本发明属于生物工程领域，具体涉及一种截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白及其制备方法，本发明还涉及所述融合蛋白的编码基因。
背景技术：
刺鼠信号蛋白(agoutisignalingprotein,asip)由agouti基因编码,不同物种的agouti基因及刺鼠信号蛋白有较高的同源性。agouti基因编码的刺鼠信号蛋白由131个氨基酸构成，包含n端22个氨基酸残基的信号肽和109个氨基酸残基的功能区。
1994年lu等发现刺鼠相关蛋白(asip)与黑皮素受体(mcr)有高度的亲和力，asip与α-促黑素(msh)竞争性和黑皮素受体-1(mc1r)结合，阻滞α-msh下游的信号传导进而抑制黑素合成。体外黑素细胞培养实验也证实，加入asip可拮抗α-msh，抑制黑素细胞内的camp水平升高、抑制酪氨酸酶trp-1和trp-2的表达，使黑素细胞合成黑素降低。也有实验表明asip在自体移植皮片中能竞争性拮抗α-msh的黑素合成，使皮片着色能力降低，从而证明皮片移植后表皮细胞中α-msh的表达上调是皮片呈过度色素沉着的重要原因。从而可以得出结论，asip对皮肤颜色的影响主要是通过抑制黑素的合成实现的。
刺鼠信号蛋白具有显著的抑制黑色素生成的活性，在皮肤色素沉着中具有很好的应用潜力，但目前还未见到重组刺鼠信号蛋白表达及应用的报道。
技术实现要素：
本发明的发明目的在于提供一种截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白及其制备方法与编码基因。
一方面，本发明提供了一种截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白，包括截短型人刺鼠信号蛋白序列和穿膜肽序列；其中所述截短型人刺鼠信号蛋白序列和所述穿膜肽序列通过连接肽连接。
另一方面，本发明提供了前述融合蛋白的制备方法，包括：
(1)制备质粒：人工全基因合成序列表中的seqidno:4的核苷酸序列，对ppic9k载体及seqidno:4的核苷酸序列进行xhoⅰ和notⅰ双酶切，回收酶切产物，用dna连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒；
(2)转化：将步骤(1)制备的质粒转化毕赤酵母感受态细胞，获得转化后菌落；
(3)多拷贝插入重组子的筛选：将步骤(2)转化后的菌落进行进一步筛选，获得转化子；
(4)发酵：对步骤(3)获得的转化子进行发酵培养获得发酵液；
(5)纯化：将步骤(4)得到的发酵液依次进行固液分离、过滤、浓缩和离子交换层析得到产品。
另一方面，本发明提供了前述融合蛋白的编码基因。
另一方面，本发明提供了含有前述编码基因的表达载体。
另一方面，本发明提供了含有前述编码基因的细胞系。
另一方面，本发明提供了前述融合蛋白在制备药品中的应用。
另一方面，本发明提供了前述融合蛋白在制备化妆品中的应用。
本发明的截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白中的截短型人刺鼠信号蛋白是对天然刺鼠信号蛋白的剪切，选取c端的50个氨基酸，但其仍具有抑制黑色素生成活性；同时在截短型刺鼠信号蛋白的n端添加了细胞穿膜肽，以便于在色素沉着皮肤中的应用时透过皮肤屏障。
附图说明
图1是实施例1中ppic9k-yara-asip50质粒图谱。
图2是实施例1中截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白发酵液纯化前后电泳图。
图3是实施例3中进行的体内抑制酪氨酸酶活性测定结果柱形图。
具体实施方式
为了充分说明本发明解决技术问题所实施使用的技术方案。下面结合实施例和附图对发明做详细说明，但本发明的技术方案、技术方案的实施方式以及保护范围并不仅仅限于此。除非另有说明，否则下文中出现的科技和技术术语具有本领域技术人员通常理解的含义。
刺鼠信号蛋白具有显著的抑制黑色素生成的活性，在皮肤色素沉着中具有很好的应用潜力，但目前还未见到重组刺鼠信号蛋白表达及应用的报道。本发明的发明人分析了人刺鼠信号蛋白功能区序列，去除人刺鼠信号蛋白功能区109个氨基酸n端部分不利于在表达的区域(富含kex2酶切位点)，保留c端50个氨基酸残基，并与细胞穿膜肽融合，实现了在毕赤酵母中表达，作为一种抑制黑色素合成原料，可应用于药品和化妆品。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白，包括截短型人刺鼠信号蛋白序列和穿膜肽序列；其中所述截短型人刺鼠信号蛋白序列和所述穿膜肽序列通过连接肽连接。
其中，截短型人刺鼠信号蛋白序列是人刺鼠信号蛋白c端50个氨基酸的序列或者与其具有至少85％同源性，优选至少90％、93％、95％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列。其中，所述人刺鼠信号蛋白c端50个氨基酸的序列是序列表中seqidno:1的氨基酸序列。发明人通过研究发现，保留人刺鼠信号蛋白序列c端50个氨基酸残基，既去除了人刺鼠信号蛋白序列上不利于表达的区域，又能够有利于融合蛋白的穿膜。
其中，穿膜肽是一类能够携带大分子物质进入细胞的短肽，其穿膜能力不依赖于经典的胞吞作用。在本发明中，穿膜肽序列是序列表中seqidno:2的氨基酸序列，或者，与seqidno:2具有至少85％同源性，优选至少90％、93％、95％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列。
其中，连接肽是由甘氨酸和丝氨酸组成的序列；常用的连接肽均可用于本发明中，例如gggs。
在一种优选的具体实施方式中，本发明的融合蛋白是序列表中seqidno:3的氨基酸序列。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了前述的融合蛋白的制备方法，包括：
(1)制备质粒：人工全基因合成序列表中的seqidno:4的核苷酸序列，对ppic9k载体及seqidno:4的核苷酸序列进行xhoⅰ和notⅰ双酶切，回收酶切产物，用dna连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒；
(2)转化：将步骤(1)制备的质粒转化毕赤酵母感受态细胞，获得转化后菌落；
(3)多拷贝插入重组子的筛选：将步骤(2)转化后的菌落进行进一步筛选，获得转化子；
(4)发酵：对步骤(3)获得的转化子进行发酵培养获得发酵液；
(5)纯化：将步骤(4)得到的发酵液依次进行固液分离、过滤、浓缩和离子交换层析得到产品。
优选地，步骤(5)的纯化的具体步骤为：将步骤(4)得到的发酵液经离心进行固液分离，取上清液，对发酵上清液进行微滤，收集滤液，再进行超滤脱盐浓缩，收集浓缩液，然后进行离子交换层析，即可得到产品。
在一种优选的具体实施方式中，本发明的融合蛋白的制备方法，包括：
(1)制备质粒
人工全基因合成序列表中的seqidno:4的核苷酸序列，然后对ppic9k载体及人工全基因合成的seqidno:4的核苷酸序列进行xhoⅰ和notⅰ双酶切，回收酶切产物，用dna连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒，命名为ppic9k-yara-asip50；
(2)毕赤酵母电转化
将经salⅰ内切酶线性化的ppic9k-yara-asip50质粒，与毕赤酵母感受态细胞混匀，转至冰预冷的电转化杯中，电击4～10毫秒，加入冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布md培养基平板，倒置培养3～4天，在md培养基平板上长出菌落；
(3)多拷贝插入重组子的筛选
将md培养基平板上长出的菌落对应接种到g418浓度分别为1g/l、2g/l、3g/l、4g/l的ypd平板上，30℃培养，筛选获得转化子；
(4)发酵
将筛选到的转化子接种于bmgy培养基中，振荡培养24小时，作为一级种子转接于装有fbs培养基的发酵罐中，ph值为5.0培养16～20小时，作为二级种子转接入装有fbs培养基的大罐发酵，生长温度30℃，诱导温度低于生长温度，ph值为5.5，溶氧控制在>30％，诱导发酵36～42小时；
(5)纯化
将步骤(4)得到的发酵液经离心进行固液分离，取上清液，用孔径为0.22μm中空纤维微滤系统对发酵上清液进行微滤，收集滤液，用截留分子量为1000d的中空纤维超滤系统进行超滤脱盐浓缩，收集浓缩液，采用spsepharoseff进行离子交换层析，即可得到产品。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了前述融合蛋白的编码基因。优选地，所述编码基因是序列表中seqidno:5的核苷酸序列，或者，与seqidno:5具有至少85％同源性，优选至少90％、93％、95％、97％、98％或99％同源性且编码相同功能蛋白的核苷酸序列。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了含有前述编码基因的表达载体。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了含有前述编码基因的细胞系。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了前述融合蛋白在制备药品中的应用。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了前述融合蛋白在制备化妆品中的应用。
在一种特别优选的具体实施方式中，本发明通过如下具体方案实现。
本发明的融合蛋白全长为65个氨基酸，碳端是人刺鼠信号蛋白c端50个氨基酸序列(seqidno:1)，氮端为穿膜肽11个氨基酸序列(seqidno:2)，两肽段之间由柔性连接肽gggs连接，该融合蛋白具有seqidno:3的氨基酸序列，氨基酸序列具体是：yaraaarqaragggsvrprtplsapcvatrnsckppapaccdpcascqcrffrsacscrvlslnc。
上述融合蛋白的制备方法包括如下步骤：
1、截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白表达载体构建
根据设计的截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白氨基酸序列，按照毕赤酵母密码子偏好性，设计并人工全基因合成截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白的核苷酸序列，同时在5’端添加xhoⅰ内切酶切割位点ctcgag和毕赤酵母kex2切割位点序列aaaaga，3’端添加notⅰ内切酶切割位点gcggccgc，序列如下，详见序列表中seqidno:4：
对ppic9k载体及人工全基因合成的截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白的dna序列进行xhoⅰ和notⅰ双酶切，回收酶切产物，用dna连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒，命名为ppic9k-yara-asip50。
2、毕赤酵母电转化
将10μg经salⅰ内切酶线性化的ppic9k-yara-asip50质粒，与80μl毕赤酵母感受态细胞混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中，电击4～10毫秒，加入1ml冰预冷的1mol/l的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布md培养基平板，30℃倒置培养3～4天，在md培养基平板上长出菌落；
3、多拷贝插入重组子的筛选
将md培养基平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种到g418浓度分别为1g/l、2g/l、3g/l、4g/l的ypd平板上，30℃培养，筛选获得转化子，并经摇瓶鉴定；
4、截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白的发酵
将筛选到的转化子接种于400mlbmgy培养基中，30℃振荡培养24小时，作为一级种子转接于装有4lfbs培养基的5l发酵罐中，温度设定为30℃，ph值为5.0，培养16～20小时，作为二级种子转接入装有fbs培养基的50l大罐发酵，生长温度30℃，诱导温度29℃，ph值为5.5，溶氧控制在>30％，诱导发酵36～42小时；
5、截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白的纯化
发酵液经离心进行固液分离，取上清液，对发酵上清液用孔径为0.22μm中空纤维微滤系统进行微滤，收集滤过液，再用截留分子量为1000d的中空纤维超滤系统进行超滤脱盐浓缩，收集浓缩液，然后用spsepharoseff进行离子交换层析，获得纯度为90％以上的截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白。
实施例
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1
1、表达载体的构建
根据设计的截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白氨基酸序列，按照毕赤酵母密码子偏好性，设计并人工全基因合成截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白的核苷酸序列，同时在5’端添加xhoⅰ内切酶切割位点ctcgag和毕赤酵母kex2切割位点序列aaaaga，3’端添加notⅰ内切酶切割位点gcggccgc，序列是序列表中seqidno:4。
对ppic9k载体(购于invitrogen公司)及人工全基因合成的核苷酸序列进行xhoⅰ(购于thermofisher公司)和notⅰ(购于thermofisher公司)双酶切，回收酶切产物，用dna连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒，命名为ppic9k-yara-asip50(质粒图谱如图1所示)。
2、毕赤酵母电转化
将10μg经salⅰ内切酶线性化的ppic9k-yara-asip50质粒，与80μl毕赤酵母感受态细胞混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中，电击4～10毫秒，加入1ml冰预冷的1mol/l的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布md培养基平板，30℃倒置培养3～4天，在md培养基平板上长出菌落；
3、多拷贝插入重组子的筛选
将md培养基平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种到g418浓度分别为1g/l、2g/l、3g/l、4g/l的ypd平板上，30℃培养，筛选获得转化子；
4、融合蛋白的发酵
将筛选到的转化子接种于400mlbmgy培养基中，30℃振荡培养24小时，作为一级种子转接于装有4lfbs(1l中含甘油40g、k2so418.2g、h3po426.7ml、caso4.2h2o0.93g、mgso414.9g、koh4.13g混合制成)培养基的5l发酵罐中，温度设定为30℃，ph值为5.0，培养16～20小时，作为二级种子转接入装有30lfbs培养基的50l大罐发酵。发酵过程中，生长温度30℃，诱导温度29℃，ph值为5.5，溶氧控制在20％～30％，当溶氧陡然上升时，预示基础盐培养基中的甘油已耗尽，开始流加18.15ml/h/l质量百分浓度为50％的甘油，在质量百分浓度为50％甘油中含12ml/l微量元素ptm1(1l中含cuso4.5h2o6g、nai0.08g、mnso4.h2o3g、na2moo4.h2o0.2g、h3bo30.02g、h2so45ml、cocl2.6h2o0.5g、zncl220g、feso4.7h2o75g、生物素0.2g，混合制成)，维持溶氧在>30％。发酵液的湿菌重达到180mg/ml时，停止补料，饥饿1小时，甘油耗尽，流加20l质量百分浓度为75％甲醇诱导发酵，在质量百分浓度为75％甲醇中含12ml/lptm1微量元素，以速率为7.5ml/l/h流加2～3小时，然后提高速率至10.9ml/l/h流加进行发酵。通过调节转速、罐压和通气量使溶氧大于20％，诱导发酵36～42小时。
5、融合蛋白的纯化
5.1发酵液的固液分离及脱色
发酵结束后，发酵液离心分离，取上清液35l，用孔径为0.22μm中空纤维微滤系统进行微滤，收集滤过液，再用截留分子量为1000d的中空纤维超滤系统进行超滤脱盐浓缩，电导率小于1ms/cm时，收集浓缩液，通过上述两步超滤法即可去除毕赤酵母发酵产生的大量黄绿色物质。
5.2离子交换层析
将上述浓缩液进行阴离子交换层析，填料选用spsepharoseff(购于美国ge公司)，用a相为ph为5.8的10mmol/l柠檬酸缓冲液，b相为a相+1mnacl，3倍柱体积的a相平衡，上样，然后用a相+5％b相冲柱，再用10倍柱体积的a相+10％b相洗脱，收集洗脱液，然后用分子量为1000d的卷式超滤膜超滤，脱盐，收集浓缩液，冷冻干燥机冻干，获得纯度为90％以上截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白，纯化结果见图2。
实施例2
截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白的黑素合成抑制率检测:
将纯化好的截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白、刺鼠信号蛋白(包含109氨基酸功能区，购自武汉华美生物)以及美白成份熊果苷(购自西安源森生物)利用培养液稀释浓度分别为药物稀释浓度分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5mol/l。空白对照组仅加入稀释药物所用的相应溶媒。
调整小鼠黑素瘤细胞b16密度，以5×105个/孔接种于6孔板，6h后换液，每孔加入1ml的药物溶液，每个浓度设置3个复孔，对照组加入新鲜培养液代替药物溶液，5％co2，37℃孵育3d后(中间换液一次)，弃去上清液，每孔加入0.25％胰酶1ml于室温下消化5min，加入4ml培养液中止消化，吹打成单细胞悬液，取20μl作细胞计数，其余细胞悬液1500r/min离心5min，弃上液，加入1ml1n的naoh溶液，震荡5min，80℃水浴加热1h后，转移至96孔板，每孔加100μl，选择405nm波长，以空白孔调零，在酶联免疫检测仪上测吸光度值，每一实验重复3次。黑素合成抑制率(％)＝[1-(药物孔吸光度值÷药物孔细胞密度)÷(对照孔吸光度值÷对照孔细胞密度)]×100％。结果见下表，从表中可看出，本发明的融合蛋白对黑素生成具有明显的抑制作用，具有剂量依赖关系，即随剂量的增加对黑素生成的抑制率提高，且与刺鼠信号蛋白具有相似的抑制活性，另外，与天然黑色素抑制剂熊果苷比较，同等剂量黑素合成抑制率高于熊果苷。
表1融合蛋白对黑色素合成的影响
实施例3
截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白体内抑制酪氨酸酶活性测定：
km小鼠18只，雌雄各半，随机分为三组(每组6只)，空白组、刺鼠信号蛋白组、融合蛋白组，用10％硫化钠去除背部毛发，恢复饲养24小时后，按不同组别用棉签涂抹生理盐水、10-1mol/l刺鼠信号蛋白(包含109氨基酸功能区，购自武汉华美生物)、10-1mol/l融合蛋白(实施例1制备的截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白)，每天涂抹两次，涂抹5天后，处死小鼠，取背部皮肤1.5cm×1.5cm，加生理盐水，制备成10％匀浆，离心取上清，按小鼠酪氨酸酶(tyr)elisa试剂盒测定酪氨酸酶活性，按spss统计软件进行统计学分析。结果显示(见图3)，刺鼠信号蛋白组与空白组相比，酪氨酸酶活性明显抑制，差异显著(p<0.05)；融合蛋白组与空白组相比，酪氨酸酶活性明显抑制，差异极显著(p<0.01)；融合蛋白组较刺鼠信号蛋白组酪氨酸酶活性抑制更为明显，二者差异极显著(p<0.01)。
实施例2中研究表明，刺鼠信号蛋白、截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白在体外细胞实验中具有相似的抑制黑色素生成活性。实施例3的体内实验研究表明，截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白具有比刺鼠信号蛋白更为显著的抑制酪氨酸酶活性作用。综合分析说明，截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白可以更为有效的竞争性拮抗α-msh与黑素受体结合，从而抑制酪氨酸酶的表达，使黑素细胞合成黑素降低，在这一透皮吸收过程中，融合蛋白中的穿膜肽发挥着重要作用。
本发明在上文中已以优选实施例公开，但是本领域的技术人员应理解的是，这些实施例仅用于描绘本发明，而不应理解为限制本发明的范围。应注意的是，凡是与这些实施例等效的变化与置换，均应设为涵盖于本发明的权利要求范围内。因此，本发明的保护范围应当以权利要求书中所界定的范围为准。
序列表
<110>陕西慧康生物科技有限责任公司
<120>截短型人刺鼠信号蛋白与穿膜肽的融合蛋白及其制备方法与编码基因
<160>5
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>50
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
valargproargthrproleuseralaprocysvalalathrargasn
151015
sercyslysproproalaproalacyscysaspprocysalasercys
202530
glncysargphepheargseralacyssercysargvalleuserleu
354045
asncys
50
<210>2
<211>11
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
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tyralaargalaalaalaargglnalaargala
1510
<210>3
<211>65
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
tyralaargalaalaalaargglnalaargalaglyglyglyserval
151015
argproargthrproleuseralaprocysvalalathrargasnser
202530
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354045
cysargphepheargseralacyssercysargvalleuserleuasn
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cys
65
<210>4
<211>218
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
ctcgagaaaagatacgctagagctgctgctagacaagctagagctggtggtggtagtgtt60
agaccaagaaccccattgtccgctccatgtgttgctaccagaaactcctgtaagccacca120
gctccagcttgttgtgacccatgtgcttcctgtcaatgtagattcttcagatccgcttgt180
tcctgtagagttttgtccttgaactgttaagcggccgc218
<210>5
<211>195
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
tacgctagagctgctgctagacaagctagagctggtggtggtagtgttagaccaagaacc60
ccattgtccgctccatgtgttgctaccagaaactcctgtaagccaccagctccagcttgt120
tgtgacccatgtgcttcctgtcaatgtagattcttcagatccgcttgttcctgtagagtt180
ttgtccttgaactgt195