本发明涉及医学诊断领域，具体而言，涉及一种基于毛细管电泳的核酸分析方法及其应用。
背景技术：
毛细管电泳(capillaryelectrophoresis，ce)是离子或荷电粒子以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中组分之间的淌度或分配系数的差异，而实现高效、快速分离的一类电泳新技术。仪器装置包括高压电源、毛细管、检测器以及供毛细管两端插入且和电源相连的两个储液瓶。毛细管电泳的分离过程是典型的差速运动过程。混合物在迁移过程中，各样品分子因自身的速度不同，将逐渐分成不同的区带，快者前，慢者后。时间越长，区带越小、数目越多、距离越开，即分离越好。在分离通道的终点安装一种检测器，把分子通过终点的情况记录下来，即可得到电泳图谱。以最常用的毛细管区带电泳为例，毛细管和电极槽内充有相同组分和相同浓度的背景电解质溶液。样品从毛细管一端(进样端)导入，当毛细管两端加上一定的电压后，荷电质朝与其电荷极性相反的电极方向移动。同时，由于毛细管内壁与缓冲溶液接触的界面形成双电层，导致毛细管内的溶液在外加电场的作用下整体朝一个方向运动，即电渗流现象。由于电渗流的速度比电泳速度快5-7倍，因此毛细管电泳利用电渗流可将正、负离子和中性分子一起朝一个方向移动，而离子或荷电粒子迁移速度是电泳和电渗流速度的矢量和。由于样品各组分间迁移速度的不同，经过一定时间，各组分按其速度大小依次流出毛细管到达检测端进行检测，得到按时间分布的电泳谱图。用谱峰的迁移时间作定性分析；按其谱峰的高度或峰面积进行定量分析。
生命科学的迅猛发展对生物样品的分离分析提出越来越高的要求。因为生物样品种类繁多，结构复杂，样品量少，制备、浓缩、分离比较困难，分析工作量大，所以人们迫切希望找到高通量、高灵敏度、高效率的分析方法。毛细管电泳以其分离效率高，分析速度快，样品用量少，容易实现自动化等优点,在生物样品的分析方面发挥着重要的作用。毛细管电泳现在已应用到dna分析的众多方面，例如测序、基因突变分析、dna片断或pcr产物测定、基因表达、dna损伤分析、疾病诊断等。而mrna的直接分析相对比较困难，但也可以通过反转录成互补dna(cdna)进行分析。
然而现有技术中，在针对dna片断分析方法中，通常采用的是采集一个通道中基因片断所有碱基长度的信号进行分析的方法。由于大片断的迁移速率会明显小于小片断的迁移速度，所以对dna片断中的大片断进行分析时，需要耗时较长(一般为30分钟)，影响检测的时效。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一种基于毛细管电泳的核酸分析方法，该方法将待检测核酸分割为含有多个核酸片断并使用多通道毛细管电泳仪进行检测，通过限定各通道的电压从而起到了化整为零的效果，可以大幅度加快检测速度。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明涉及一种基于毛细管电泳的核酸分析方法，包括：
将待检测核酸分割为含有多个核酸片断的片断组合物，所述片断组合物带有荧光染料标记，使用多通道毛细管阵列电泳仪对所述片断组合物进行多通道同时检测，根据预设的每个通道所要检测的核酸片断的长度区间调整每个通道两端的电压大小，以使得各通道中所述预设的所要检测的核酸片断的电泳的迁移速率相同；
可选的，采集各通道的电泳结果信息并进行拼接，得到完整的待检测核酸信息。
根据电泳的迁移速率v与电泳的电场强度e存在关系式：
v＝kve
其中比例系数k＝q/(eam+b·6η·l)，q是片断的净电荷，a和b是分子量与分子半径之间的关系系数，η是电泳凝胶的粘度，l是毛细管长度。由式可见，基因片断的迁移速率与电泳电压以及片断的分子量有着直接的关系。
在现有技术中，检测核酸片断的方法为在同一个毛细管中，加上同一种电压让100-500bp大小的片断分开。根据上述公式可知，大片断的迁移速率会明显小于小片断的迁移速度，因此现有技术的方法会由于大片断的迁移速率低而拖慢整体的检测时间。
本发明通过在不同毛细管阵列通道的两端施加不同的电泳电压，使得各毛细管通道对不同长度的片断产生分离效果，并具有大致相同的迁移速率(由于ccd在进行检测信号时，是同时对各通道的激发光信号进行检测的，因此迁移速率越接近一致，则电泳时间就越短)；电泳结束后，再通过拼接算法，将各通道的电泳分离数据进行拼接，就可以最终得到完整的基因片断的信息。
根据本发明的一方面，本发明还提供了将如上所述的基于毛细管电泳的核酸分析方法在检测特定基因座的有无以及str分型中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
已有的基因片断分析中，对于500bp左右片断的分析，通常得到最终结果需要耗时30～40分钟，采用本发明可以缩短耗时，从30～40分钟缩短为约10分钟，极大地提高了分析效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明所提供方法的流程示意图；
图2为实施例2中采用8通道的毛细管阵列进行分析时的仪器示意图；
图3为实施例2中拼接前的电泳数据图；
图4为实施例2中拼接完成后的电泳数据图；
图5为本发明实施例2中所采用的拼接算法的具体步骤。
具体实施方式
本发明涉及一种基于毛细管电泳的核酸分析方法，包括：
将待检测核酸分割为含有多个核酸片断的片断组合物，所述片断组合物带有荧光染料标记，使用多通道毛细管阵列电泳仪对所述片断组合物进行多通道同时检测，根据预设的每个通道所要检测的核酸片断的长度区间调整每个通道两端的电压大小，以使得各通道中所述预设的所要检测的核酸片断的电泳的迁移速率相同；
可选的，采集各通道的电泳结果信息并进行拼接，得到完整的待检测核酸信息。
已有的基因片断分析中，通常得到最终结果需要耗时30～40分钟，采用本发明可以缩短耗时，从30～40分钟缩短为约10分钟，极大地提高了分析效率。
在检测时，各通道中还要加入分子量内标dna片断。
具体的，本发明所提供的基于毛细管电泳的核酸分析方法的操作流程图如图1所示：
步骤110：从样本中提取基因，制备相应的模板、引物，进行pcr扩增，得到待分析基因片断产物；
步骤120：将扩增后产物置于样品板的相应孔位，例如96孔板中，每一行的所有孔位放置同一产物样品；
步骤130：根据预设的每个通道所检测的片断长度，设置相应的电泳电压；
步骤140：进行毛细管电泳，利用激光诱导荧光，ccd成像采集各通道电泳结果；
步骤150：将各通道的结果进行拼接，得到完整的基因片断信息。
优选的，如上所述的基于毛细管电泳的核酸分析方法，当所述待检测核酸为dna时，所述将待检测核酸分割为含有多个核酸片断的片断组合物的方法为pcr法。
优选的，如上所述的基于毛细管电泳的核酸分析方法，当所述待检测核酸为rna时，先进行逆转录，再利用pcr法将待检测核酸分割为含有多个核酸片断的片断组合物。
优选的，如上所述的基于毛细管电泳的核酸分析方法，所述荧光染料标记于所述待检测核酸中的待检基因座上。
优选的，如上所述的基于毛细管电泳的核酸分析方法，将所述荧光染料标记于所述待检测核酸中的待检基因座上的方法为：将荧光染料标记在每个基因座中一条引物的5’端。
优选的，如上所述的基于毛细管电泳的核酸分析方法，扩增片断不重叠的基因座使用相同的荧光染料进行标记，扩增片断重叠的基因座使用不同的荧光染料进行标记。
荧光染料标记在每个基因座中一条引物的5’端，不同基因座引物标记不同的荧光标识物。经过扩增后的等位基因产物均携有荧光，电泳分离长度等位基因，用荧光分光系统对凝胶中等位基因进行检测。按照荧光的颜色区别基因座，根据片断的迁移率确定片断长度等位基因。
优选的，如上所述的基于毛细管电泳的核酸分析方法，所述荧光染料包括fam、vic、ned、pet、liz、dr110、tamra、rox、joe、hex、tet中的多种。
在实际操作时，可将不同的颜色的荧光染料进行组合，组合荧光染料的发射波长相差越大越好，通常20-30nm。组合的方法为本领域技术人员所公知。
优选的，如上所述的基于毛细管电泳的核酸分析方法，所述核酸片断的长度区间分区数目≤所述多通道毛细管阵列电泳仪的最大通道数目。
优选的，如上所述的基于毛细管电泳的核酸分析方法，所述待检测核酸的片断大小为100bp-20kb；更优选为100bp-3kb；更优选为100bp-500bp。
本发明提供了一种新颖的毛细管电泳思路，基于本发明所提供的方法，理论上待分析的核酸片断越大，缩短分析时间的效果就愈加明显。现有技术中多通道毛细管阵列电泳仪可提供多达96个通道，因此本发明可用于超大片断的分析。因此可知，本方法的分析的短板在于pcr的扩增长度，现有的longpcr的范围一般是3-20kb，如果要大于3kb的话就可以使用longtaq酶进行扩增。本领域最常见的是分析片断大小是100bp-500bp。
优选的，如上所述的基于毛细管电泳的核酸分析方法，所述采集各通道的电泳结果信息并进行拼接的步骤包括：
步骤110：对各通道中内标信号进行去噪和平滑处理；
步骤120：选择通道i，对内标信号进行峰识别，记录各峰的位置；
步骤130：将内标信号的峰位按照从小到大的顺序排列；
步骤140：根据各通道信号特征，选择相应的峰位，从而确定各通道的信号提取范围；
步骤150：提取通道i对应的范围内的除内标以外的其余信号；
步骤160：计算通道i的电泳电压vi与通道1电泳电压v1的比例ki；
步骤170：将步骤150提取的所述信号根据所述比例ki进行伸缩变换，以使得通道i与通道1的所述信号的一致；
步骤180：重复步骤120-170，得到所有通道经过伸缩后的结果；
步骤190：根据通道顺序，将各通道保存的结果进行拼接，得到完整的基因片断信息。
根据本发明的一方面，本发明还提供了将如上所述的基于毛细管电泳的核酸分析方法在检测特定基因座的有无以及str分型中的应用。
本发明所提供的基于毛细管电泳的核酸分析方法在进行str基因分型图谱的构建时，具有快速高效、灵敏准确的优点。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
在本实施例中，采用16通道的毛细管阵列进行检测总长度为1600bp大小的dna片断。
采用内标分子量为75-2000bp的来进行分子量标定。
将荧光染料标记在每个待分析基因座中一条引物的5’端，并通过pcr方法将待分析的dna片断分割为如下各通道对应的片断大小：
设计通道1中分离100-200bp的片断，通道2中分离300-360bp的片断，通道3中分离400-450bp的片断，通道4中分离500-600bp的片断，通道5中分离600-670bp的片断，通道6中分离700-820bp的片断，通道7分离850-900bp的片断，通道8分离910-950bp的片断，通道9分离980-1050bp的片断，通道10分离1000-1090bp的片断，通道11分离1100-1200bp的片断，通道12分离1220-1300bp的片断，通道13分离1350-1400bp的片断，通道14分离1410-1450bp的片断，通道15分离1450-1560bp的片断，通道16分离1550-1600bp的片断。
需要注意的是，各通道分离所检测核酸片断的设置直接可以重叠(例如考虑到引物设计和扩增难度不得不重叠)，也可以不重叠(已知基因座的大致位置，为提高检测效率，且不要去对整段dna片断都进行分析时，可以这么做)。
根据所设计的各通道的片断长度，利用电泳的迁移速率v与电泳的电场强度e的关系式计算相应的电泳电压，使得各通道内起始分离片断的迁移速率保持一致，即通道1中100bp片断，通道2中139bp片断，通道3中200bp片断，等的迁移速率是一致的。可选的，电泳结束后将各通道进行拼接，即可得到所感兴趣的片断电泳图。
实施例2
在本实施例中，采用8通道的毛细管阵列进行检测总长度为500bp大小的dna片断(如图2所示)。
采用liz-500分子量内标来进行分子量标定，其分子量分别为75、100、139、150、160、200、250、300、340、350、400、450、490、500。
将荧光染料标记在每个待分析基因座中一条引物的5’端，并通过pcr方法将待分析的dna片断分割为如下各通道对应的片断大小：
设计通道1中分离100-160bp的片断，通道2中分离160bp-200bp的片断，通道3中分离200-250bp的片断，通道4中分离250-300bp的片断，通道5中分离300-350bp的片断，通道6中分离350-400bp的片断，通道7分离400-450bp的片断，通道8分离450-500bp的片断。
根据所设计的各通道的片断长度，利用电泳的迁移速率v与电泳的电场强度e的关系式计算相应的电泳电压，使得各通道内起始分离片断的迁移速率保持一致，即通道1中100bp片断，通道2中139bp片断，通道3中200bp片断，等的迁移速率是一致的。本实施例中，通道1的电泳电压为-6.0kv,通道2的电压为-6.8kv,通道3的电压为-8.3kv，通道4的电压为-9.7kv，通道5的电压为-11.3kv，通道6的电压为-12.9kv，通道7的电压为-15.6kv，通道8的电压为-18.3kv，各通道的电泳图示意图如图3所示，再进行拼接，即可得到完整片断电泳图，如图4所示。拼接的具体步骤如图5所示。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。