一种用于烟气代谢物水解的酶反应器的制备及应用的制作方法

本发明涉及固定化酶反应器技术领域，特别涉及一种基于有机-硅胶杂化整体柱基质的固定化酶反应器的制备方法及应用。该固定化酶反应器可将传统的烟气代谢产物糖苷衍生物水解时间显著缩短，实现了糖苷衍生物的快速去糖基化过程。

背景技术：

有机-硅胶杂化整体柱相比有机整体柱或硅胶整体柱而言，具有制备简单、稳定性好、机械强度高等优点。因此，将有机-硅胶杂化整体柱发展为固定化酶反应器的基质材料已在色谱工作者中受到了越来越多的关注。

固定化酶反应器（imer）使酶在较长时间内可以反复使用，不仅酶的稳定性提高，而且易与底物和产物分开，水解效率增加，水解时间显著缩短。科研工作者发展了蛋白质组学领域内多种基质的酶反应器。文献报道指出，通过制备有机-硅胶杂化整体柱基质的胰蛋白酶反应器，将蛋白质水解时间缩短到2.5分钟，大大提高了水解效率，并将其成功与阳离子交换-反相二维液相色谱质谱在线联用，为实现大分子的高通量分离分析提供了必要条件。目前已有将脂肪酶、蛋白酶等多种酶以包埋、吸附、共价键合等方式固定在介孔材料、石墨烯、纳米颗粒或整体材料等基质载体上的报道，该技术不论在医药领域、化工领域、食品、能源等诸多领域已较为普及。

尼古丁与4-甲基亚硝胺-1-（3-吡啶）-1-丁酮（nnk）是烟草制品中非常重要的两种化合物。尼古丁在人体内被代谢成可天宁，并相继产生可天宁衍生的代谢产物，因此可天宁是评价吸烟剂量与曝露环境烟气量的生物标记物。nnk是尼古丁亚硝基化或微量烟碱亚硝基化形成的一种烟气致癌物，其在体内的代谢产物4-甲基亚硝胺基-1-（3-吡啶）-1-丁醇（nnal）及其糖苷肽衍生物（nnal-o-gluc），是研究nnk在人体内代谢过程中制毒与解毒机制非常有价值的接触生物标志物。在当前的研究中，总可天宁和nnal的分析需要在富集净化步骤前首先将其糖苷衍生物进行去糖基化，从而得到游离的可天宁与nnal。该过程可以通过酸碱水解或酶水解等方式进行，其中通过β-葡萄糖醛酸酶水解的方式应用较多。但是，这种传统的水解反应存在耗时较长（16-24h），水解效率较低等缺点。针对这个问题，本发明通过制备有机-硅胶杂化毛细管整体材料基质，固定相应的水解酶，从而实现对可天宁及nnk等糖苷衍生物的水解。

技术实现要素：

本发明的目的正是针对所述现有技术所存在的问题，而提供一种β-葡萄糖醛酸酶反应器的制备方法及应用，通过制备有机-硅胶杂化毛细管整体材料基质，固定相应的水解酶，从而实现对可天宁及nnk等糖苷衍生物的水解，水解时间可缩短至20分钟。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种用于烟气代谢物水解的酶反应器的制备方法，结合溶胶-凝胶法制备有机-硅胶杂化整体柱技术，在毛细管内形成通透性好、机械强度高的氨基修饰的多孔结构；以该氨基修饰的多孔结构为骨架，通过戊二醛偶联，将β-葡萄糖醛酸酶进行固定，制备得到β-葡萄糖醛酸酶反应器。具体步骤如下：

1).有机-硅胶杂化整体柱基质的制备

a、将聚乙二醇（peg）和尿素按照1:4-1:1质量比加入到1-10ml的醋酸溶液（摩尔浓度为0.01mol/l）中超声混合均匀后，再加入0.5-3ml硅酸甲酯（tmos）以及与硅酸甲酯体积比为1:9-1:2的γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷（γ-maps），在0℃-10℃水浴环境中磁性搅水解1-3h，制得澄清透明的混合液；

b、取500μla步骤制得的混合液，加入5-30mg的丙烯酰胺（aam）、以及丙烯酰胺量1:10-1:20的偶氮二异丁腈（aibn），在冰水中超声10-50min，制得预聚液；

c、将b步骤中预聚液超声除气后灌入预先经酸碱活化处理的毛细管中，两端封闭后置于30-60℃水浴中反应18-24h，之后采用甲醇与水分别洗涤得到有机-硅胶杂化整体柱基质；

2）.酶的固定

a、戊二醛的修饰：将体积浓度为1%-25%的戊二醛溶液连续通过上述整体柱基质中1-2h，采用ph值为6.8-7.4的磷酸盐缓冲液洗去残余的戊二醛，制得修饰有戊二醛的整体柱基质；

b、酶的固定：将含有氰基硼氢化钠（5mg/ml）的β-葡萄糖醛酸酶溶液(酶活为100u/ml-25000u/ml)连续通入修饰有戊二醛的整体柱基质中1-24h，实现β-葡萄糖醛酸酶的固定化，利用ph值为7.1-7.3的tris-hcl缓冲溶液通柱子过夜，即制得固定化β-葡萄糖醛酸酶反应器。

将所制备的酶反应器用于烟气代谢物水解，可将传统的烟气代谢产物糖苷衍生物水解时间显著缩短，实现了糖苷衍生物的快速去糖基化过程。

本发明方法具有如下特点：

（1）结合溶胶-凝胶法制备有机-硅胶杂化毛细管整体柱技术，现在毛细管内合成机械强度高、渗透性好具有氨基修饰多孔结构的杂化整体柱基质，基于氨基修饰的多孔结构为骨架，通过戊二醛偶联，将β-葡萄糖醛酸酶进行固定，制备得到β-葡萄糖醛酸酶反应器。

（2）本发明制备的反应器通透性好，具有较高的酶活，室温条件下在20分钟内即可快速酶解浓度为0.5mg/ml的nnk等糖苷衍生物的水解。

附图说明

图1为本发明制备固定化β-葡萄糖醛酸酶反应器的流程图。

图2为固定化酶反应器水解产物nnal提取离子流色谱图。

图3为固定化酶反应器水解产物nnal二级质谱图。

图4为标准品nnal的二级质谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施例说明本发明的固定化酶反应器的制备方法，并列举其在nnal-o-gluc酶解中的应用。

制备方法实施例1：

固定化酶反应器基质的制备:

(1)将800mg尿素、540mg聚乙二醇和5ml0.01mol/l醋酸溶液加入50ml的圆底烧瓶混合均匀后，在0℃冰水浴环境中再加入1.8ml硅酸甲酯和0.5mlγ-maps，磁性搅拌水解2.5h，制得澄清透明的混合液。

(2)取0.5ml步骤（1）所得混合液至1ml离心管中，加入1mgaibn即偶氮二异丁腈和15mgaam即丙烯酰胺，继续在冰水中超声30min，制得预聚液。

(3)将步骤（2）中制得的预聚液超声除气混合均匀后加入到预先经酸碱活化处理的毛细管中，两端封闭后置于40℃水浴中反应成柱。成柱后利用水与甲醇洗去柱中未反应的预聚液，40℃水浴时间为16~20h；所述酸碱活化处理中酸即1mol/l盐酸溶液、碱即1mol/l氢氧化钠溶液，其用量与截取的毛细管的柱体积比为50:50:1。

(4)将体积百分数为10%戊二醛水溶液连续通过步骤（3）制得的有机-硅胶杂化整体柱1.5h；然后用摩尔浓度为0.05mol/l、ph值为7.0的磷酸盐缓冲液洗去残余的戊二醛，制得连有戊二醛的有机-硅胶杂化整体柱。

(5)在4℃环境下将含有2500u/ml的β-葡萄糖醛酸酶溶液（0.05mol/l磷酸盐缓冲液，ph=7.0，含有5mg/ml的氰基硼氢化钠）通入步骤（4）制得的整体柱中24h；用摩尔浓度为0.05mol/l，ph=7.0磷酸盐缓冲溶液将未键合的β-葡萄糖醛酸酶冲出，制得固定化的β-葡萄糖醛酸酶反应器；最后在制备好的酶反应器中注入0.05mol/l、ph值为7.1的tris-hcl缓冲溶液，于4℃下保存备用。

所述化学试剂的纯度均为分析纯及以上纯度。

制备方法实施例2

固定化酶反应器基质的制备:

(1)将600mg尿素、150mg聚乙二醇和5ml0.01mol/l醋酸溶液加入50ml的圆底烧瓶混合均匀后，在0℃冰水浴环境中再加入1.2ml硅酸甲酯和0.2mlγ-maps，磁性搅拌水解2.5h，制得澄清透明的混合液。

(2)取0.5ml步骤（1）所得混合液至1ml离心管中，加入1mgaibn即偶氮二异丁腈和17mgaam即丙烯酰胺，继续在冰水中超声30min，制得预聚液。

(3)将步骤（2）中制得的预聚液超声除气混合均匀后加入到预先经酸碱活化处理的毛细管中，两端封闭后置于40℃水浴中反应成柱。成柱后利用水与甲醇洗去柱中未反应的预聚液，40℃水浴时间为16~20h；所述酸碱活化处理中酸即1mol/l盐酸溶液、碱即1mol/l氢氧化钠溶液，其用量与截取的毛细管的柱体积比为50:50:1。

(4)将体积百分数为5%戊二醛水溶液连续通过步骤（3）制得的有机-硅胶杂化整体柱2h；然后用摩尔浓度为0.05mol/l、ph值为7.0的磷酸盐缓冲液洗去残余的戊二醛，制得连有戊二醛的有机-硅胶杂化整体柱。

(5)在4℃环境下将含有1500u/ml的β-葡萄糖醛酸酶溶液（0.05mol/l磷酸盐缓冲液，ph=7.0，含有5mg/ml的氰基硼氢化钠）通入步骤（4）制得的整体柱中24h；用摩尔浓度为0.05mol/l，ph=7.0磷酸盐缓冲溶液将未键合的β-葡萄糖醛酸酶冲出，制得固定化的β-葡萄糖醛酸酶反应器；最后在制备好的酶反应器中注入0.05mol/l、ph值为7.1的tris-hcl缓冲溶液，于4℃下保存备用。

所述化学试剂的纯度均为分析纯及以上纯度。

应用实施例

4-甲基亚硝胺基-1-（3-吡啶基）-正丁醇-o-β-葡糖苷酸钠盐（nnal-o-gluc）的水解

具体操作如下：将实施例1中制得的固定化β-葡萄糖醛酸酶反应器放置于室温环境下，通入30μl1.0mg/ml的nnal-o-gluc溶液，流速为0.3μl/min，流出的酶解产物a用1.5ml离心管接收；然后用30μl摩尔浓度为0.05mol/l、ph值为7.0的磷酸盐缓冲溶液以相同的流速通过酶反应器，将流出液b合并在接收酶解产物的离心管内。

将上述离心管内的溶液进行除盐处理用于lc-ms/ms测定。

具体操作如下：将1ml甲醇与1毫升0.1%甲酸水溶液对容量为1ml的hlb柱（watersoasishlbextractioncartridge）进行活化；然后在萃取仪呈关闭状态下在hlb柱中加入60μl水解溶液，加入1ml0.1%甲酸水溶液，打开阀门将溶液缓慢滴下；之后以相同体积的甲酸水溶液对柱子洗10遍；最后用80%乙腈水溶液洗脱柱子，接出洗脱液（共1ml）。除盐结束后，将洗脱液在常温下冻干3-5h；冻干后用0.1%甲酸水溶液复溶至20μl，转速为12000r/min条件下离心20min取上清液，进行lc-ms/ms分析。

对比分析图2、图3和图4可知，本实施例制得的固定化β-葡萄糖醛酸酶反应器可以成功水解nnal-o-gluc，产生nnal。