长链非编码RNAST8SIA6-AS1及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程学和肿瘤学领域，尤其是一种长链非编码rnast8sia6-as1；本发明还涉及上述rna在肿瘤分子诊断和治疗中的用途。

背景技术：

我国近20年来恶性肿瘤呈现年轻化及发病率和死亡率走高的趋势。2015年度我国恶性肿瘤新发病例429.2万例，死亡281.4万例，严重影响人民健康。其中我国乳腺癌发病率增长速度是全球的两倍多，已经成为我国肿瘤登记地区女性恶性肿瘤的首位。另一方面，肺癌居我国恶性肿瘤死亡原因首位，而且发病率和死亡率持续升高。

目前临床上治疗肿瘤的方法主要是手术切除、放疗和化疗，但是放、化疗在杀死肿瘤细胞的同时，给人体正常细胞也带来了严重的损伤。因此科研工作者在不懈的探索，力图通过靶向治疗高效、特异地杀灭肿瘤细胞。目前临床上已有针对her2分子的靶向药物herceptin，针对vegf分子的靶向药物avastin等用于肿瘤的治疗，但总体来说少量的肿瘤靶向药物远远不能满足临床治疗的需求。同时，目前临床的肿瘤治疗存在一定的盲目性，只能对肿瘤进行分期分级或利用有限的分子标志物对肿瘤进行简单的分类，无法有效甄别预后好和预后差的肿瘤，部分预后较好的肿瘤可能被过度治疗，因此亟待开发用于判断肿瘤预后的分子标志物。

近年来以非编码rna为核心的表观遗传调控机制在生命活动中的作用越来越受到重视。长链非编码rna是一类转录本长度在200nt以上的非编码rna分子，通常被认为不具备编码蛋白功能。越来越多研究显示长链非编码rna的表达在不同的组织具有高度特异性，不仅其表达水平与肿瘤发展的不同阶段、不同组织学类型密切相关，可以作为肿瘤检测的特异标志物，而且长链非编码rna在肿瘤发生发展中的重要的调控作用也显示其作为肿瘤治疗靶点的可能性。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本申请的发明人经研究发现，长链非编码rnast8sia6-as1在多种肿瘤组织中表达水平明显高于相应正常组织，在乳腺癌和肺癌等肿瘤中st8sia6-as1高表达与患者预后差紧密相关，可以作为肿瘤预后判断的标志物。现有技术公开的资料中尚无st8sia6-as1作为疾病标志物的报道，对其功能目前也未见相关研究的报道。

作为本发明的第一个方面，本发明提供一种可作为肿瘤标志物和治疗靶点的长链非编码rna(即st8sia6-as1)，所述长链非编码rna对应的cdna的碱基序列如seqidno：1所示。本申请的发明人的研究表明，在乳腺癌和肺癌中st8sia6-as1的高表达与患者预后差明显相关，可作为肿瘤患者预后判断的标志物。本申请的发明人的研究表明，在乳腺癌和肺癌中敲降st8sia6-as1，体外和体内实验均显示能够显著诱导肿瘤细胞发生凋亡；鉴于st8sia6-as1在肿瘤组织特异的高表达，靶向抑制其表达可产生明显的抗肿瘤效果；鉴于正常组织细胞内st8sia6-as1表达量较低，抑制其表达未见明显凋亡和生长抑制作用，我们认为st8sia6-as1是一个高效、特异的肿瘤治疗靶标。

优选地，所述标志物为seqidno：1所示的碱基序列对应的mrna。

优选地，所述肿瘤为乳腺癌或肺癌。其中,肿瘤还可以是肝癌、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌等。

作为本发明的第二个方面，本发明提供了一种反义锁核酸(lockednucleicacid，lna)，所述反义锁核酸的碱基序列如seqidno：2或seqidno：3所示。

本申请的发明人采用多种碱基序列的锁核酸进行多次试验发现，只有通过如seqidno：2或seqidno：3所示的反义锁核酸在肿瘤细胞系和裸鼠移植瘤中对st8sia6-as1进行敲降，才能够明显减低st8sia6-as1的表达，并且引起肿瘤细胞的凋亡，从而达到抑制肿瘤生长的作用。应当说明的是反义锁核酸包括但不限于如seqidno：2或seqidno：3所示的碱基序列，只要反义锁核酸的碱基序列能敲降st8sia6-as1的表达水平即可。

作为本发明的第三个方面，本发明提供了一种能敲降上述长链非编码rna的表达水平的物质在制备治疗肿瘤的药物中的用途。

优选地，所述物质为以seqidno：4或seqidno：5所示的碱基序列为靶序列的反义锁核酸。优选地，所述反义锁核酸的碱基序列如seqidno：2或seqidno：3所示。

优选地，所述肿瘤为乳腺癌或肺癌。其中肿瘤还可以是肝癌、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌等。

作为本发明的第四个方面，本发明提供了一种治疗肿瘤的药物，所述药物中含有能敲降上述长链非编码rna的表达水平的物质。

优选地，所述药物中含有反义锁核酸，所述反义锁核酸的碱基序列如seqidno：2或seqidno：3所示。其中,seqidno：2所示的碱基序列与seqidno：1中的如seqidno：4所示的碱基序列(参见seqidno：1中具有下划线的序列)互补配对；seqidno：3所示的碱基序列与seqidno：1中的如seqidno：5所示的碱基序列(参见seqidno：1中具有下划线的序列)互补配对。

优选地，所述肿瘤为乳腺癌或肺癌。其中肿瘤还可以是肝癌、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌等。

作为本发明的第五个方面，本发明提供了上述长链非编码rna作为肿瘤患者预后判断的标志物的用途，所述肿瘤为乳腺癌或肺癌。

综上所述，本发明的有益效果为：

本发明中的st8sia6-as1作为新的肿瘤分子标志物，其高表达可预示肿瘤的不良预后；作为肿瘤治疗靶点，两条反义锁核酸均可特异敲降st8sia6-as1的表达水平，高效、特异地引起肿瘤细胞发生凋亡，抑制肿瘤生长。

附图说明

图1为长链非编码rnast8sia6-as1在乳腺癌细胞系中高表达的结果图；其中，左侧mcf-10a、76n、hmle为正常或永生化乳腺上皮细胞系，其余的右侧为乳腺癌细胞系；

图2为原位杂交检测st8sia6-as1在癌旁正常乳腺上皮中的表达结果图；其中右侧图为左侧图中矩形的放大图；

图3为原位杂交检测st8sia6-as1在与图2同一病例的乳腺癌组织中的表达结果图；其中，深颜色为st8sia6-as1杂交信号显色；右侧图为左侧图中矩形的放大图；

图4为长链非编码rnast8sia6-as1在多种肿瘤中表达增高的结果图；其中，每种肿瘤的上面为相应正常组织，下面为肿瘤组织，横轴为st8sia6-as1的相对表达量；

图5为在乳腺癌中，长链非编码rnast8sia6-as1(探针：242350_at)与肿瘤预后的关系示意图；

图6为在肺癌中，长链非编码rnast8sia6-as1(探针：242350_at)与肿瘤预后的关系示意图；

图7为反义锁核酸对长链非编码rnast8sia6-as1的敲降效果图；

图8为流式检测敲降长链非编码rnast8sia6-as1后对乳腺癌mcf7细胞凋亡的影响结果图；其中，流式图右侧上象限为晚期凋亡细胞，下象限为早期凋亡细胞；

图9为流式检测敲降长链非编码rnast8sia6-as1后对肺癌a549细胞凋亡的影响结果图；其中，流式图右侧上象限为晚期凋亡细胞，下象限为早期凋亡细胞；

图10显示图8中乳腺癌mcf7凋亡细胞的比例，mean±sd；

图11显示图9中肺癌a549凋亡细胞的比例，mean±sd；

图12为敲降长链非编码rnast8sia6-as1后抑制裸鼠乳腺癌mcf7细胞移植瘤的生长结果(肿瘤体积)图；

图13为敲降长链非编码rnast8sia6-as1后抑制裸鼠乳腺癌mcf7细胞移植瘤的生长结果(肿瘤重量)图；

图14为敲降长链非编码rnast8sia6-as1后抑制裸鼠肺癌a549细胞移植瘤的生长结果(肿瘤体积)图；

图15为敲降长链非编码rnast8sia6-as1后抑制裸鼠肺癌a549细胞移植瘤的生长结果(肿瘤重量)图。

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照j.sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及f.m.ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，johnwiley&sons，inc.，1995中所述的方法进行；凋亡检测试剂盒的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。

本发明旨在发现长链非编码rnast8sia6-as1作为新的肿瘤标志物和治疗靶点，其作为肿瘤诊断和/或治疗中的靶点具有特异性以及高效性，将为肿瘤预后判断和治疗恶性肿瘤提供有力的手段。

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1qpcr检测长链非编码rnast8sia6-as1的表达情况

1.1引物设计：从基因文库ncbi中查到长链非编码rnast8sia6-as1的序列，用primer软件设计引物如下：

forward：

5’-ttcagtggcatggttcagtc-3’(seqidno:6)

reverse：

5’-ctcagaagcgacagggtttc-3’(seqidno:7)

1.2qpcr检测：

如图1所示，长链非编码rnast8sia6-as1在乳腺癌细胞系中表达明显增高。

实施例2原位杂交检测长链非编码rnast8sia6-as1在正常乳腺以及乳腺癌组织中的表达情况

检测方法：石蜡包埋的乳腺组织制备组织芯片，进行常规石蜡切片，经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化。0.05％胰蛋白酶室温10min酶解蛋白，4％多聚甲醛20min进行固定，pbs冲洗。然后切片在预杂交液中处理2小时，弃预杂交液，用20nm的探针52℃孵育过夜。第二天用2×ssc洗2遍，每遍5min，含50％甲酰胺的2×ssc洗3遍，每遍25min，然后pbst洗5遍，每遍5min。用10％正常山羊血清室温封闭1小时，然后生物素标记抗地高辛抗体(1：1000)4度过夜。第三天pbst洗5遍，加入sa-ap(1：500)缓冲液室温孵育30min，再用pbst洗3遍，然后用ap缓冲液洗3遍，每遍5min。nbt/bcip显色2小时，再用pbst洗3遍，核快红复染10min,封片，显微镜下观察结果。

检测结果：如图2和3所示，在乳腺癌组织芯片中染色结果显示，长非编码rnast8sia6-as1的表达明显高于对应的正常组织。

实施例3

在lncrnator网站上查询各种肿瘤中长非编码rnast8sia6-as1的表达量的情况(数据来源于tcga)。

如图4显示长链非编码rnast8sia6-as1在多种肿瘤中表达增高。

实施例4

在km-plotter网站上查询长链非编码rnast8sia6-as1(探针：242350_at)在乳腺癌和肺癌中与肿瘤预后的关系。

如图5和6显示，在乳腺癌和肺癌中与长链非编码rnast8sia6-as1低表达组相比，高表达组的预后明显较差，p值具有统计学意义；表明长链非编码rnast8sia6-as1可作为乳腺癌和非小细胞肺癌的预后判断标志物。

实施例5

用反义锁核酸转染肿瘤细胞，24小时后qpcr检测反义锁核酸对长非编码rnast8sia6-as1的敲降效果。

如图7显示，两条反义锁核酸(如seqidno：2、seqidno：3所示)均能够明显减少长链非编码rnast8sia6-as1的表达量。

实施例6流式检测敲降长链非编码rnast8sia6-as1后对肿瘤细胞凋亡的影响

检测方法：采用靶向长链非编码rnast8sia6-as1的反义锁核酸(lna-1:gacatgacaatggta，lna-2:tttggccatgatggat)瞬时转染肿瘤细胞mcf7和a549均能显著增加肿瘤细胞的凋亡。采用lna-1和lna-2转染肿瘤细胞24h后，进行annexinv/pi染色，冰上孵育30min，用流式细胞仪进行检测，统计annexinv/pi阳性的凋亡率。

检测结果：如图8～11所示，显示在人乳腺癌细胞系mcf7和非小细胞肺癌细胞系a549中敲降长链非编码rnast8sia6-as11引起肿瘤细胞大量发生凋亡；通过反义锁核酸降低长链非编码rnast8sia6-as1的表达量，能够明显增加肿瘤细胞的凋亡约25～40％。

实施例7动物实验检测敲降长链非编码rnast8sia6-as1后对移植瘤生长的影响

检测方法：评价长链非编码rnast8sia6-as1对于肿瘤细胞体内生长的影响时，肿瘤细胞以2×10⁶/0.1mlpbs接种于每只裸鼠后背部皮下，每组9只。肿瘤细胞接种后第7天，当可触及肿瘤时反义锁核酸以10mg/kg的剂量腹腔注射至荷瘤小鼠，其后每3天注射一次，连续治疗三周。

检测结果：如图12～15所示，敲降长链非编码rnast8sia6-as1后在mcf7和a549移植瘤中均显著抑制肿瘤生长；统计图显示mean+sd(均数加减标准差)，表明对a549、mcf7移植瘤的荷瘤裸鼠腹腔注射针对长链非编码rnast8sia6-as1的反义锁核酸可以明显抑制肿瘤的生长。

综上，我们结合非编码rna数据库资料，用流式检测、动物实验等分析实验发现，长链非编码rnast8sia6-as1在多种肿瘤中表达增高，可以作为肿瘤发生发展的独立的预后标志物，通过反义锁核酸降低长非编码rnast8sia6-as1的表达量，能够明显增加肿瘤细胞的凋亡，在mcf7和a549移植瘤中均显著抑制肿瘤生长。因此，长链非编码rnast8sia6-as1作为新的肿瘤标志物和治疗靶点，能够为肿瘤的诊断或者治疗提供新的方法。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

sequencelisting

<110>中山大学孙逸仙纪念医院

<120>长链非编码rnast8sia6-as1及其应用

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