本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种可稳定保存的肺癌甲基化基因检测试剂盒的质控品及应用。
背景技术：
近年来dna甲基化标志物在肺癌的早期诊断发挥越来越重要的作用，为发展无创性方法研究特异性在肺癌早期标志物奠定了基础。肺癌细胞可释放dna到血液循环系统内，在癌症病人血清和血浆内可以检测到异常的较高浓度的循环dna。通过比较研究发现，启动子区dna甲基化在肺癌组织与对应血清、血浆样本中具有相似的改变模式，这表明血液样本内相关基因的表观遗传学变化可作为肿瘤早期筛选的标志物。目前已经发现一系列与肺癌相关的抑癌基因，由于发生异常甲基化而导致转录失活。抑癌基因启动子甲基化与肺癌发生发展的关系受到越来越多的重视。
目前检测甲基化最常用的技术有限制性酶切法、高分辨率熔解曲线法、亚硫酸氢钠测序法、dna印迹法及经典的甲基化特异性pcr等。这些方法各有优缺点，根据标本来源和分子标志的不同，选择的检测方法有所差异。但都无法同时满足定量的精确性、高敏感性、高通量、低假阳性和假阴性，低成本和低污染的要求。在众多诊断技术中，基因测序是最直观、最准确的方法之一。分子生物学的飞速发展及基因治疗的出现为肺癌的早期诊断、有效治疗提供了新的依据。肺癌有很多驱动基因，不同病人甲基化的发生几率不一样，因此需要对多基因、多位点同时检测。采用高通量靶向测序方法有目的的研究基因组的特定区域，这是一种大规模的多重pcr扩增方法，能够实现几千甚至上万种引物对目标区域低频率或稀有突变的检测。使用肺癌甲基化检测试剂盒的检测样本类型包括新鲜的或经甲醛固定石蜡包埋(formalin-fixedandparrffin-embedded，ffpe)的组织样本，能提供更高的通量和更广泛的目标区域覆盖度，可同时筛选p16、rassf1a、cdh1和cdh13等多种基因，同时保证临床实验室对数据结果高质量和高可信度的需求。
目前，市面上并没有经济、有效、稳定通用的肺癌甲基化检测试剂盒的质控品销售，而质控品又是评价和验证一款试剂盒检测准确性和稳定性等性能的重要方法和质量指标。但常规的质控品非常容易降解，而作为检测肺癌甲基化的质控品，其准确性和稳定性是个难以解决的大问题。
技术实现要素：
基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种dna保存液，可以有效防止游离dna的降解，为dna提供稳定的环境，延长质控品的保存时间。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种dna保存液，金精三甲酸铵盐、甘氨酸和苯丁抑制素盐酸盐；且所述金精三甲酸铵盐、甘氨酸和苯丁抑制素盐酸盐的摩尔比为(100～500)：(50000～150000)：(0.02～0.06)。
优选地，所述金精三甲酸铵盐、甘氨酸和苯丁抑制素盐酸盐的摩尔比为300：80000：0.04。
本发明还提供了所述dna保存液在dna保存中的用途。
本发明所述dna保存液可用于制备基因甲基化检测试剂盒的质控品。
本发明的又一目的，在于提供一种可稳定保存的肺癌甲基化基因检测试剂盒的质控品。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种可稳定保存的肺癌甲基化基因检测试剂盒的质控品，其包含以下组分：阳性参考品、阴性参考品和检测限参考品；
所述阳性参考品包含目标基因发生甲基化修饰的dna和所述的dna保存液；
所述阴性参考品包含目标基因未发生甲基化修饰的dna和所述的dna保存液；
所述检测限参考品包含目标基因发生甲基化修饰的dna、目标基因未发生甲基化修饰的dna和所述的dna保存液，且所述目标基因发生甲基化修饰的dna占dna总量的质量比为1～5％。
优选地，所述质控品包含p16、rassf1a、cdh1和cdh13基因质控品中的至少一种。
上述质控品，是发明人在工作中通过大量样本分析筛选后得出，以上述类型的质控品作为阳性参考，能够覆盖大部分的中国人群的肺癌甲基化类型，既有较好的参考效果，又能够降低成本。
优选地，所述阳性参考品、阴性参考品和检测限参考品中dna保存液的组分金精三甲酸铵盐摩尔浓度为100-500μm，甘氨酸摩尔浓度为50-150mm，苯丁抑制素盐酸盐摩尔浓度为20-60nm。
优选地，所述阳性参考品、阴性参考品和检测限参考品中dna保存液的组分金精三甲酸铵盐摩尔浓度为300μm，甘氨酸摩尔浓度为80mm，苯丁抑制素盐酸盐摩尔浓度为40nm。
本发明还提供了所述可稳定保存的肺癌甲基化基因检测试剂盒的质控品的制备方法，包括以下步骤：
(1)阳性参考品的制备：①选取已鉴定为目标基因发生甲基化修饰的肺癌组织样本，提取dna并进行亚硫酸氢盐修饰与纯化；②按比例向纯化的dna溶液中加入所述dna保存液，即得；
(2)阴性参考品的制备：①选取已鉴定为目标基因未发生甲基化修饰的肺癌组织样本，提取dna并进行亚硫酸氢盐修饰与纯化；②按比例向纯化的dna溶液中加入所述dna保存液，即得；
(3)检测限参考品的制备：①将所述阳性参考品dna和阴性参考品dna混合，使所述阳性参考品dna占总dna的质量比为1～5％；②按比例向纯化的dna溶液中加入所述dna保存液，即得。
本发明提供的可稳定保存的肺癌甲基化基因检测试剂盒的质控品可用于监测肺癌甲基化基因检测试剂盒的准确性、精密度和稳定性等相关性能。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：(1)本发明提供的质控品中包含有dna保存液，可以有效防止游离dna的降解，为dna提供稳定的环境，延长质控品的保存时间；(2)本发明dna保存液的组分和各组分的使用量是发明人经过大量研究和统计分析得出的，具有很好的保存游离dna的效果；(3)本发明质控品中dna保存液的使用量是发明人经过大量研究和统计分析得出的，可以使质控品具有很好的稳定性；(4)本发明提供的dna质控品具有制备成本低、性能稳定和易保存等优点，可有效地监控人员操作、仪器状态以及试剂盒有效性等因素，极大地提高了检测试剂盒的准确性和可靠性。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明dna保存液的一种实施例，包含金精三甲酸铵盐、甘氨酸和苯丁抑制素盐酸盐；且所述金精三甲酸铵盐、甘氨酸和苯丁抑制素盐酸盐的摩尔比为100：50000：0.02。
实施例2
本发明dna保存液的一种实施例，金精三甲酸铵盐、甘氨酸和苯丁抑制素盐酸盐；且所述金精三甲酸铵盐、甘氨酸和苯丁抑制素盐酸盐的摩尔比为500：150000：0.06。
实施例3
本发明dna保存液的一种实施例，金精三甲酸铵盐、甘氨酸和苯丁抑制素盐酸盐；且所述金精三甲酸铵盐、甘氨酸和苯丁抑制素盐酸盐的摩尔比为300：80000：0.04。
实施例4
本发明可稳定保存的肺癌甲基化基因检测试剂盒的质控品的一种实施例，包含p16、rassf1a、cdh1和cdh13基因质控品。
所述p16基因质控品包括阳性参考品、阴性参考品和检测限参考品；所述阳性参考品包含p16基因发生甲基化修饰的dna和实施例3所述的dna保存液；所述阴性参考品包含p16未发生甲基化修饰的dna和实施例3所述的dna保存液；所述检测限参考品包含p16基因发生甲基化修饰的dna、p16未发生甲基化修饰的dna和实施例3所述的dna保存液，且所述p16基因发生甲基化修饰的dna占dna总量的质量比为2％。
所述rassf1a基因质控品包括阳性参考品、阴性参考品和检测限参考品；所述阳性参考品包含rassf1a基因发生甲基化修饰的dna和实施例3所述的dna保存液；所述阴性参考品包含rassf1a未发生甲基化修饰的dna和实施例3所述的dna保存液；所述检测限参考品包含rassf1a基因发生甲基化修饰的dna、rassf1a未发生甲基化修饰的dna和实施例3所述的dna保存液，且所述rassf1a基因发生甲基化修饰的dna占dna总量的质量比为2％。
所述cdh1基因质控品包括阳性参考品、阴性参考品和检测限参考品；所述阳性参考品包含cdh1基因发生甲基化修饰的dna和实施例3所述的dna保存液；所述阴性参考品包含cdh1未发生甲基化修饰的dna和实施例3所述的dna保存液；所述检测限参考品包含cdh1基因发生甲基化修饰的dna、cdh1未发生甲基化修饰的dna和实施例3所述的dna保存液，且所述cdh1基因发生甲基化修饰的dna占dna总量的质量比为2％。
所述cdh13基因质控品包括阳性参考品、阴性参考品和检测限参考品；所述阳性参考品包含cdh13基因发生甲基化修饰的dna和实施例3所述的dna保存液；所述阴性参考品包含cdh13未发生甲基化修饰的dna和实施例3所述的dna保存液；所述检测限参考品包含cdh13基因发生甲基化修饰的dna、cdh13未发生甲基化修饰的dna和实施例3所述的dna保存液，且所述cdh13基因发生甲基化修饰的dna占dna总量的质量比为2％。
所述阳性参考品、阴性参考品和检测限参考品中dna保存液的组分金精三甲酸铵盐摩尔浓度为300μm，甘氨酸摩尔浓度为80mm，苯丁抑制素盐酸盐摩尔浓度为40nm。
实施例5
本发明可稳定保存的肺癌甲基化基因检测试剂盒的质控品的一种实施例，包含rassf1a和cdh13基因质控品。
所述rassf1a基因质控品包括阳性参考品、阴性参考品和检测限参考品；所述阳性参考品包含rassf1a基因发生甲基化修饰的dna和实施例1所述的dna保存液；所述阴性参考品包含rassf1a未发生甲基化修饰的dna和实施例1所述的dna保存液；所述检测限参考品包含rassf1a基因发生甲基化修饰的dna、rassf1a未发生甲基化修饰的dna和实施例1所述的dna保存液，且所述rassf1a基因发生甲基化修饰的dna占dna总量的质量比为1％。
所述cdh13基因质控品包括阳性参考品、阴性参考品和检测限参考品；所述阳性参考品包含cdh13基因发生甲基化修饰的dna和实施例1所述的dna保存液；所述阴性参考品包含cdh13未发生甲基化修饰的dna和实施例1所述的dna保存液；所述检测限参考品包含cdh13基因发生甲基化修饰的dna、cdh13未发生甲基化修饰的dna和实施例1所述的dna保存液，且所述cdh13基因发生甲基化修饰的dna占dna总量的质量比为1％。
所述阳性参考品、阴性参考品和检测限参考品中dna保存液的组分金精三甲酸铵盐摩尔浓度为100μm，甘氨酸摩尔浓度为50mm，苯丁抑制素盐酸盐摩尔浓度为20nm。
实施例6
本发明可稳定保存的肺癌甲基化基因检测试剂盒的质控品的一种实施例，包含p16基因质控品。
所述p16基因质控品包括阳性参考品、阴性参考品和检测限参考品；所述阳性参考品包含p16基因发生甲基化修饰的dna和实施例2所述的dna保存液；所述阴性参考品包含p16未发生甲基化修饰的dna和实施例2所述的dna保存液；所述检测限参考品包含p16基因发生甲基化修饰的dna、p16未发生甲基化修饰的dna和实施例2所述的dna保存液，且所述p16基因发生甲基化修饰的dna占dna总量的质量比为5％。
所述阳性参考品、阴性参考品和检测限参考品中dna保存液的组分金精三甲酸铵盐摩尔浓度为500μm，甘氨酸摩尔浓度为150mm，苯丁抑制素盐酸盐摩尔浓度为60nm。
实施例7
本实施例以p16基因质控品的制备方法为例，说明本发明质控品的制备方法。
p16基因质控品制备方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)阳性参考品的制备：①选取已鉴定为p16基因发生甲基化修饰的肺癌组织样本，提取dna并进行亚硫酸氢盐修饰与纯化；②向纯化后的dna溶液中加入实施例3所述的dna保存液，使金精三甲酸铵盐摩尔浓度为300μm，甘氨酸摩尔浓度为80mm，苯丁抑制素盐酸盐摩尔浓度为40nm，即得；
(2)阴性参考品的制备：①选取已鉴定为p16基因未发生甲基化修饰的肺癌组织样本，提取dna并进行亚硫酸氢盐修饰与纯化；②向纯化后的dna溶液中加入实施例3所述dna保存液，使金精三甲酸铵盐摩尔浓度为300μm，甘氨酸摩尔浓度为80mm，苯丁抑制素盐酸盐摩尔浓度为40nm，即得；
(3)检测限参考品的制备：①将所述阳性参考品dna和阴性参考品dna混合，使所述阳性参考品dna占总dna的质量比为2％；②向纯化后的dna溶液中加入实施例3所述dna保存液，使金精三甲酸铵盐摩尔浓度为300μm，甘氨酸摩尔浓度为80mm，苯丁抑制素盐酸盐摩尔浓度为40nm，即得。
实施例8
本实施例对发明所述dna保存液对dna的保存效果进行研究。
1、实验设计
以p16基因甲基化dna的保存为例，为了研究本发明dna保存液对p16基因甲基化dna的保存效果，分别利用本发明的dna保存液在不同条件下保存p16基因甲基化dna，并分别设置更换甘氨酸组分和不添加dna保存液的对照组，所述对照组中添加相同质量比的焦碳酸二乙酯水(diethylpyrocarbonate，depc)，具体如表1所示：
表1实验设计
2、实验方法
选取已鉴定为p16基因发生甲基化修饰的肺癌组织样本，提取dna，平均分为10个组，按表1的设计添加dna保存液或depc水，制备得到各组p16基因甲基化dna样品(即p16基因阳性参考品)。实验开始前对各组p16基因阳性参考品进行dna浓度测定，并记录。然后将各组样品保存在相应的条件下，2周后通过agilent2100生物分析仪分别测定各组样品dna浓度，以此检测各组p16基因阳性参考品的稳定性及降解情况。同时利用以下公式计算降解率：降解率％＝(实验前dna浓度-实验后dna浓度)/实验前dna浓度×100％。
3、实验结果
2周后，对各组p16基因阳性参考品进行检测，具体实验结果如表2所示：
表2实验结果
由上述实验结果可知，本发明提供的dna保存液在-20℃(实验组1～3)和37℃(实验组4～6)时都能显著提高dna的稳定性，可有效防止其在保存过程中的降解。其中，实验组3和实验组6中的dna保存液对dna的保存效果最好。而在相同保存条件下，将本发明保存液组分甘氨酸更换为ε-聚赖氨酸后，dna的降解率显著高于本发明(对照组1和3)，同时不使用本发明保存液的dna溶液(对照组2和4)中dna的降解率也显著高于使用本发明保存液的dna溶液。尤其是在37℃保存条件下，甘氨酸更换为半胱氨酸后，dna溶液在2周后降解率为10.3％(对照组3)，同时不添加本发明保存液的dna溶液在2周后降解率高达16％(对照组4)，而添加了本发明保存液的dna溶液降解率仅为6％左右(实验组4～6)。加入本发明dna保存液的dna在2周内未出现降解情况，根据医疗器械加速老化实验确定有效期的基本原理和相关方法可知，加入保存剂的dna溶液的有效期为3年6个月。
实施例9
本实施例以实施例4中可稳定保存的肺癌甲基化基因检测试剂盒的质控品为例，研究本发明质控品的准确性。
1、检测方法
利用高通量靶向测序法对本发明质控品进行检测，评价所述质控品的准确性。
2、检测结果
检测结果如表3所示：
表3dna质控品准确性检测结果
由上述实验结果可知，本发明实施例4所述质控品中阳性参考品、阴性参考品和检测限参考品中的甲基化基因均能准确检测，且基因类型完全符合。说明本发明提供的参考品准确率为100％。
实施例10
本实施例以实施例4中可稳定保存的肺癌甲基化基因检测试剂盒的质控品为例，研究所述质控品的稳定性。
1、检测方法
利用高通量靶向测序法对随机抽取的三套不同生产批次的质控品进行分析。
2、检测结果
检测结果如表4所示：
表4三套不同批次的dna质控品稳定性检测结果
由上述结果可知，随机抽取的三套dna质控品的检测结果准确且基因型别完全一致，说明三套dna质控品之间的检测结果无差异，且检测结果完全正确。由于检测的三套dna质控品是随机抽取的，可推知其他dna质控品之间的检测结果也是一致的，说明本发明提供的dna质控品性能很稳定。且三套重复性参考品精密度符合变异系数(cv，％)不大于15％。
实施例11
本发明dna保存液包含以下组分：金精三甲酸铵盐、甘氨酸和苯丁抑制素盐酸盐。为了研究组分的选择对dna保存液效果的影响，本实施例对dna保存液组分的选择进行了研究。
1、实验设计
以dna保存液对p16基因甲基化dna的保存为例，为了研究不同组分组成的dna保存液的保存效果，设计实验组1和对照组1～7，具体如表5所示。
表5dna保存液组分的选择
2、实验方法
选取已鉴定为p16基因发生甲基化修饰的肺癌组织样本，提取dna，平均分为9个组，按表5的设计添加各组dna保存液或depc水，制备得到各组p16基因甲基化dna样品(即p16基因阳性参考品)，其中，样品中dna保存液的组分金精三甲酸铵盐、甘氨酸和苯丁抑制素盐酸盐摩尔浓度同实施例4。实验开始前对各组样品进行dna浓度测定，并记录。然后将各组样品保存在-20℃条件保存2周，利用同实施例8所述方法计算各组样品中dna的降解率。
3、实验结果
实验结果如表6所示：
表6不同组分组成的dna保存液对游离dna保存效果的实验结果
由上述实验结果可知，本发明提供的dna保存液组分同时包含金精三甲酸铵盐、甘氨酸和苯丁抑制素盐酸盐时(实验组1)才能显著提高dna的稳定性，有效防止其在保存过程中的降解。本发明dna保存液的组分是发明人经过大量研究和统计分析得出的，缺少其中任何一种或两种组分(对照组1～6)，或者将甘氨酸替换为其他类型的氨基酸(对照组8)都不能实现本发明的效果。
实施例12
本发明dna保存液，包含金精三甲酸铵盐、甘氨酸和苯丁抑制素盐酸盐；且所述金精三甲酸铵盐、甘氨酸和苯丁抑制素盐酸盐的摩尔比为(100～500)：(50000～150000)：(0.02～0.06)。为了研究组分的使用比例对dna保存效果的影响，本实施例对dna保存液组分的使用比例进行了研究。
1、实验设计
为了研究组分使用比例对dna保存液保存效果的影响，设计实验组2～4和对照组8～10，具体如表7所示。
表7组分的使用比例
2、实验方法
选取已鉴定为p16基因发生甲基化修饰的肺癌组织样本，提取dna，平均分为6个组，按表7的设计添加各组dna保存液或depc水，制备得到各组p16基因甲基化dna样品(即p16基因阳性参考品)。实验开始前对各组样品进行dna浓度测定，并记录。然后将各组样品保存在-20℃条件保存2周，利用同实施例8所述方法计算各组样品中dna的降解率。
3、实验结果
实验结果如表8所示：
表8组分的使用比例对dna保存液保存效果的实验结果
由上述实验结果可知，本发明提供的dna保存液中金精三甲酸铵盐、甘氨酸和苯丁抑制素盐酸盐的摩尔比为(100～500)：(50000～150000)：(0.02～0.06)时可有效防止dna在保存过程中的降解(实验组2～4)。本发明dna保存液组分的使用比例是发明人经过大量研究和统计分析得出的，只有在本发明范围内的使用比例才能使dna保存液具有很好的保存效果，不在本发明范围内组分使用比例的增加或减少均会显著降低本发明dna保存液的保存效果，提高保存过程中dna的降解率(对照组8～9)。其他不在本发明比例范围内组分使用量对dna保存液保存效果的影响实验结果与本实施例类似，具体数据省略。
实施例13
本发明参考品中dna保存液的组分金精三甲酸铵盐摩尔浓度为100-500μm，甘氨酸摩尔浓度为50-150mm，苯丁抑制素盐酸盐摩尔浓度为20-60nm。为了研究参考品中dna保存液组分的摩尔浓度对保存效果的影响，本实施例对参考品中dna保存液组分的摩尔浓度进行了研究。
1、实验设计
以金精三甲酸铵盐为例，研究dna保存液组分在样品中的摩尔浓度对保存效果的影响，设计实验组5～8和对照组11～13，具体如表9所示，样品中甘氨酸摩尔浓度和苯丁抑制素盐酸盐摩尔浓度同实施例6。
表9金精三甲酸铵盐在样品中的摩尔浓度设计
2、实验方法
选取已鉴定为p16基因发生甲基化修饰的肺癌组织样本，提取dna，平均分为7个组，按表9的设计添加dna保存液各组分或depc水，制备得到各组p16基因甲基化dna样品(即p16基因阳性参考品)。实验开始前对各组样品进行dna浓度测定，并记录。然后将各组样品保存在-20℃条件保存2周，利用同实施例8所述方法计算各组样品中dna的降解率。
3、实验结果
实验结果如表10所示：
表10样品中金精三甲酸铵盐摩尔对保存效果的影响实验结果
由上述实验结果可知，本发明dna保存液的组分金精三甲酸铵盐在样品中的摩尔浓度为100～500μm时可有效提高dna的稳定性，防止其在保存过程中的降解(实验组5～8)，其中，当金精三甲酸铵盐在样品中的摩尔浓度为300μm时，保存效果最好(实验组8)。本发明dna保存液各组分在样品中的摩尔浓度是发明人经过大量研究和统计分析得出的，只有在本发明范围才能使取得很好的保存效果，不在本发明范围内的dna保存液组分摩尔浓度的增加或减少均会显著降低本发明dna保存液的保存效果，提高保存过程中dna的降解率(对照组11～12)。样品中甘氨酸摩尔浓度和苯丁抑制素盐酸盐摩尔浓度对dna保存效果的影响实验结果与本实施例类似，具体数据省略。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。