一种DNA提取方法与流程

本发明属于生物技术、dna提取技术领域，具体涉及一种dna提取方法，能够方便高效地实现dna提取。

背景技术：

现有的dna提取方法主要有以下几种：

1)经典的酚-氯仿法。一般是指细胞裂解后加入等体积的酚氯仿混合液，根据dna易溶于水，不易溶于有机溶剂的特性，在有机溶剂环境下，蛋白质经过变性沉淀和离心后，有机溶剂存在于试管底层，dna存在于上层水中，蛋白质沉淀存在于两种液体之间，最后用乙醇将dna从水中分离，沉淀，离心之后回收。酚-氯仿提取过程中需要多次复杂的离心操作，耗时长，容易造成样品的交叉污染，使得dna产量偏少，不适合大批量提取。

2)磁珠法。由于磁珠在特定的条件下可特异性地与核酸结合而不与样本中的蛋白、糖类和酯类等杂质结合因而被广泛地应用于核酸提取、病原体检测等方面。磁珠加入到经过裂解后的混合液中，偏酸性(ph5.0)的缓冲液中，从细胞中游离出来的dna分子很快被吸附到带有正电荷的磁珠上。吸附有dna的磁珠在磁场作用下可定向团聚在试管的侧面。此时，吸取并丢弃管中液体，加入洗涤液缓冲液，试管移开磁场，反复冲洗几次后再放入磁场，磁珠又可以团聚在管壁。加入偏碱性(ph8.0)的缓冲液和洗脱液可以讲dna从磁珠上洗脱下来，从而得到纯化的基因组dna溶液。磁珠法提取dna操作步骤繁琐且提取纯度比硅胶膜吸附法低，全自动的核酸提取仪价格昂贵超出了偏远地区医院以及乡镇卫生院的承受范围。

3)硅胶膜吸附法：该方法采用核酸吸附硅胶膜，其是一种特殊硅基质吸附材料，能够特异性吸附dna，而rna与蛋白质穿过。在正常情况下，dna表面覆盖了一层由水分子组成的亲水薄膜，以维持其水溶性。高浓度盐离子的加入破坏了dna表面亲水薄膜的相对有序排列，形成了疏水环境。在此环境中，dna与硅胶膜能有效结合，而蛋白质、代谢产物和其他污染物则不能结合。在高离子强度缓冲溶液中，硅胶膜上的硅表面的负电荷逐渐减少，从而使dna分子脱水后暴露的磷酸基团带有的负电荷与硅表面产生的排斥力减少，形成了大量的水合离子，dna分子的水合程度降低而被驱使聚合到硅的表面上。同时细胞裂解液也会干扰双链dna分子之间的氢键形成而产生单链的dna分子，单链dna分子与硅表面形成氢键，且这种氢键的作用远大于dna分子与硅表面的静电排斥力。如果高离子强度缓冲溶液的ph值低于硅表面的pka值，这种静电排斥力会变小，这就大大提高了硅表面对dna分子的吸附能力，但当缓冲溶液的ph值高于硅表面的pka值时，硅表面吸附的dna分子就会被缓冲液洗脱下来。

技术实现要素：

本发明针对上述问题，提供一种dna提取方法，能够将硅胶膜吸附法的反应流程集成到该离心盘上，高效地实现dna提取。

本发明采用的技术方案如下：

一种dna提取方法，适用于一dna提取装置，所述dna提取装置包括离心机和dna提取离心盘，所述dna提取离心盘安装在所述离心机上，所述dna提取离心盘包括至少一个dna提取单元；所述dna提取单元的正面设有第一进液口、第二进液口、第三进液口、临时储液区和过滤区，背面设有第一储液区和第二储液区；过滤区内设有dna吸附材料；第一进液口、第二进液口分别通过流道与过滤区连通；第三进液口通过流道与临时储液区连通，临时储液区通过流道与过滤区连通；第二储液区通过流道与第一储液区连通，第一储液区通过流道与过滤区连通；所述dna提取方法包括以下步骤：

1)在第一进液口内加入适量的血液、红细胞裂解液，在第二进液口内加入适量的高浓度盐离子溶液，在第三进液口内加入适量的dna洗脱液；

2)将第一进液口内的血液和红细胞裂解液混匀；

3)离心机采用转速1转动，使第一进液口、第二进液口内的溶液进入过滤区中并混合；

4)离心机采用转速2转动，使过滤区内的溶液中的dna粘附在dna吸附材料上，其余杂质进入第一储液区，同时在该转速下第三进液口中的洗脱液进入临时储液区；

5)离心盘采用转速3转动，使临时储液区中的dna洗脱液进入过滤区，并且使第一储液区内的杂质进入第二储液区；

6)离心机采用转速4转动，使洗脱下的dna进入第一储液区；

7)从第一储液区中取出dna。

进一步地，步骤2)通过离心盘顺时针和逆时针旋转时产生的震动混匀血液和红细胞裂解液，或者采用涡旋混匀仪混匀血液和红细胞裂解液。

进一步地，步骤7)用定量移液器取出dna。

进一步地，所述dna提取离心盘的正面和背面覆盖薄膜。

进一步地，所述dna吸附材料为硅胶膜。

进一步地，第一进液口、第二进液口比过滤区更靠近dna提取离心盘的中心；第三进液口、临时储液区比过滤区更靠近dna提取离心盘的中心；第三进液口比临时储液区更靠近dna提取离心盘的中心；过滤区比第一储液区更靠近dna提取离心盘的中心；第一储液区比第二储液区更靠近dna提取离心盘的中心。

进一步地，所述dna提取离心盘的材料为塑料。

本发明创新性的将硅胶膜吸附法的反应流程集成到一块离心盘上，具有以下有益效果：

1)实现了一次加样到结果输出，极大的简化了dna提取流程；

2)dna提取的全程均在密封的离心盘中自动完成，对环境要求低；

3)全程自动化，降低了对实验员的技能要求；

4)离心盘为一次性耗材(可采用一次性塑料等材料)，用完即可作废，节约了实验时间；

5)该反应流程的配套设备只需一台小型离心机，极大地降低了成本，同时该设备方便携带，解决了极端环境以及偏远地区的医疗问题。

附图说明

图1是dna提取离心盘的3d前视透视图。

图2是dna提取离心盘的正面2d图。

图3是dna提取离心盘的背面2d图。

图4是dna提取离心盘上的一个dna提取单元的结构示意图。

图5是dna提取离心盘的过滤区在嵌入硅胶膜前的示意图。

图6是dna提取离心盘的过滤区在嵌入硅胶膜后的示意图。

图中标号说明：

100-dna提取离心盘；110-dna提取单元；111-第一进液口；112-第二进液口；113-第三进液口；114-临时储液区；115-过滤区；116-第一储液区；117-第二储液区；118-dna吸附材料。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面通过具体实施例和附图，对本发明做进一步详细说明。

一.本发明采用的dna提取装置

本发明采用的dna提取装置包括离心机和dna提取离心盘，所述dna提取离心盘安装在所述离心机上。如图1所示，本实施例的dna提取离心盘100上设有若干个沿圆周均匀分布的dna提取单元110。其中实线部分表示位于离心盘正面，虚线部分表示位于离心盘背面。图2单独示意了离心盘正面的结构，图3单独示意了离心盘背面的结构。该离心盘的中间设有安装孔111，如图1所示，通过该安装孔可以将该离心盘安装在离心机上，从而构成一种dna提取装置。

图4为一个单独的dna提取单元110的示意图。如该图所示，一个dna提取单元的正面设有第一进液口111、第二进液口112、第三进液口113、临时储液区114和过滤区115，背面设有第一储液区116和第二储液区117。过滤区115内设有dna吸附材料118(如图5所示)，本实施例中该dna吸附材料采用硅胶模。第一进液口111、第二进液口112分别通过流道与过滤区115连通；第三进液口113通过流道与临时储液区114连通，临时储液区114通过流道与过滤区115连通；第二储液区117通过流道与第一储液区116连通，第一储液区116通过流道与过滤区115连通。

图5为过滤区115内嵌入dna吸附材料118即硅胶模的示意图。其中图5是嵌入硅胶膜前的示意图，图6是嵌入硅胶膜后的示意图。

上述111～117均为在离心盘正面或背面的开孔，其间通过图中所示的流道连通。离心盘的正反面均需要粘贴一张和离心盘一样大小的薄膜，将全部的孔(即111～117)和流道覆盖。

对于三个进液口111～113，为便于向其中加入液体，在贴覆薄膜之前，薄膜上对应三个进液口111～113的位置制作好相应的开口(小孔)。另外，除血液外，其余的试剂也可以在贴覆薄膜之前预埋到三个进液口111～113中，使用时只添加血液即可。

上述111～117的作用分别说明如下：

第一进液口111：用于分别加入血液和红细胞裂解液。

第二进液口112：用于加入高浓度盐离子溶液。

第三进液口113：用于加入dna洗脱液(te缓冲液)。

临时储液区114：用于临时储存加入进液口c内的dna洗脱液，并配合离心机的转速设置(详见后文的dna提取过程)，实现进液口c内的液体后于进液口a和进液口b进入过滤区d。

过滤区115：用于安装硅胶膜，实现dna的过滤提取。

第一储液区116、第二储液区117：用于实现dna的收集(详见后文的dna提取过程)。

上述dna提取离心盘优选采用塑料材料，如ps、pc、pmma、coc、cop等。

二.本发明的dna提取方法

1.实验试剂及仪器

a)实验试剂：血液、红细胞裂解液、dna洗脱液

b)实验仪器：dna提取离心盘、离心机、定量移液器

2.dna提取流程

采用上述dna提取装置进行dna提取的步骤流程如下：

1)离心盘的第一进液口111孔内分别加入适量的血液、红细胞裂解液(用于裂解红细胞)；第二进液口112中加入适量的高浓度盐离子溶液(用于裂解细胞、释放dna)；第三进液口113内加入适量的dna洗脱液。

红细胞裂解液可以采用tris-hcl等。高浓度盐离子溶液可以采用sds(十二烷基硫酸钠)、醋酸铵、盐酸胍和蛋白酶k的混合物。

本实施例中dna洗脱液的配方为：tris-hcl(ph8.0)10mmol/l，edta(ph8.0)1mmol/l。

本实施例中，血液为10μl，红细胞裂解液为20μl，高浓度盐离子溶液为30μl，dna洗脱液为50μl。

2)将离心盘装入离心机内，通过顺时针和逆时针旋转时产生的震动，混匀第一进液口111内的血液和红细胞裂解液。除了这种混匀方式以外，也可以采用涡旋混匀仪等设备进行混匀。

3)离心机采用转速1转动，使第一进液口111和第二进液口112内的溶液进入过滤区115中并混合。

4)离心机采用转速2转动，使过滤区115内的溶液中的dna粘附在硅胶膜上，其余杂质进入第一储液区116，同时在该转速下第三进液口113中的dna洗脱液进入临时储液区114。

在正常情况下，dna表面覆盖了一层由水分子组成的亲水薄膜，以维持其水溶性。高浓度盐离子溶液的加入能够破坏dna表面亲水薄膜的相对有序排列，形成了疏水环境。在此环境中，dna与硅胶膜能有够效结合，而蛋白质、代谢产物和其他污染物则不能与硅胶膜结合，从而进入第一储液区116。

5)离心盘采用转速3转动，使临时储液区114中的dna洗脱液进入过滤区115，并且使第一储液区116内的杂质进入第二储液区117。

在dna洗脱液这种高离子强度缓冲溶液中，硅胶膜上的硅表面的负电荷逐渐减少，从而使dna分子脱水后暴露的磷酸基团带有的负电荷与硅表面产生的排斥力减少，形成了大量的水合离子，dna分子的水合程度降低而被驱使聚合到硅的表面上。同时细胞裂解液也会干扰双链dna分子之间的氢键形成而产生单链的dna分子，单链dna分子与硅表面形成氢键，且这种氢键的作用远大于dna分子与硅表面的静电排斥力。如果高离子强度缓冲溶液的ph值低于硅表面的pka值，这种静电排斥力会变小，这就大大提高了硅表面对dna分子的吸附能力，但当缓冲溶液的ph值高于硅表面的pka值时，硅表面吸附的dna分子就会被缓冲液洗脱下来。

6)离心机采用转速4转动，使洗脱下的dna进入第一储液区116。

7)用定量移液器刺破第一储液区116上密封的薄膜，取出dna，从而实现dna提取。

上述转速1～4中，转速的数值与离心盘的大小有关，具体实施时可以根据离心盘的大小，对上述四个转速合理取值，只要能够实现上述各步骤的效果即可。比如，当离心盘直径为120mm时，转速1～4的优选取值范围为：

转速1：500rpm-1000rpm；

转速2：10000rpm-20000rpm；

转速3：4000rpm-6000rpm；

转速4：10000rpm-20000rpm。

上述离心机的转速可以通过电脑进行控制，或者在离心机上设置触摸屏进行控制等。另外，离心机上还可集成涡旋混匀仪的功能，以实现上述步骤2)中的混匀处理。

本发明中，dna提取离心盘上的dna提取单元也可以是其它形状，111～117的相对位置也不限于附图中所示的形式，只要能够实现上面所述的功能即可。一般来说，111～117沿离心盘径向的排布顺序为：

a)第一进液口111、第二进液口112比过滤区115更靠近dna提取离心盘的中心(圆心)。第一进液口111和第二进液口112的相对位置没有特别要求，与dna提取离心盘的中心的距离可相等或近似相等。

b)第三进液口113、临时储液区114比过滤区115更靠近dna提取离心盘的中心。第三进液口113比临时储液区114更靠近dna提取离心盘的中心。

c)过滤区115比第一储液区116更靠近dna提取离心盘的中心，第一储液区116比第二储液区117更靠近dna提取离心盘的中心。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，本领域的普通技术人员可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围，本发明的保护范围应以权利要求书所述为准。