专利名称：一种利用血清痕量基因组dna进行hla基因分型的方法
技术领域：
本发明涉及一种以血清为样本，利用血清痕量基因组DNA进行HLA基因分型的方 法，特别涉及应用序列特异性引物聚合酶链式反应(SSP-PCR)从血清痕量基因组DNA中进 行人类白细胞抗原I类分子(HLA-I)HLA-A2、All和A24基因分型的方法。
背景技术：
人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)基因是位于人类第6号染色体 短臂上的一组紧密连锁的基因群。这些基因编码产物不但决定着宿主的组织相容性，而且 参与宿主的免疫应答和免疫调节。如，直接影响乙型肝炎病毒(HBV)感染患者的感染类型寸。传统HLA抗原分型方法是微量淋巴细胞毒试验，其误差率较高，而且成本昂贵，需 要昂贵的流式细胞仪等专门仪器和特异性抗体而限制其应用。因个体HLA遗传学差异的本 质是在编码其抗原产物的基因水平上，所以HLA基因分型是HLA抗原分型最准确的方法。 目前常用的有3种(1)序列特异性引物(PCR-SSP)分型；(2)序列特异性寡核苷酸探针 (PCR-SSOP)分型；(3)测序分型。但是这三种基因分型方法均需要受试者新鲜抗凝全血作为检测样本，或者从受试 者分离出来的外周血单个核细胞(PBMC)中提取获得，样本较难获得和保存。而相比而言， 血清是相对容易获得的标本，但血清中基因组DNA含量非常低，作为检测分型的样本，有很 大的技术难度，对灵敏度和特异性要求相当高。如果能够克服技术难点，从血清中残存的痕量基因组DNA中进行PCR为基础的分 型，将极大增加HLA抗原分型的便利。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用血清为样本，利用血清痕量基因组DNA进行HLA-A 分型的方法。本发明提供了一种从血清提取痕量DNA，运用巢式PCR方法进行HLA-A2，All, A24 基因型分型的方法。本发明的技术方案如下一种以血清为样本进行HLA基因分型的方法，其特征是将血清裂解释放DNA，乙 醇沉淀提取DNA，应用序列特异性引物巢式PCR方法扩增出HLA基因外显子2和外显子3的 DNA序列进行HLA基因分型；其中，外引物具有SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的核苷酸 序列，内引物具有SEQ ID NO :3 NO :8所示的核苷酸序列；且在PCR反应时，加入Pfu DNA 聚合酶和普通Taq DNA聚合酶。所述裂解可采用少量血清用异硫氰酸胍/LiC12裂解释放DNA ；所述扩增前，调整内外引物的浓度，能够克服低模板对扩增效率带来的不利影响， 用少量血清(100 μ 1)中残留的痕量基因组DNA就可以实现HLA-A分型的目的。第一轮内外引物浓度5倍稀释，终浓度为20nmol/L ；第二轮内外引物浓度不稀释，终浓度为IOOnmol/
L0为达到更好的效果，本发明在PCR反应液体系预先加入橙黄G，可免除常规电泳时 另外加上样缓冲液的步骤，对PCR反应无任何干扰，使得对PCR产物的鉴定简便省时。在PCR反应体系中以体积比1 10混合加入Pfu DNA聚合酶和普通Taq DNA聚 合酶，既提高了扩增的特异性，降低了错配率，又显著降低了成本(Pfu/Taq酶混合物的成 本约为进口高保真耐热DNA耐合酶的1/10，而反应效率基本一致)。本发明在HLA-A基因内含子区设计了通用的第一轮引物，然后利用HLA-A基因型 间不同单核苷酸多态性设计不同的3’末端特异性引物，不同的基因型设计不同长度的PCR 产物片段，并且把个别HLA-A基因型放在同一 PCR管中进行分型，然后利用琼脂糖凝胶电泳 分析不同的基因型。本发明的有益效果是1、灵敏度高样本用量少，仅100 μ 1血清便可获得HLA-A型特异性的目的片段。2、准确率高体系中加入Pfu DNA聚合酶与普通Taq酶，既能达到校正功能，又可 减少成本，可进一步降低错配率。1)经与PCR产物直接测序法(金标准)比较，符合率达到98. (见实施例2)， 而传统的血清学流式分型方法与PCR产物直接测序法(金标准)比较，符合率为91. 1%。2)和传统血清型 HLA 低分辨率分型(Hurley CK, et al. The relationship betweenHLA-B45 and B*5002 in the five major U. S. population groups[J]. Tissue Antigens, 2000, 55 (4) =352-358)相比，本发明的分型方法错配率小于2%。3、减少了操作步骤PCR反应液中直接加入橙黄G，PCR产物直接电泳即可，省去常 规电泳样品另外加上样缓冲液的步骤，省时。4、成本低病毒提取和PCR反应所需主要试剂可采用国产试剂，检测成本降低，易 于在临床及实验室开展。
图1是HLA_A2、A11、A24三种基因型扩增结果；图2是不同诊断的乙型肝炎患者HLA-A纯合与杂合比较。
具体实施例方式实施例1 巢式PCR技术扩增血清中HLA-A2、All和A24基因进行基因型分型扩增引物设计从GenBank中选取114条包含HLA-A基因外显子2和外显子3的 序列，主要包括中国人特有的HLA-Al 1，HLA-A2和HLA-A24基因序列，用Vector NTI软件进 行比对分析HLA-A基因序列在内含子1和内含子3中设计第一轮PCR通用引物如下第一 轮产物片段长度为646bp，包含外显子2和外显子3的全部序列；第二轮根据外显子中不同 基因型间不同的SNP设计特异性的上下游引物，引物扩增不同长度的PCR片段来区分HLA-A 的基因型，由于A2和A24PCR产物差别在IOObp以上能够在琼脂糖凝胶电泳上很好的分离 开，所以我们把A2和A24放在同一 PCR管中，更好的节约了成本和时间，大大提高了检测效 率。
SEQ ID NO 1 8分别对应外弓|物上游、下游和内弓丨物上游、下游，见表1。表1扩增HLA-A基因用于基因型分型所设计的内外引物及位置 以下所用的实验材料，如Pfu DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶均为北京天恩泽基因 科技有限公司产品。病毒DNA提取试剂盒北京天恩泽基因公司生产的病毒DNAout，从患 者血清中提取病毒DNA模板。第一轮PCR反应(总体系25 μ L)1、HLA-A基因扩增片段646bp
2 XMix Buffer (预加 0. 3%橙黄 G)12. 5μ L
1 5 稀释的 TTup2(10ymol/L)0. 25 μ L
1 5 稀释的 TTdown2(10ymol/L)0. 25 μ L
Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 50 μ L
Pfu DNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 05 μ L
14. 0μ L
模板DNAll.OyL
说明
1、巢式PCR第一轮反应时，25 μ L标准反应体系中，外引物浓度配置成IOymol/ L的储存液，用水稀释5倍后取0. 25 μ L加入25 μ L反应体系中，使引物终浓度调整至 20nmol/L。2、为提高反应特异性，体系中加入普通Taq DNA聚合酶(终浓度达到0. IU/μ L) 的同时按照10 1的比例加入Pfu DNA聚合酶(终浓度达到0. OlU/ μ L)。3、第一轮PCR反应参数94"C 5min 预变性，94"C 15s，62°C 15s，72°C 30s 30 个循环，72°C 5min，68°C 5min 最后降到 4°C。第二轮PCR反应(总体系25 μ L)将第一轮PCR产物分别分到两管中进行HLA-A基因型分型管1 :HLA-A2 和 A24 基因扩增片段487bp 和 371bp2 X Mix Buffer (预加 0. 3% 橙黄 G)12. 5μ LH2O5. 5μ LA2up2+A24up2 (10 μ mol/L)各 0· 25 μ LA2down2+A24down3 (10 μ mol/L)各 0· 25 μ LTaqDNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 50 μ LPfu DNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 05 μ L_20. 0μ L模板DNA (第一轮 PCR 产物)5· 0 μ L管2 =HLA-All基因扩增片段414bp2 X Mix Buffer (预加 0· 3% 橙黄 G)12. 5μ LH2O5. 5μ LAllup2(10ymol/L)0. 25 μ LAlldown2(10ymol/L)0. 25 μ LTaq DNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 50 μ LPfu DNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 05 μ L_20. 0μ L模板DNA (第一轮 PCR 产物)5· 0 μ L说明1、巢式PCR第一轮25 μ L产物取5 μ L作为第二轮PCR的模板，第二轮PCR引物浓 度配置成 ο μ mol/L的储存液，取0. 5 μ L加入25 μ L体系中，使终浓度为200nmol/L。2、第二轮 PCR 反应参数94°C 3min 预变性，94°C 10s，60°C 10s，72°C 20s 35 个循 环，72°C 5min，68°C 5min 最后降到 4°C。取5 μ L PCR终产物，用2 %琼脂糖凝胶进行电泳。结果见图1，经两轮巢式PCR可以成功利用PCR产物片段的大小经电泳分辨出 HLA-A 的三种基因型HLA-A2、A11、A24。
实施例2巢式PCR检测HBV感染患者血清中HLA-A基因分型对2005年-2007年到解放军第302医院就诊的709例乙型肝炎患者血清样本进 行血清痕量PCR分析HLA-A基因型，分析结果如下病例乙型肝炎诊断标准符合2000年西安病毒性肝炎诊断标准中华医学会感染 病和寄生虫病学会；中华肝脏并学会病毒性肝炎诊断和治疗标准.中华肝脏病杂志2000 ； 6 =324-329.，709例患者中急性乙型肝炎患者(AHB) 294例，慢性肝炎患者(CHB) 286例，慢 性重型肝炎患者(ACLF) 129例；男女分别为240/54、252/34和106/23例，平均年龄分别为 36. 35士 12. 39,39. 92士 12. 69 和 45. 88士 12. 10 岁。HBeAg 阳性率分别为 25. 7%,59. 0%禾口 35. 4%，转氨酶(ALT)水平分别为 1328(20,7932)、297. 0(13，2924)和 182. 5 (12，3773) IU/ L，HBV DNA 载量(10 为底对数值)3. 87士 1.39、6. 06士 1.44 和 5. 98士4. 811og 拷贝 /mL，此 项检测获得解放军302医院医学伦理委员会的批准。操作方法过程实验方法第一轮PCR反应(总体系25 μ L)1、HLA-A 基因扩增片段646bp2 X Mix Buffer (预加 0. 3% 橙黄 G)12. 5μ L1 5 稀释的 TTup2(10ymol/L)0. 25 μ L1 5 稀释的 TTdown2(10ymol/L)0. 25 μ LTaq DNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 50 μ LPfu DNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 05 μ L_14. 0μ L模板DNAll.OyL第一轮PCR反应参数94°C 5min 预变性，94"C 15s，62°C 15s，72°C 30s 30 个循环，72°C 5min，68°C 5min 最后降到 4°C。第二轮PCR反应(总体系25 μ L)将第一轮PCR产物分别分到两管中进行HLA-A基因型分型管1 :HLA-A2 和 A24 基因扩增片段487bp 和 371bp2 X Mix Buffer (预加 0. 3% 橙黄 G)12. 5μ LΗ205· 5 μ LA2up2+A24up2 (10 μ mol/L)各 0· 25 μ LA2down2+A24down3 (10 μ mol/L)各 0· 25 μ LTaq DNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 50 μ LPfu DNA 聚合酶(5U/μ L)0. 05 μ L_20. 0μ L模板DNA (第一轮 PCR 产物)5· 0 μ L
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管2 =HLA-All基因扩增片段414bp2 X Mix Buffer (预加 0. 3% 橙黄 G)12. 5μ LΗ205. 5μ LAllup2(10ymol/L)0. 25 μ LAlldown2(10ymol/L)0. 25 μ LTaq DNA 聚合酶(5U/μ L)0. 50 μ LPfu DNA 聚合酶(5U/μ L)0. 05 μ L_20. 0μ L模板DNA (第一轮 PCR 产物)5· 0 μ L第二轮PCR 反应参数94°C 3min 预变性，94°C 10s，60°C 10s，72°C 20s35 个循环， 72°C 5min，68°C 5min 最后降到 4°C。结果不同诊断HLA-A基因分型及其基因型纯合杂合分析按照临床不同的诊断 标准将709例乙型肝炎患者分为3组急性肝炎(AHB)、慢性肝炎(CHB)和慢性重型肝炎 (ACLF)。对应每组HLA-A02、All和A24以及其杂合/纯和检出率如表2。表2 709例乙型肝炎患者HLA-A基因分型以及杂合/纯和分析 结果提示该方法灵敏度高，检出阳性率为91. 4%;所得样品PCR产物中有260例 (占总样本的36%)进行测序验证，其中有5例和电泳分型不一致，准确率达98. 1%。统 计结果显示①随着病毒性乙型肝炎诊断的加重，患者中HLA-All等位基因的比率不断降 低且有统计学意义(P = 0.001)；②同时我们发现急性乙型肝炎(AHB)患者中HLA-A2、A11 和A243个等位基因杂合的比率要高于乙型肝炎慢性化(CHB和ACLF)的患者，而且有统计 学意义(P = O. 009)(如图2)。
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总之，本发明从血清中提取残存的痕量人类基因组DNA运用改良的SSP-PCR方法 进行HLA-A基因型分型，具有灵敏度高，准确性好，成本低等特点，对目前的HLA-A基因分型 技术提供新的补充和选择。
权利要求
一种以血清为样本进行HLA基因分型的方法，其特征是将血清裂解释放DNA，乙醇沉淀提取DNA，应用序列特异性引物巢式PCR方法扩增出HLA基因外显子2和外显子3的DNA序列进行HLA基因分型；其中，外引物具有SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的核苷酸序列，内引物具有SEQ ID NO3～NO8所示的核苷酸序列；且在PCR反应时，加入Pfu DNA聚合酶和普通Taq DNA聚合酶。
2.权利要求1所述的方法，所述裂解是少量血清用异硫氰酸胍/LiC12裂解释放DNA。
3.权利要求1所述的方法，所述基因扩增前，调整内外引物的浓度，第一轮内外引物浓 度5倍稀释，终浓度为20nmol/L ；第二轮内外引物浓度不稀释，终浓度为lOOnmol/L。
4.权利要求1所述的方法，所用的PfuDNA聚合酶与普通Taq DNA聚合酶的体积比是 1 10。
5.权利要求1所述的方法，在PCR反应之前，在反应体系中预先加入橙黄G。全文摘要
一种以血清为样本，利用血清痕量基因组DNA进行HLA基因分型的方法。采用少量血清裂解提取DNA，设计特异性引物运用巢式PCR技术，经两轮巢式PCR可以成功利用PCR产物片段的大小经电泳分辨出HLA-A的三种基因型。本发明以血清为分析样本，极大增加了HLA抗原分型的便利。
文档编号C12Q1/68GK101914622SQ20101025876
公开日2010年12月15日 申请日期2010年8月19日 优先权日2010年8月19日
发明者刘妍, 徐东平, 戴久增, 李晓东, 王琳, 王耀, 许智慧, 钟彦伟 申请人:中国人民解放军第三〇二医院