本发明属于植物提取技术领域，具体涉及一种促凝血苹果花有效成分及其提取分离方法、应用。
背景技术：
苹果（maluspumilamill）为蔷薇科（rosaceae）苹果属植物，在世界各地广泛种植数百年。目前，苹果的研究主要集中在果实、果皮、叶片和枝条上。研究结果表明，其果皮中含有三萜类，黄酮类，酚类和其他成分，如烷基醇，并表现出更强的抗氧化活性和抗增殖活性。其果实中含有黄酮类、多酚类、糖苷类、三萜类、甾体类和脂肪酸酯类，具有抗氧化活性。苹果叶中含有高水平的多酚、黄酮类，并具有很好的体外抗氧化活性和利血平引起的小鼠胃溃疡的保护作用。然而，苹果花的化学成分和药理作用仍然不确定，没有明确的理论证据。
血液凝固简称凝血，是在内源性或（和）外源性凝血途径下产生凝血酶原激活物，凝血酶原激活物在凝血因子的作用下产生凝血酶，最后凝血酶使纤维蛋白原转变为纤维蛋白，血液由溶胶状态转变为凝胶状态。凝血过程通常分为：①内源性凝血途径；②外源性凝血途径；③共同凝血途径。外源性凝血途径是从组织因子暴露于血液而启动，到因子x被激活的过程；临床上以凝血酶原时间(pt)测定来反映外源性凝血途径的状况。内源性凝血途径是指从因子xii激活，到因子x激活的过程；临床上以活化部分凝血活酶时间（aptt）来反映体内内源性凝血途径的状况。从因子x被激活至纤维蛋白形成，是内、外源共同凝血途径；主要包括凝血酶生成和纤维蛋白形成两个阶段。
机体凝血系统包括凝血和抗凝两个方面，两者间的动态平衡是正常机体维持体内血液流动状态和防止血液丢失的关键。促凝血药主要通过增强体内凝血因素或抑制抗凝血因素，促使凝血，以达到凝血目的，用于治疗各种出血疾病以及创伤性出血等。
技术实现要素：
基于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种促凝血苹果花有效成分，并提供该促凝血苹果花有效成分的提取分离方法和应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种促凝血苹果花有效成分的提取分离方法，包括以下步骤：
1）以干燥的苹果花为原料，粉碎后用石油醚脱脂，得到脱脂后的苹果花；将脱脂后的苹果花采用乙醇浸泡提取，减压回收溶剂，得到乙醇总浸膏；将乙醇总浸膏分散于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，减压回收溶剂后，得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位；
2）将步骤1）所得乙酸乙酯部位用体积浓度为65~75%的乙醇溶解后，d101大孔树脂吸附上样，静置12~14h，依次用水、30%乙醇、60%乙醇和90%乙醇进行梯度洗脱，每个比例溶剂至少洗脱3个柱体积，减压回收溶剂后，得到水提物、30%乙醇提取物、60%乙醇提取物和90%乙醇提取物；
3）将60%乙醇提取物的第一柱体积和第二柱体积合并在一起，采用两次硅胶h常压柱色谱分离，第一次用二氯甲烷-丙酮进行梯度洗脱，第二次用二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，得到3个组分，按照所得组分极性由小到大依次标记为组分1、组分2、组分3；组分3先经sephadexlh-20凝胶柱色谱纯化，后经中压液相制备色谱，收集最高峰，浓缩、干燥，得到化合物1；
4）将60%乙醇提取物的第三柱体积采用硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-丙酮进行梯度洗脱，得到2个组分，按照所得组分极性由小到大依次标记为组分4、组分5；组分4采用硅胶h常压柱色谱分离，先用二氯甲烷-丙酮进行梯度洗脱，再用二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，得到2个亚组分，按照所得组分极性由小到大依次标记为亚组分4.1、亚组分4.2；亚组分4.1经硅胶h柱色谱洗脱，薄层色谱检测、合并，浓缩、干燥，得到化合物2，亚组分4.2经sephadexlh-20凝胶柱色谱纯化，薄层色谱检测、合并，浓缩、干燥，得到化合物3；
5）将洗脱的90%乙醇提取物的第一柱体积和第二柱体积合并在一起，采用硅胶h常压柱色谱分离，以二氯甲烷-丙酮进行梯度洗脱，然后经sephadexlh-20凝胶柱色谱纯化，薄层色谱检测、合并，浓缩、干燥，得到化合物4；
化合物1~4即为促凝血苹果花有效成分。
优选地，步骤1）中所述石油醚脱脂的具体步骤为：室温下，将粉碎后的苹果花浸泡于石油醚中，浸泡脱脂2~4次，每次2~4天，浸泡脱脂完成后，固液分离，取固体挥发干石油醚，即得脱脂后的苹果花。
优选地，步骤1）中所述乙醇浸泡提取的具体步骤为：室温下，将脱脂后的苹果花浸泡于体积浓度为65~75%的乙醇中，浸泡提取2~4次，每次2~4天，合并提取液，过滤取滤液。
优选地，步骤3）中所述硅胶h常压柱色谱分离时，二氯甲烷与丙酮的体积比的梯度范围为10:1~6:1，二氯甲烷与甲醇的体积比的梯度范围为10:1~0:1；步骤3）中所述sephadexlh-20凝胶柱色谱纯化时，以甲醇为洗脱液。
优选地，步骤4）中所述硅胶柱色谱分离时，二氯甲烷与丙酮的体积比的梯度范围为10:1~1:1；步骤4）中组分4采用硅胶h常压柱色谱分离时，二氯甲烷与丙酮的体积比的梯度范围为30:1~1:1，二氯甲烷与甲醇的体积比的梯度范围为7:1~1:1。
优选地，步骤4）中亚组分4.1经硅胶h柱色谱洗脱时，以二氯甲烷和丙酮按照体积比10:1混合后的溶液为洗脱液；亚组分4.2经sephadexlh-20凝胶柱色谱纯化时，以甲醇为洗脱液。
优选地，步骤5）中所述硅胶h常压柱色谱分离时，二氯甲烷与丙酮的体积比的梯度范围为40:1~10:1；步骤5）中所述sephadexlh-20凝胶柱色谱纯化时，以二氯甲烷和甲醇按照体积比1:1混合后的溶液为洗脱液。
采用上述方法制备得到的促凝血苹果花有效成分，化合物1~4分别为根皮苷(1)、山奈酚(2)、根皮素(3)和β-谷甾醇(4)，其结构如下：
上述促凝血苹果花有效成分在制备促凝血药物方面的应用。
本发明采用特殊的方法从苹果花中乙酸乙酯部位分离得到了4个化合物，并对4个化合物的体外促凝血效果的考察，结果表明，4个化合物均具有良好的促凝血效果，它们可以单独或组合用于制备促凝血剂。
本发明的方法以常被作为观赏，花落后作为废弃物丢弃，未得到广泛应用的苹果花为原料，进行促凝血有效成分的提取，大大拓展了苹果花这一药用植物的开发利用价值。本发明的提取方法简单，原料来源丰富，成本低，所提取得到的化合物具有促凝血作用，提取过程中用到的溶剂可回收利用，提取量大，可工业化生产。
具体实施方式
为了使本发明的技术目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作出进一步的说明，但所述实施例旨在解释本发明，而不能理解为对本发明的限制，实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
下述实施例中，作为原料的苹果花采集于河南省开封市河南大学植物园，为蔷薇科苹果属植物苹果（maluspumilamill）的花；所述乙醇、甲醇、二氯甲烷等有机溶剂浓度均为体积浓度或者体积比。
一种促凝血苹果花有效成分的提取分离方法，包括以下步骤：
1）以700g干燥的苹果花为原料，粉碎后，室温下，将粉碎后的苹果花浸泡于石油醚（用量为8l）中，浸泡脱脂3次，每次3天，浸泡脱脂完成后，固液分离，取固体挥发干石油醚，即得脱脂后的苹果花；
然后将脱脂后的苹果花浸泡于体积浓度为70%的乙醇（用量为6l）中，浸泡提取3次，每次3天，合并提取液，过滤取滤液，减压回收溶剂，得到乙醇总浸膏；
将乙醇总浸膏分散于水（用量为150ml）中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，减压回收溶剂后，得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位；
2）将步骤1）所得乙酸乙酯部位用体积浓度为70%的乙醇溶解后，d101大孔树脂吸附上样，静置11h，依次用水、30%乙醇、60%乙醇和90%乙醇进行梯度洗脱，每个比例溶剂洗脱3个柱体积，每次1500ml，减压回收溶剂后，得到水提物、30%乙醇提取物、60%乙醇提取物和90%乙醇提取物；
3）将60%乙醇提取物的第一柱体积和第二柱体积合并在一起，采用两次硅胶h常压柱色谱分离，第一次用二氯甲烷-丙酮（体积比由10:1至6:1）进行梯度洗脱，第二次用二氯甲烷-甲醇（体积比由10:1至0:1）进行梯度洗脱，经薄层色谱检测，得到3个组分，按照所得组分极性由小到大依次标记为组分1、组分2、组分3；组分3先经sephadexlh-20凝胶柱色谱纯化，后经中压液相制备色谱，收集最高峰，浓缩、干燥，得到化合物1（200.3mg）；
4）将60%乙醇提取物的第三柱体积采用（200~300目）硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-丙酮（体积比由10:1至1:1）进行梯度洗脱，经薄层色谱检测，得到2个组分，按照所得组分极性由小到大依次标记为组分4、组分5；组分4采用硅胶h常压柱色谱分离，先用二氯甲烷-丙酮（体积比由30:1至1:1）进行梯度洗脱，再用二氯甲烷-甲醇（体积比由7:1至1:1）进行梯度洗脱，经薄层色谱检测，得到2个亚组分，按照所得组分极性由小到大依次标记为亚组分4.1、亚组分4.2；亚组分4.1采用硅胶h柱色谱洗脱，以二氯甲烷和丙酮按照体积比10:1混合后的溶液为洗脱液，薄层色谱检测、合并，浓缩、干燥，得到化合物2（10.2mg）；亚组分4.2采用sephadexlh-20凝胶柱色谱纯化，以甲醇为洗脱液，薄层色谱检测、合并，浓缩、干燥，得到化合物3（4.7mg）；
5）将洗脱的90%乙醇提取物的第一柱体积和第二柱体积合并在一起，采用硅胶h常压柱色谱分离，以二氯甲烷-丙酮（体积比由40:1至10:1）进行梯度洗脱，然后采用sephadexlh-20凝胶柱色谱纯化，以二氯甲烷和甲醇按照体积比1:1混合后的溶液为洗脱液，薄层色谱检测、合并，浓缩、干燥，得到化合物4（5.0mg）。
运用多种谱学技术鉴定结构如下：
化合物1：根皮苷（1），白色针晶(甲醇),mp.168~169℃,分子式c21h24o10,esi-msm/z:437[m+h]+.1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ:7.03(2h,d,j=8.0hz,h-3,5),6.63(2h,d,j=8.0hz,h-2,6),6.13(1h,s,h-5′),5.93(1h,d,j=4.0hz,h-3′),5.33(1h,d,j=4.0hz,oh-4′′),5.19(1h,d,j=4.0hz,oh-3′′),5.09(1h,d,j=4.0hz,oh-2′′),4.93(1h,d,j=8.0hz,h-1′′),4.63(1h,t,j=8.0,4.0hz,oh-6′′),3.71(1h,m,h-6′′),3.19(1h,t,j=8.4hz,h-2′′),2.78(2h,t,j=8.0,8.0hz,h-β).13c-nmr(dmso-d6,100mhz)δ:29.0(c-β),45.0(c-α),204.7(c=o),131.6(c-1),129.2(c-2,6),115.0(c-3,5),155.3(c-4),105.2(c-1′),165.4(c-2′),96.9(c-3′),164.6(c-4′),94.4(c-5′),160.8(c-6′),100.8(c-1′′),73.2(c-2′′),77.3(c-3′′),69.5(c-4′′),76.7(c-5′′),60.6(c-6′′)。
化合物2：山奈酚（2），黄色粉末(甲醇),分子式为c15h10o6,esi-msm/z:287[m+h]+.1h-nmr(meoh,400mhz)δ:8.08(2h,d,j=6.4hz,h-2´,6´),6.89(2h,d,j=7.6hz,h-3´,5´),6.39(1h,s,h-8),6.18(1h,s,h-6).13c-nmr(100mhz,meoh)δ:146.8(c-2),135.6(c-3),175.9(c-4),156.2(c-5)，99.3(c-6),162.5(c-7),94.4(c-8),162.5(c-9),103.1(c-10),123.9(c-l′),130.6(c-2′),116.3(c-3′),160.4(c-4′),l16.3(c-5′),130.6(c-6′)。
化合物3：根皮素（3），白色粉末(甲醇-水).1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ:7.02(2h,d,j=7.6hz,h-2,6),6.66(2h,d,j=7.6hz,h-3,5),5.76(2h,brs,h-3´,5´),3.21(2h,t,j=7.6hz,h-α),2.75(2h,t,j=7.4hz,h-β).13c-nmr(100mhz,dmso-d6)δ:132.2(c-1),130.1(c-2,6),115.5(c-3,5),155.9(c-4),204.4(c=o),104.2(c-1′),165.4(c-2′,6′),95.1(c-3′,5′),165.9(c-4′),45.8(c-α),30.1(c-β)。
化合物4：β-谷甾醇（4），白色针状结晶(丙酮)，c29h50o，mp138-141℃，ei-msm/z:414.4[m]+。1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ:5.36(1h,brs,h-6),3.52(1h,m,h-3α),0.68(3h,s,ch3-18),0.80(3h,s,ch3-27),0.82(3h,d,j=8hz,ch3-26),0.86(3h,s,ch3-29),0.93(3h,d,j=8hz,ch3-21),1.01(3h,s,ch3-19)；另与β-谷甾醇对照品共薄层，在3种不同展开系统中展开，rf值相同，显色相同。
下面对化合物1~4进行促凝血作用试验。
试验方法：家兔体外血浆凝血四项检测
仪器和试剂：tgl-16gr高速台式冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；lrh-150生化培养箱(上海一恒科技有限公司)；hf6000-4半自动凝血分析仪（济南汉方医疗器械有限公司）；氯化钠注射液（辰欣药业股份有限公司，1603311336）；0.109mol/l枸橼酸钠溶液（自制）、云南白药（云南白药集团股份有限公司，zga1604）；注射用灯盏花素（湖南恒生制药有限公司，15141005）；凝血酶原时间（pt）测定试剂盒（105342）；活化部分凝血酶时间（aptt）测定试剂盒（1121951）；凝血酶时间（tt）测定试剂盒（121192）；纤维蛋白原（fib）含量测定试剂盒（132123）均由上海太阳生物技术有限公司生产。
实验动物：獭兔，雄性，体重2.0~2.5kg，由河南大学药学院中药研究所提供（医动字14-2-6号）。
样品溶液配制：1mg的样品用200μl溶剂溶解制5mg/ml溶液。取灯盏花素8mg用600μl溶剂制得13.33mg/ml，取云南白药1mg用25μl溶剂制得40mg/ml。溶剂（也作为空白溶剂）为：无水乙醇:1,2-丙二醇:生理盐水=1:1:3（体积比）。
血浆的制备：家兔耳缘静脉取血3.6ml，置于含有0.109mol/l枸橼酸钠400μl的4ml离心管中，轻轻颠倒混匀，3000rpm离心15min，取上层清液备用。
具体试验方法：
（1）对aptt影响的检测方法
分别在不同测试杯中加入50μl各个样品溶液，再加入100μl血浆和37℃预温的aptt试剂100μl，37℃孵育5min后加入37℃预温的0.025mol/lcacl2溶液100μl，记录凝固时间。
（2）对pt影响的检测方法
分别在不同测试杯中加入50μl各个样品溶液，再加入100μl的血浆，37℃孵育3min后加入37℃预温的pt试剂200μl，记录凝固时间，即为pt值。
（3）对tt影响的检测方法
分别在不同测试杯中加入50μl各个样品溶液和200μl的血浆，孵育3min后加入tt试剂200μl，记录凝固时间。
（4）对fib影响的检测方法
按照试剂说明书定标准曲线。取200μl血浆和200μl样品，然后加入700μl缓冲液。混匀后，取稀释后的血浆200μl，37℃预温3min，加入凝血酶溶液100μl，记录纤维蛋白原的含量。
试验结果：
结果采用算术平均值和标准差表示，数值统计采用spss19.0软件单因素方差分析法(one-wayanova)比较其显著性差异，测定结果见表1。
表1化合物对家兔凝血时间及纤维蛋白原含量的影响(x±s)
注：与空白比较，***p<0.001<**p<0.01<*p<0.05；
与云南白药比较，###p<0.001<##p<0.01<#p<0.05；
与灯盏花素比较，△△△p<0.001<△△p<0.01<△p<0.05。
由表1可以看出，与空白组相比，化合物2~4可以显著的缩短aptt(p<0.001或p<0.01)，化合物3和4缩短aptt的效果明显优于云南白药（p<0.01）；化合物1可以显著地缩短tt（p<0.001），且效果明显优于云南白药（p<0.001），而化合物3可显著的延长凝血tt（p<0.05），但其作用弱于灯盏花素（p<0.001）；化合物1、3和4能显著的缩短pt（p<0.001），且效果弱于云南白药（p<0.001）；化合物1可显著的降低fib含量（p<0.001或p<0.05），作用弱于云南白药（p<0.001）。可提示化合物1~4均具有一定的促凝血作用。