本发明涉及蛋白提纯领域，特别是一种纤维级甲醇蛋白的工业化提纯方法。
背景技术：
甲醇蛋白是以甲醇和无机盐为主要原料，经液态通风发酵并从发酵液中分离酵母菌体，制得的一种单细胞蛋白。甲醇蛋白粗蛋白含量超过50%，氨基酸均衡，营养价值较高，但目前尚不能应用于饲料、食品等行业，开发甲醇蛋白下游产品，寻求甲醇蛋白新的应用领域，对于解决甲醇产能过剩问题，减少环境污染，发展国民经济、保护生态环境及促进相关行业的良性发展具有深远的意义。
甲醇蛋白是以甲醇为主要基质进行生物发酵而生产的一种微生物单细胞蛋白质，为巴斯德毕赤酵母菌体蛋白，该酵母细胞粒径大，细胞壁厚，细胞难以破碎。生物酶破碎是目前主流的一种比较环保、高效的细胞破碎方法。常用的生物酶有溶菌酶、蜗牛酶等，但溶菌酶对毕赤酵母细胞壁基本不起作用，细胞破碎率低，不能满足要求。蜗牛酶破壁效率虽高但成本较高，易失活，不适于在工业化生产中应用。
技术实现要素：
针对上述情况，为克服现有技术缺陷，本发明之目的就是提供一种纤维级甲醇蛋白的工业化提纯方法，可有效解决毕赤酵母细胞壁难以破碎，破碎率低，易失活，甲醇蛋白提纯困难的问题。
本发明解决的技术方案是，一种纤维级甲醇蛋白的工业化提纯方法，具体步骤如下:
1）、发酵液分离、菌体洗涤
a、甲醇蛋白发酵液中加入与甲醇蛋白发酵液等重量的脱盐水稀释、混匀，进入高速碟式离心机分离，得重相a；
b、重相a中加入与重相a等重量的脱盐水稀释、混匀，再次进入高速碟式离心机进行离心分离，得重相b，重相b的质量浓度为50%；
2）、细胞裂解液
方法是，取重相b总重量1.5%的氢氧化钠加入氢氧化钠两倍重量的脱盐水配制成氢氧化钠溶液；取重相b总重量5%的脱盐水，加入重相b总重量0.6%的十二烷基硫酸钠，边加热边搅拌，加热到60℃，搅拌维持10分钟，直至十二烷基硫酸钠完全溶解，溶液澄清透明，然后加入重相b总重量0.25%的亚硫酸氢钠，搅拌均匀，得混合溶液，将氢氧化钠溶液加入到混合溶液中混匀，即得澄清透明的裂解液；将裂解液加入到重相b中，同时添加脱盐水直至得到质量浓度30%的重相c；
3）、将质量浓度30%的重相c用高压均质机进行高压均质，均质压力120mpa以上，处理量800l/h，此步骤重复两遍，第一遍细胞破碎率可达50%以上，第二遍细胞破碎率可达到85%以上，即得细胞破碎液；
4）、细胞破碎液冷却至25-30℃，用质量分数为18%的盐酸溶液调ph值至8.0-9.0；作用是，在此碱性环境中，使一部分无法在湿法纺丝中应用的小分子蛋白质析出；所述的质量分数为18%的盐酸溶液的制备方法是，用质量分数36%的盐酸溶液加入等体积的脱盐水，混合而成；所述的质量分数36%的盐酸溶液为洛阳昊华化学试剂有限公司生产；
5）、将4）步骤得到的ph值8.0-9.0的细胞破碎液用高速碟式离心机离心，收集上清，得到分子量为8-12万的蛋白质溶液；
6）、将5）步骤得到的蛋白质溶液，调ph值至4.2-4.3，静置2-3h沉淀，部分蛋白质达到等电点沉淀析出，将沉淀物用高速碟式离心机分离，收集得重相蛋白质d；
7）、将重相蛋白质d加脱盐水混合均匀，脱盐水的加入量为重相蛋白质d重量的1.5倍，经高速碟式离心机离心，收集得重相蛋白质e,此步骤重复2遍，以洗脱十二烷基硫酸钠及杂质，得洗脱后的重相蛋白质e（即将重相蛋白质d加脱盐水混合均匀，脱盐水的加入量为重相蛋白质d重量的1.5倍，经高速碟式离心机离心，收集得重相蛋白质e后，再将重相蛋白质e加脱盐水混合均匀，脱盐水的加入量为重相蛋白质e重量的1.5倍，经高速碟式离心机离心，收集得洗脱后的重相蛋白质e）；
8）、将7）步骤所得洗脱后的重相蛋白质e用氢氧化钠（naoh）水溶液调ph至13-14，蛋白在碱性条件下溶解，获得蛋白碱溶液；所述的氢氧化钠（naoh）水溶液为氢氧化钠（naoh）和水（h2o）以重量比为1.5：1进行混合制成；
9）、将8）步骤所得蛋白碱溶液烘干，即得纤维级甲醇蛋白；经凯式定氮仪测定蛋白含量，粗蛋白含量为90%以上；
所述的高速碟式离心机均为现有技术；
所述的甲醇蛋白发酵液为现有技术，如专利号为201310001734.7中制备的发酵液：（1）、摇瓶种子培养：将甘油管保藏的巴斯德毕赤酵母hgd-01的菌株0.5ml接种至ypd试管斜面培养基上，30℃培养48小时，即得斜面种子，所述的ypd试管斜面培养基是由重量百分比计的1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖、2%琼脂和余量的水混合在一起组成；用无菌水将斜面种子全部冲洗下来，以ypd液体培养基体积1%～5%的接种量接入到ypd液体培养基的中，摇床振荡培养，培养温度30℃，摇床转速220rpm，培养24～30小时，菌体od600达到3～5，获得摇瓶种子，所述的ypd液体培养基是由重量百分比计的1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖和余量的水混合在一起组成；（2）、一级种子培养：a、一级种子培养在50l的发酵罐中进行，步骤如下：按步骤（1）所述方法在50l罐中配制30l的ypd液体培养基，打开蒸汽阀，使蒸汽进发酵罐夹套层，对ypd液体培养基进行灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间30min，对ypd液体培养基灭菌的同时，对空气过滤器和取样口进行灭菌，灭菌10min即可，灭菌结束后，打开进气阀，向发酵罐中通入无菌空气，使罐体内空气压力一直要高于罐体外大气压，打开冷却水阀门，使冷却水进发酵罐夹套层，对ypd液体培养基进行降温，当ypd液体培养基温度降至25-35℃时，开始接种；
b、摇瓶种子1000ml从50l发酵罐接种口倒入，随后控制发酵温度在28～30℃，转速150rpm，溶氧40%～50%，培养20～24h后，得一级种子；（3）、二级种子培养：二级种子培养在5m3发酵罐中进行，二级种子培养基采用bsm液体培养基，步骤如下：5m3发酵罐中装bsm液体培养基体积为3m3；所述的bsm液体培养基为：质量浓度85%磷酸15l/m3，二水硫酸钙0.4kg/m3，硫酸钾8kg/m3，七水硫酸镁6kg/m3，甘油36kg/m3和微量元素溶液3l/m3加水制成，即bsm液体培养基为质量浓度85%磷酸15l，二水硫酸钙0.4kg，硫酸钾8kg，七水硫酸镁6kg，甘油36kg和微量元素溶液3l加水至1m3；所述的微量元素溶液为：五水硫酸铜14g/l，碘化钾0.08g/l，一水硫酸锰4g/l，二水钼酸钠0.1g/l，硼酸0.1g/l，六水合氯化钴1g/l，氯化锌36g/l、七水合硫酸亚铁65g/l和质量浓度为98%的浓硫酸5ml/l加水制成，即微量元素溶液为五水硫酸铜14g，碘化钾0.08g，一水硫酸锰4g，二水钼酸钠0.1g，硼酸0.1g，六水合氯化钴1g，氯化锌36g、七水合硫酸亚铁65g和质量浓度为98%的浓硫酸5ml加水至1l；用（2）a步骤中对ypd液体培养基相同的灭菌方法对bsm液体培养基进行灭菌，灭菌完成后，用质量浓度为35%的氨水调bsm液体培养基ph值至4.8～5.0，然后将培养好的一级种子30l接种到3m3的bsm液体培养基中，接种量为1%，接种时二级种子罐罐压在0.01-0.03mpa，一级种子罐罐压在0.05-0.1mpa，通过空气压力将一级种子从一级种子罐压到二级种子罐中，接种完成后，保持二级种子罐温度30～32℃，通风比1：1～1.5vvm，罐压0.05mpa，ph5.0～5.5，培养24～30h，得二级种子；（4）、发酵罐甲醇蛋白生产：发酵培养基为与（3）步骤中的二级种子的bsm液体培养基相同的培养基，开启进料泵，调节进料阀门大小，以控制发酵培养基的进料速度为3～4m3/h，同时打开蒸汽阀门，将蒸汽与发酵培养基混合，使发酵培养基温度达到121-125℃，进入在层流罐中维持20min后，进入50m3发酵罐中，进料完毕后，关闭进料阀，并将50m3发酵罐温度维持在121℃30min，此时，用蒸汽对与50m3发酵罐相连的空气过滤器、发酵罐取样口、出料口、排气口管道进行灭菌，保证50m3发酵罐及与之相连管道呈无菌状态，灭菌结束后，对50m3发酵罐内的发酵培养基降温到30℃～35℃；用质量浓度为35%的氨水调发酵培养基至ph5.0，然后将二级种子以发酵培养基体积10%的接种量接种到50m3发酵罐内ph值为5.0的发酵培养基中开始发酵，发酵温度30～32℃，通风比1：1.5-2vvm，罐压0.04mpa，ph5.0～5.5，培养16-20h，罐内料液中的甘油消耗完，溶氧开始持续上升，罐内菌体od600达到36～40，湿重达到100～120g/l，向50m3发酵罐内流加甲醇，甲醇流加量为5～6克/升·小时，当溶氧高于60%以上时，加大甲醇流加量，最大流加量达到10～15克/升·小时，发酵过程中，每12小时补加一次微量元素溶液，每次流加20升，直至发酵结束，发酵72～84小时后，取样测定菌体湿重达350～400g/l，发酵结束，得发酵液。
本发明实现了毕赤酵母细胞的高效破壁和特定分子量蛋白的分离纯化，甲醇蛋白经过细胞破壁后，收率高，经过提取精制后蛋白分子量分布集中，粗蛋白含量90%以上，可满足蛋白纤维湿法纺丝的要求。
具体实施方式
以下结合实际情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
实施例1
1）、发酵液分离、菌体洗涤
a、300kg甲醇蛋白发酵液中加入300l脱盐水稀释、混匀，进入高速碟式离心机分离，得300kg重相a；
b、300kg重相a中加入300l脱盐水稀释、混匀，再次进入高速碟式离心机进行离心分离，得300kg重相b，重相b的质量浓度为50%；
c、所述的高速碟式离心机为基伊埃韦斯伐里亚分离机有限公司（gea）生产的，型号为hfc15-01-177，转速11500rpm，处理量2t/h，使用1.5mm喷嘴的高速碟式离心机；
2）、细胞裂解液
方法是，取4.5kg氢氧化钠加入9l脱盐水配制成氢氧化钠溶液；取15l脱盐水，加入1.8kg十二烷基硫酸钠，边加热边搅拌，加热到60℃，搅拌维持10分钟，直至十二烷基硫酸钠完全溶解，溶液澄清透明，然后加入0.75kg亚硫酸氢钠，搅拌均匀，得混合溶液，将氢氧化钠溶液加入到混合溶液中混匀，即得澄清透明的31.05kg裂解液；
将31.05kg裂解液加入到300kg重相b中，同时添加168.95l脱盐水混合均匀，即得质量浓度30%的重相c500kg；
3）、将重相c500kg用高压均质机进行高压均质，均质压力120mpa，处理量800l/h，此步骤重复两遍，即得细胞破碎液；第一遍细胞破碎率可达50%以上，第二遍细胞破碎率可达到85%以上；所述的高压均质机为型号ns3037h,最大工作压力：150mpa的geaniro高压均质机；
4）、细胞破碎液冷却至28℃，用质量分数为18%的盐酸溶液调ph值至9.0；作用是，在此碱性环境中，使一部分无法在湿法纺丝中应用的小分子蛋白质析出；所述的质量分数为18%的盐酸溶液的制备方法是，用质量分数36%的盐酸溶液加入等体积的脱盐水，混合而成，质量分数36%的盐酸溶液为洛阳昊华化学试剂有限公司生产；
5）、将4）步骤得到的ph值9.0的细胞破碎液用高速碟式离心机离心，收集上清，得到分子量为8-12万的蛋白质溶液；所述的高速碟式离心机为基伊埃韦斯伐里亚分离机有限公司（gea）生产的，型号：hfc15-01-177、喷嘴为0.5mm喷嘴、转速11500rpm、处理量0.5t/h的高速碟式离心机；
6）、将5）步骤得到的蛋白质溶液，调ph值至4.25，静置3h沉淀，部分蛋白质达到等电点沉淀析出，将沉淀物用高速碟式离心机分离，收集得重相蛋白质d；所述的高速碟式离心机为基伊埃韦斯伐里亚分离机有限公司（gea）生产的，型号：hfc15-01-177,使用0.5mm喷嘴，转速11500rpm，处理量0.5t/h的高速碟式离心机；
7）、将重相蛋白质d加脱盐水混合均匀，脱盐水的加入量为重相蛋白质d重量的1.5倍，经高速碟式离心机离心，收集得重相蛋白质e,此步骤重复2遍，以洗脱十二烷基硫酸钠及杂质，得洗脱后的重相蛋白质e；所述的高速碟式离心机为基伊埃韦斯伐里亚分离机有限公司（gea）生产的，型号：hfc15-01-177,0.5mm喷嘴，转速11500rpm，处理量0.5t/h的高速碟式离心机；
8）、将7）步骤所得洗脱后的重相蛋白质e用氢氧化钠（naoh）水溶液调ph至13.5，蛋白在碱性条件下溶解，获得蛋白碱溶液；所述的氢氧化钠（naoh）水溶液为氢氧化钠（naoh）和水（h2o）以重量比为1.5：1进行混合制成；
9）、将8）步骤所得蛋白碱溶液烘干，即得纤维级甲醇蛋白；经凯式定氮仪测定蛋白含量，粗蛋白含量为90.3%。
实施例2
1）、发酵液分离、菌体洗涤
a、甲醇蛋白发酵液中加入与甲醇蛋白发酵液等重量的脱盐水稀释、混匀，进入高速碟式离心机分离，得重相a；
b、重相a中加入与重相a等重量的脱盐水稀释、混匀，再次进入高速碟式离心机进行离心分离，得重相b，重相b的质量浓度为50%；
c、所述的高速碟式离心机为基伊埃韦斯伐里亚分离机有限公司（gea）生产的，型号：hfc15-01-177、喷嘴为0.5mm喷嘴、转速11500rpm、处理量0.5t/h的高速碟式离心机；
2）、细胞裂解液
方法是，取重相b总重量1.5%的氢氧化钠加入氢氧化钠两倍重量的脱盐水配制成氢氧化钠溶液；取重相b总重量5%的脱盐水，加入重相b总重量0.6%的十二烷基硫酸钠，边加热边搅拌，加热到60℃，搅拌维持10分钟，直至十二烷基硫酸钠完全溶解，溶液澄清透明，然后加入重相b总重量0.25%的亚硫酸氢钠，搅拌均匀，得混合溶液，将氢氧化钠溶液加入到混合溶液中混匀，即得澄清透明的裂解液；将裂解液加入到重相b中，同时添加脱盐水直至得到质量浓度30%的重相c；
3）、将质量浓度30%的重相c用高压均质机进行高压均质，均质压力120mpa以上，处理量800l/h，此步骤重复两遍，第一遍细胞破碎率可达50%以上，第二遍细胞破碎率可达到85%以上，即得细胞破碎液；所述的高压均质机为型号ns3037h,最大工作压力：150mpa的geaniro高压均质机；
4）、细胞破碎液冷却至25℃，用质量分数为18%的盐酸溶液调ph值至8.0；作用是，在此碱性环境中，使一部分无法在湿法纺丝中应用的小分子蛋白质析出；所述的质量分数为18%的盐酸溶液的制备方法是，用质量分数36%的盐酸溶液加入等体积的脱盐水，混合而成；所述的质量分数36%的盐酸溶液为洛阳昊华化学试剂有限公司生产；
5）、将4）步骤得到的ph值8.0的细胞破碎液用高速碟式离心机离心，收集上清，得到分子量为8-12万的蛋白质溶液；所述的高速碟式离心机为基伊埃韦斯伐里亚分离机有限公司（gea）生产的，型号为hfc15-01-177，转速11500rpm，处理量2t/h，使用1.5mm喷嘴的高速碟式离心机；
6）、将5）步骤得到的蛋白质溶液，调ph值至4.3，静置2h沉淀，部分蛋白质达到等电点沉淀析出，将沉淀物用高速碟式离心机分离，收集得重相蛋白质d；所述的高速碟式离心机为基伊埃韦斯伐里亚分离机有限公司（gea）生产的，型号为hfc15-01-177，转速11500rpm，处理量2t/h，使用1.5mm喷嘴的高速碟式离心机；
7）、将重相蛋白质d加脱盐水混合均匀，脱盐水的加入量为重相蛋白质d重量的1.5倍，经高速碟式离心机离心，收集得重相蛋白质e,此步骤重复2遍，以洗脱十二烷基硫酸钠及杂质，得洗脱后的重相蛋白质e；所述的高速碟式离心机为基伊埃韦斯伐里亚分离机有限公司（gea）生产的，型号为hfc15-01-177，转速11500rpm，处理量2t/h，使用1.5mm喷嘴的高速碟式离心机；
8）、将7）步骤所得洗脱后的重相蛋白质e用氢氧化钠（naoh）水溶液调ph至14，蛋白在碱性条件下溶解，获得蛋白碱溶液；所述的氢氧化钠（naoh）水溶液为氢氧化钠（naoh）和水（h2o）以重量比为1.5：1进行混合制成；
9）、将8）步骤所得蛋白碱溶液烘干，即得纤维级甲醇蛋白；经凯式定氮仪测定蛋白含量，粗蛋白含量为90.5%。
实施例3
1）、发酵液分离、菌体洗涤
a、甲醇蛋白发酵液中加入与甲醇蛋白发酵液等重量的脱盐水稀释、混匀，进入高速碟式离心机分离，得重相a；
b、重相a中加入与重相a等重量的脱盐水稀释、混匀，再次进入高速碟式离心机进行离心分离，得重相b，重相b的质量浓度为50%；
2）、细胞裂解液
方法是，取重相b总重量1.5%的氢氧化钠加入氢氧化钠两倍重量的脱盐水配制成氢氧化钠溶液；取重相b总重量5%的脱盐水，加入重相b总重量0.6%的十二烷基硫酸钠，边加热边搅拌，加热到60℃，搅拌维持10分钟，直至十二烷基硫酸钠完全溶解，溶液澄清透明，然后加入重相b总重量0.25%的亚硫酸氢钠，搅拌均匀，得混合溶液，将氢氧化钠溶液加入到混合溶液中混匀，即得澄清透明的裂解液；将裂解液加入到重相b中，同时添加脱盐水直至得到质量浓度30%的重相c；
3）、将质量浓度30%的重相c用高压均质机进行高压均质，均质压力120mpa以上，处理量800l/h，此步骤重复两遍，第一遍细胞破碎率可达50%以上，第二遍细胞破碎率可达到85%以上，即得细胞破碎液；
4）、细胞破碎液冷却至30℃，用质量分数为18%的盐酸溶液调ph值至8.0；作用是，在此碱性环境中，使一部分无法在湿法纺丝中应用的小分子蛋白质析出；所述的质量分数为18%的盐酸溶液的制备方法是，用质量分数36%的盐酸溶液加入等体积的脱盐水，混合而成；所述的质量分数36%的盐酸溶液为洛阳昊华化学试剂有限公司生产；
5）、将4）步骤得到的ph值8.0的细胞破碎液用高速碟式离心机离心，收集上清，得到分子量为8-12万的蛋白质溶液；
6）、将5）步骤得到的蛋白质溶液，调ph值至4.2，静置2.5h沉淀，部分蛋白质达到等电点沉淀析出，将沉淀物用高速碟式离心机分离，收集得重相蛋白质d；
7）、将重相蛋白质d加脱盐水混合均匀，脱盐水的加入量为重相蛋白质d重量的1.5倍，经高速碟式离心机离心，收集得重相蛋白质e,此步骤重复2遍，以洗脱十二烷基硫酸钠及杂质，得洗脱后的重相蛋白质e；
8）、将7）步骤所得洗脱后的重相蛋白质e用氢氧化钠（naoh）水溶液调ph至13，蛋白在碱性条件下溶解，获得蛋白碱溶液；所述的氢氧化钠（naoh）水溶液为氢氧化钠（naoh）和水（h2o）以重量比为1.5：1进行混合制成；
9）、将8）步骤所得蛋白碱溶液烘干，即得纤维级甲醇蛋白；经凯式定氮仪测定蛋白含量，粗蛋白含量为91.02%；
10）、实施例3中所述的高速碟式离心机均可用基伊埃韦斯伐里亚分离机有限公司（gea）生产的，型号：hfc15-01-177,0.5mm喷嘴，转速11500rpm，处理量0.5t/h的高速碟式离心机。
本发明采用裂解液诱导和机械方法破碎相结合的方式，破碎率高达85%，工艺流程简单，适于工业化生产，经过多次碱溶、洗脱、酸沉等工序对蛋白质分子量进行分级，得到的蛋白提纯精度高，粗蛋白含量高达90%以上，本发明制成的纤维级甲醇蛋白，经在蛋白纤维湿法纺丝中应用，可纺性强，制成甲醇蛋白纤维，依据gb/t6432-1994测得其蛋白质含量在8%左右，远高于国家标准1.5%(中华人民共和国纺织行业标准fzt54028-2010)。且使用本发明纤维级甲醇蛋白制成的甲醇蛋白纤维应用于纺织布料中加工成的高档衣服色泽亮丽、亲肤性好、吸湿利汗效果显著，有巨大的经济和社会效益。