子交换色谱柱dowex50w×8(氢型)，用0-1m甲酸铵溶液梯度洗脱并用自动部份收集器收集洗脱液，冻干后分析抗氧化能力(洗脱曲线见图2-a)。

(4)凝胶色谱层析：将步骤(3)中获得的活性最强的组分b配制成20mg/ml的溶液，上样至superdexpeptidehr10/30柱，并以1.0ml/min的流速洗脱，检测吸光度并收集各洗脱峰，冷冻干燥后测定各组分的抗氧化能力(洗脱曲线见图2-b)。

(5)rp-hplc：将步骤(4)中获得的活性最强的组分j配制成10mg/ml的溶液，上样于zorbaxsb-c18柱子并用含0.1％三氟乙酸的乙腈进行洗脱，流速为0.5ml/min，收集抗氧化最强的洗脱峰i，冷冻干燥即得本发明所述的抗氧化肽(洗脱曲线见图2-c)。

(6)氨基酸序列鉴定：高效液相色谱检验所得组分i纯度为90％以上，采用液相色谱与质谱联用技术(lc-ms/ms)方法测定氨基酸序列(图2-d)，得到本发明所述的抗氧化肽的氨基酸序列为met-gly-gln-lys-asp-ser-tyr-val-gly-asp-glu-ala-gln-ser-lys-arg-gly-ile-leu-thr(mgqkdsyvgdeaqskrgilt，seqidno:1)，分子量为2182.1da；目标肽在浓度为0.1mg/ml时，其dpph自由基清除能力、超氧阴离子清除能力和还原力分别为87.16±1.59％、46.45±3.27％和0.21±0.01。

实施例3鸡血球抗氧化肽的制备方法

包括以下步骤：

(1)血球蛋白双酶解：鸡血—分离得血球—破碎细胞制备得蛋白浓度为5％的血球底物—调节ph6.0—加入双酶：2.0％木瓜蛋白酶与1.0％风味酶—50℃水解6h—90℃处理20min灭酶—6000×g4℃条件下离心10min—取上清得到抗氧化肽粗液。

制备血球：采集新鲜鸡血加入占血液总重量0.8％的柠檬酸钠，并采用转速为14000r/min的高速离心机离心10分钟，将鸡血分离为血浆和血球。

溶血破膜：向血球中加入血球体积2.7％的0.1mol/l盐酸溶液和去离子水，以制备浓度5％的血球稀释液，并将血球稀释液置于40℃恒温反应器中，进行破膜处理30min。

蛋白酶解：将血球底物ph值调至6.0，加入2.0％木瓜蛋白酶(约80000u)与1.0％风味酶(约20000u)，50℃水解6h，然后90℃高温处理20min灭酶，6000×g4℃条件下离心10min，取上清得到抗氧化肽粗液。

(2)超滤：将抗氧化肽粗液过3kda超滤膜，取滤过液并冷冻干燥。

(3)离子交换色谱层析：将步骤(2)中收集的组分溶解于20mmtris缓冲液(ph8.2)获得浓度为20mg/ml的样品，过滤后上样于阴离子交换色谱柱dowex1×8(氯型)，用含有0-1mnacl的tris缓冲液梯度洗脱并用自动部份收集器收集洗脱液，用500da透析袋透析除盐，获得的组分冻干后分析抗氧化能力(洗脱曲线见图3-a)。

(4)凝胶色谱层析：将步骤(3)中获得的活性最强的组分a配制成20mg/ml的溶液，上样至sephadexg-25柱，并以1.0ml/min的流速洗脱，检测吸光度并收集各洗脱峰，冷冻干燥后测定各组分的抗氧化能力(洗脱曲线见图3-b)。

(5)rp-hplc：将步骤(4)中获得的活性最强的组分a配制成10mg/ml的溶液，上样于zorbaxsb-c18柱子并用含0.1％三氟乙酸的乙腈进行洗脱，流速为0.5ml/min，收集抗氧化最强的洗脱峰19，冷冻干燥即得本发明所述的抗氧化肽(洗脱曲线见图3-c)。

(6)氨基酸序列鉴定：高效液相色谱检验所得组分19纯度为95％以上，采用液相色谱与质谱联用技术(lc-ms/ms)方法测定氨基酸序列(图4)，得到本发明所述的抗氧化肽的氨基酸序列为ala-glu-asp-lys-lys-leu-ile-gln(aedkkliq，seqidno:2)，分子量为943.5da；目标肽在浓度为0.2mg/ml时，其dpph自由基清除能力、超氧阴离子清除能力和还原力分别为42.45±1.32％、49.40±0.56％和0.14±0.00。

本发明提供的鸡血球抗氧化肽(seqidno:1或2)具有强自由基清除活性，对dpph自由基、超氧阴离子等自由基具有较强的清除作用，并具有较高的还原能力，其抗氧化能力可与谷胱甘肽相媲美，在抗氧化活性开发和应用方面具有重要价值。本发明的鸡血球抗氧化肽可有效耐受高温(100℃耐受10min)、强酸(最低耐受ph1.0)和胃肠消化(完全耐受胃蛋白酶消化，而在胰酶处理2h后活性略有下降)，具有良好的稳定性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国农业大学

<120>鸡血球抗氧化肽及其酶解制备方法

<130>khp171118197.6

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>prt

<213>鸡(gallusgallus)

<400>1

metglyglnlysaspsertyrvalglyaspglualaglnserlysarg

151015

glyileleuthr

20

<210>2

<211>8

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<213>鸡(gallusgallus)

<400>2

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