一种从黄芪中提取分离活性多肽的方法与流程

本发明属于分离分析及生物技术领域，为一种传统植物提取方法与生物技术结合分离纯化黄芪活性多肽的方法。

背景技术：

黄芪，为豆科植物蒙古黄芪astragalusmembranaceus(fish.)bge.var.mongholicus(bge.)hsiao或膜荚黄芪astragalusmembranaceus(fish.)bge的干燥根。始载于《神农本草经》，具有补气升阳，固表止汗，利水消肿，生津养血，行滞通痹，托毒排脓，敛疮生肌等作用。现代医学研究其具有抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗病毒、抗损伤、降血糖、治疗代谢紊乱等活性作用。

自然界中存在着大量的多肽类化合物，前人更多地关注于动物体中的多肽、蛋白类成分，而在植物中主要研究黄酮、蒽醌、三萜、皂苷、生物碱等类化合物。随着现代分离及分析技术的飞跃发展，越来越多的植物中多肽类化合物被鉴定得到，且实验研究发现许多植物多肽类成分具有较强的生物活性，这为新药研发带来了更多的可能性。目前，研究发现植物多肽具有抗肿瘤、抗炎、抗衰老、提高免疫活性、降糖、修复神经损伤等方面的活性，继而开发了一些具有显著疗效的临床药物

植物多肽类药物具有广阔的发展前景，由于植物中成分复杂，多肽含量较少，有效分离纯化的方法较少等原因导致其发展受到了一定的限制，为改善这一限制条件，越来越多的分离、纯化、鉴定方法应运而生，并且取得了良好的效果。目前，多肽、蛋白的分离纯化方式还是需要依靠特殊处理，如：尿素提取、酶法制备等，操作较为繁琐，后处理过程较多。因此，发展一种有效、简便、快速分离纯化的方法是一项非常有价值的研究课题。

技术实现要素：

为解决上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种进行黄芪多肽筛选鉴定及分离纯化的方法。采用现代分析化学的质谱手段，对黄芪中的多肽进行筛选鉴定，并对其中鉴定出的具有特殊结构的多肽进行分离、纯化。

为达到上述目的，本发明采用如下的技术方案：一种黄芪中多肽提取分离的方法，包括如下步骤：

(1)将黄芪粉碎，药材粉末加入其重量的5～10倍体积浓度为60％～80％甲醇或乙醇-水溶剂，在40～70℃超声或者水浴加热浸提，每次1～2小时，抽滤，得黄芪提取液及滤渣,滤渣重复上述提取方式1～2次；

(2)将黄芪提取液减压加热浓缩至无醇味，按照黄芪提取液与去离子水体积比1:100～200加入去离子水混悬，按照体积比(黄芪提取液:乙酸乙酯)1:1～2向混悬液中加入乙酸乙酯,混匀,静置,分两层,得到含乙酸乙酯的萃取液ⅰ和不含乙酸乙酯的萃取液ⅱ；(3)取萃取液ⅱ，按照体积比(萃取液:正丁醇)1:1～2加入正丁醇，混匀，静置，分两层，得到含有正丁醇的萃取液ⅲ和不含正丁醇的萃取液ⅳ；

(4)将萃取液ⅲ进行减压加热浓缩至干，按照所得干燥物ⅰ黄芪提取液与去离子水体积比1:100～200加入去离子水混悬，并按照体积比(萃取液:有机混合溶剂)1～4:1进行有机混合试剂(正丁醇：氯仿＝2～5:1)萃取，混匀，静置，分三层，取中间白色沉淀层，氮气保护加热浓缩至干得干燥物ⅱ。

(5)干燥物ⅱ用去离子水(含0.1～0.3％甲酸，干燥物与去离子水体积比＝1:30～100)超声溶解，离心，取上清液上样于mci开放柱，并按照6～10倍柱体积进行梯度洗脱：h20、30％meoh、50％meoh、65％～85％meoh(70％meoh最优)、100％meoh(均含0.1～0.3％fa)，分别收集馏分进行减压加热浓缩得洗脱液ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ。

(6)将已浓缩得到的洗脱液ⅳ，通过hplc梯度洗脱分析及纯化，收集目标多肽的洗脱液，在氮气保护加热浓缩至干，得到黄芪目标多肽成品。

本发明与现有技术相比，具有如下优点及价值：本发明对黄芪中多肽类化合物进行分离、纯化是一种传统分离技术与生化技术有效结合的方法，其快速、简单、有效、节约成本等优点为植物多肽的研究提供一条可行的途径。

附图说明

图1为实施例1黄芪多肽hplc制备。

图2为实施例1黄芪多肽质谱检测信息。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明进一步详细的描述，但本发明的实施方法不限于此。

实施例1

粉碎干燥黄芪切片0.5kg，加入5l的60％甲醇水溶液，在40℃超声提取两次，每次1h，抽滤，得黄芪甲醇提取液和黄芪滤渣；将黄芪提取液减压加热浓缩至无醇，加入去离子水水混悬至500ml，按照体积比1:1向混悬液中加入乙酸乙酯、得到含乙酸乙酯的萃取液和不含乙酸乙酯的萃取液；

取不含乙酸乙酯的萃取液，按照体积比1:1加入正丁醇，得到含有正丁醇的萃取液和不含正丁醇的萃取液；

将含有正丁醇的萃取液进行减压加热浓缩至干，所得干燥物ⅰ30.35g；按照所得干燥物ⅰ黄芪提取液与去离子水体积比1:100加入去离子水混悬，并按照体积比(萃取液:有机混合溶剂)1:1进行有机混合试剂(正丁醇：氯仿＝2:1)萃取，混匀，静置，分三层，取中间白色沉淀层，氮气保护加热浓缩至干得干燥物ⅱ7.33g；

干燥物ⅱ用去离子水(含0.2％甲酸，干燥物与去离子水体积比＝1:30)超声溶解，离心，取上清液按照质量比(样品：mci填)1：100上样于mci开放柱，并按照6倍柱体积进行梯度洗脱：h20、30％meoh、50％meoh、70％meoh、100％meoh(均含0.2％fa)，分别收集馏分进行减压加热浓缩得洗脱液ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ，

取洗脱液ⅳ，浓缩至1ml，通过hplc梯度洗脱：使用5umc184.6id×250mm色谱柱，进行如下梯度洗脱分析、分离：乙腈(20％-80％，v/v，含0.5％甲酸)，流速1.0ml/min；洗脱程序为：t＝0-3min，20％洗脱液a(乙腈，含0.5％甲酸)，t＝3-10min，40％-80％洗脱液a(乙腈，含0.5％甲酸)，t＝13-16min，20％洗脱液a(乙腈，含0.5％甲酸)分析及纯化，收集目标多肽的洗脱液ⅷ约5ml，在氮气保护下浓缩至干，得到黄芪目标多肽成品白色粉末1.76mg。

实施例2

粉碎干燥黄芪切片2kg，加入12l的70％甲醇水溶液，在50℃超声提取两次，每次1.5h，抽滤，得黄芪甲醇提取液和黄芪滤渣；将黄芪提取液减压加热浓缩至无醇体积，加入去离子水水混悬，按照体积比1:2向混悬液中加入乙酸乙酯、得到含乙酸乙酯的萃取液和不含乙酸乙酯的萃取液；取不含乙酸乙酯的萃取液，按照体积比1:2加入正丁醇，得到含有正丁醇的萃取液和不含正丁醇的萃取液；将含有正丁醇的萃取液进行减压加热浓缩至干，所得干燥物ⅰ113.24g；按照所得干燥物ⅰ黄芪提取液与去离子水体积比1:100加入去离子水混悬，按照体积比2:1进行有机试剂(正丁醇：氯仿＝3:1)萃取2次，静置，取中间白色沉淀层，减压加热浓缩至干得干燥物ⅱ26.78g；

干燥物ⅱ用去离子水(含0.2％甲酸，干燥物与去离子水体积比＝1:50)超声溶解，离心，取上清液上样于mci开放柱，并按照7倍柱体积进行梯度洗脱：h20、30％meoh、50％meoh、70％meoh、100％meoh(均含0.2％fa)，分别收集馏分进行减压加热浓缩得洗脱液ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ，取洗脱液ⅳ，浓缩至约3ml，通过hplc梯度洗脱：使用5umc184.6id×250mm色谱柱，进行如下梯度洗脱分析、分离：乙腈(20％-80％，v/v，含0.5％甲酸)，流速1.0ml/min；洗脱程序为：t＝0-3min，20％洗脱液a(乙腈，含0.5％甲酸)，t＝3-10min，40％-80％洗脱液a(乙腈，含0.5％甲酸)，t＝13-16min，20％洗脱液a(乙腈，含0.5％甲酸)分析及纯化，收集目标多肽的洗脱液ⅷ约17ml，在氮气保护下浓缩至干，得到黄芪目标多肽成品白色粉末6.78mg。

实施例3

粉碎干燥黄芪切片3kg，加入15l的80％甲醇水溶液，在60℃超声提取两次，每次2h，抽滤，得黄芪甲醇提取液和黄芪滤渣；将黄芪提取液减压加热浓缩至无醇体积，加入去离子水水混悬，按照体积比1:3向混悬液中加入乙酸乙酯、得到含乙酸乙酯的萃取液和不含乙酸乙酯的萃取液；取不含乙酸乙酯的萃取液，按照体积比1:3加入正丁醇，得到含有正丁醇的萃取液和不含正丁醇的萃取液；将含有正丁醇的萃取液进行减压加热浓缩至干，所得干燥物ⅰ175.43g；按照所得干燥物ⅰ黄芪提取液与去离子水体积比1:200加入去离子水混悬，按照体积比3:1进行有机试剂(正丁醇：氯仿＝4:1)萃取2次，静置，取中间白色沉淀层，氮气保护加热浓缩至干得干燥物ⅱ41.68g；

干燥物ⅱ用去离子水(含0.2％甲酸，干燥物与去离子水体积比＝1:100)超声溶解，离心，取上清液按照1:200上样量上样于mci开放柱，并按照8倍柱体积进行梯度洗脱：h20、30％meoh、50％meoh、70％meoh、100％meoh(均含0.2％fa)，分别收集馏分进行减压加热浓缩得洗脱液ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ，得到洗脱液ⅳ约26ml，减压加热浓缩至干，通过hplc梯度洗脱：使用5umc184.6id×250mm色谱柱，进行如下梯度洗脱分析、分离：乙腈(20％-80％，v/v，含0.5％甲酸)，流速1.0ml/min；洗脱程序为：t＝0-3min，20％洗脱液a(乙腈，含0.5％甲酸)，t＝3-10min，40％-80％洗脱液a(乙腈，含0.5％甲酸)，t＝13-16min，20％洗脱液a(乙腈，含0.5％甲酸)分析及纯化，收集目标多肽的洗脱液ⅷ，在氮气保护下浓缩至干，得到黄芪目标多肽成品白色粉末10.12mg。

对比例1

粉碎干燥黄芪切片0.5kg，加入5l的60％甲醇水溶液，在40℃超声提取两次，每次1h，抽滤，得黄芪甲醇提取液和黄芪滤渣；将黄芪提取液减压加热浓缩至无醇，加入去离子水水混悬至500ml，按照体积比1:1向混悬液中加入乙酸乙酯、得到含乙酸乙酯的萃取液和不含乙酸乙酯的萃取液；取不含乙酸乙酯的萃取液，按照体积比1:1加入正丁醇，得到含有正丁醇的萃取液和不含正丁醇的萃取液；将含有正丁醇的萃取液进行减压加热浓缩至干，所得干燥物ⅰ32.66g；按照所得干燥物ⅰ黄芪提取液与去离子水体积比1:100加入去离子水混悬，按照体积比1:1进行有机试剂(正丁醇：氯仿＝2:1)萃取2次，静置，取中间白色沉淀层，氮气保护加热浓缩至干得干燥物ⅱ7.83g；干燥物ⅱ用50％acn(含有0.2％甲酸)按照浓度为3mg/ml超声溶解，离心取上清，

通过hplc梯度洗脱：使用5umc184.6id×250mm色谱柱，进行如下梯度洗脱分析、分离：乙腈(20％-80％，v/v，含0.5％甲酸)，流速1.0ml/min；洗脱程序为：t＝0-3min，20％洗脱液a(乙腈，含0.5％甲酸)，t＝3-10min，40％-80％洗脱液a(乙腈，含0.5％甲酸)，t＝13-16min，20％洗脱液a(乙腈，含0.5％甲酸)分析及纯化，收集目标多肽的洗脱液ⅷ约8ml，在氮气保护加热浓缩至干，得到杂质多的黄芪目标多肽成品黄色粘稠样品2.63mg。

对比例2

粉碎干燥黄芪切片0.5kg，加入5l的60％甲醇水溶液，在40℃超声提取两次，每次1h，抽滤，得黄芪甲醇提取液和黄芪滤渣；将黄芪提取液减压加热浓缩至无醇，加入去离子水水混悬至500ml，按照体积比1:1向混悬液中加入乙酸乙酯、得到含乙酸乙酯的萃取液和不含乙酸乙酯的萃取液；取不含乙酸乙酯的萃取液，按照体积比1:1加入正丁醇，得到含有正丁醇的萃取液和不含正丁醇的萃取液；将含有正丁醇的萃取液进行减压加热浓缩至干，所得干燥物ⅰ31.93g；干燥物ⅰ用去离子水(含0.2％甲酸，干燥物与去离子水体积比＝1:100)超声溶解，离心，取上清液按照1:200上样量上样于mci开放柱，并并按照6倍柱体积进行梯度洗脱：h20、30％meoh、50％meoh、65％～85％meoh(70％meoh最优)、100％meoh(均含0.2％fa)，分别收集馏分进行减压加热浓缩得洗脱液ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ，得到洗脱液ⅳ约26ml，减压加热浓缩至干；通过hplc梯度洗脱：使用5umc184.6id×250mm色谱柱，进行如下梯度洗脱分析、分离：乙腈(20％-80％，v/v，含0.5％甲酸)，流速1.0ml/min；洗脱程序为：t＝0-3min，20％洗脱液a(乙腈，含0.5％甲酸)，t＝3-10min，40％-80％洗脱液a(乙腈，含0.5％甲酸)，t＝13-16min，20％洗脱液a(乙腈，含0.5％甲酸)分析及纯化，收集目标多肽的洗脱液ⅷ约7ml，在氮气保护加热浓缩至干，得到杂质多的黄芪目标多肽成品黄色粘稠样品2.38mg。