本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种表皮生长因子活性肽及其制备与应用。
背景技术：
表皮生长因子(egf)是一类重要的生长因子，是类egf大家族的一个成员。它是由50-60个氨基酸分子组成的肽链，链中含有6个半胱氨酸分子，半胱氨分子间形成稳定的双硫键。使整条肽链成为三个环联部分的活性物质。它是1962年科恩博士在一次实验中偶然发现的。
它是一种广泛存在于人或其它动物体内的小分子多肽，极微量即能强烈刺激细胞生长、抑制衰老基因的出现，延缓表皮细胞衰老。他通过与其受体相结合发挥作用。
表皮生长因子通过与细胞表面的受体表皮生长因子受体(egfr)结合而起作用。与表皮生长因子受体的高亲和力结合，激发受体内在的酪氨酸激酶的活性，从而启动了信号传导级联而导致多种生物化学变化，细胞内钙水平上升，增加糖酵解与蛋白质合成,增加某些基因(包括表皮生长因子受体)的表达，最终导致dna合成和细胞增殖。
20世纪80年代初，中国就已将表皮生长因子应用于创伤治疗中，效果显著。进入到21世纪初，美国(fda、sfda)将表皮生长因子列入药典后，又兴起基因工程、(克隆)人工重组产业化、规模大投资高。但单纯的表皮生长因子医学临床应用效果不稳定，用量不易控制。
大多数血液和组织中存在的多肽生长因子具有短至几分钟的体内半寿期。很可能，egf显示出差的结构稳定性。另外，因为egf是生物学不稳定的和生理化学异质的，所以它可能显示降低的治疗功效。其皮肤渗透性极差。因此，依旧需要开发出具有改善的稳定性和皮肤渗透能力并且具有egf固有活性的新物质。
技术实现要素：
本发明的目的就是为了提供一种表皮生长因子活性肽cys-met-tyr-ile-glu-连接体-arg-gly-asp及其制备与应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明第一方面，提供一种生物活性肽，其氨基酸序列为cys-met-tyr-ile-glu-连接体-arg-gly-asp，其中，所述连接体由gly(n)表示，且n为2-10的整数。
较优的，所述生物活性肽具有刺激细胞生长、抑制衰老基因的出现，延缓表皮细胞衰老的功能。
为了开发出与天然产生的人表皮生长因子具有相同作用且与天然产生的egf相比具有更加提高的稳定性和皮肤渗透性的肽，制备方法如下：
开发策略：首先，将本发明的肽设计包含两个区域，egf衍生的序列(即egf活性区域)和细胞附着区域。egf活性区域选自天然产生的egf氨基酸序列中。为了提高本发明的肽的egf活性，细胞附着区域选自细胞外基质蛋白之一的纤连蛋白。
最终选择的egf活性区域包含氨基酸序列“cys-met-tyr-ile-glu”，最终选择的细胞附着区域包含氨基酸序列“arg-gly-asp”。此外，与直接连接相比，优选经由连接体间接连接两个区域。
使egf活性区域和细胞附着区域互相连接的连接体包括本领域技术人员可利用的任何连接体。优选地，所述连接体包含多个氨基酸。本发明中适合的连接体包含具有不带电侧链的氨基酸，优选为gly或者gly或ser。优选地，所述连接体的长度为2～18个氨基酸残基。更优选地，所述连接体包含2～10个gly残基。由氨基酸残基(特别是gly残基)组成的连接体有助于本发明的肽的稳定性。
即使本发明的肽本身比天然产生的egf具有更高的稳定性，对其的修饰能使其具有高得多的稳定性。优选地，本发明的肽在其n-末端或c-末端具有选自由乙酰基、荷基甲氧羰基、甲酰基、棕榈酰基、肉豆蔻基、硬脂酰基或聚乙二醇(peg)组成的组中的保护基。保护基也是本发明的肽具有稳定性的原因。肽的c-末端被修饰具有氨基，这样提高了肽的稳定性。本文所用的术语"稳定性"指体内稳定性和贮藏稳定性(例如，在室温下的贮藏稳定性)。
上述的保护基保护肽免受体内蛋白酶的攻击。位于肽的c-末端的asp残基另外连接到作为保护基的ala或gly残基(更优选为gly残基)上。根据最优选的实施方式，所述肽包含下式所述的氨基酸序列：
cys-met-tyr-ile-glu-gly(n)-arg-gly-asp-gly
其中，n为2～8的整数。
本文所用的术语“肽”指通过肽键连接氨基酸残基形成的线型分子。
本发明第二方面，提供所述活性肽的制备方法，包括采用化学合成的方法合成，尤其是固相合成技术来制备。
本发明的肽具有天然产生的人egf活性并且对如酸和碱的生理化学因子显示出较高的稳定性。本发明的具有显著的长期贮藏稳定性的肽可以有利地用于需要长期贮藏的产品中，例如药物、准药、化妆品和牙齿/口腔清洁或护理产品。
本发明第三方面，所述活性肽在制备用于延缓表皮细胞衰老的药物、食品或保健品中的应用。一种延缓衰老的保健品，包含所述活性肽，能够促进细胞中产生自分泌egf，对需要egf活性的疾病或状态显示出极好的治疗和预防功效，促进表皮组织上皮细胞、角质细胞、成纤维细胞等多种细胞的生长、分裂，加快新陈代谢，增强其表皮细胞活性，从而使细胞保持质与量的完善。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
实施例1:
nh2-cys-met-tyr-ile-glu-gly(n)-arg-gly-asp-gly-0h的合成
向反应器中加入700mg氯三苯甲基氯树脂(ctl树脂，novabiochem，目录号01-64-0021)，向该反应器中加入10ml二氯甲烷(mc)，搅拌3分钟。除去溶液后，向生成物中加入10ml二甲基甲酰胺(dmf)，再次搅拌3分钟，之后除去溶剂。向该反应器中加入ioml二氯甲烷溶液，然后向反应器中加入200mmolfmoc-gly-0htyr(tbu)-oh和400mmoldiea(n,n，-二异丙基乙胺)，之后通过搅拌溶解该混合物，然后搅拌同时进行反应l小时。
洗涤后，使溶于mc中的甲醇和diea(2:1)与树脂反应io分钟，然后用过量dcm/dmf(1:1)洗涤该生成物。除去溶液后，向生成物中加入iomldmf并搅拌3分钟，随后除去溶剂。向反应器中加入10ml脱保护溶液(20％哌啶/dmf)且在室温下搅拌io分钟，接着除去溶液。加入相同体积的脱保护溶液后，进行反应10分钟并且除去溶液，随后依次用dmf、mc和画f洗涤以制得gly-ctl树脂。向新的反应器中加入10mldmf溶液，随后搅拌溶解。
向该反应器中加入400mmoldiea并且进行搅拌以溶解全部固体含有物。将溶解的氨基酸溶液引入容纳脱保护树脂的反应器中并且在室温下在搅拌的同时进行反应1小时。在除去反应溶液后，用dmf溶液搅拌生成物3次以除去未反应的残余物。取反应后的树脂通过茚三酮试验评价反应程度。使用脱保护溶液，以与上述相同的方式进行2次脱保护以制得asp(tbu)-gly-ctl树脂。用dmf和mc洗涤后，进行茚三酮试验然后如上所述进行氨基酸的顺序连接。
基于本发明人设计的氨基酸序列，将fmoc-gly、fmoc-arg(pbf)、fmoc-gly(n个)、fmoc-glu(tbu)、fmoc-ile、fmoc-tyr(tbu)、fmoc-met和fmoc-cys(trt)依次连接到树脂上。设置在肽的中间部分的gly残基的数目可以通过用fmoc-gly进行28次反应而变化，产生7种类型的肽基树脂。
用mc和甲醇分别洗涤所制备的肽基树脂三次并且在氮气气氛下干燥，之后在pa下通过真空干燥。在室温下间歇搅拌下使干燥的树脂与30ml离去溶液[包含81.5。/。三氟乙酸(tfa)、5％蒸馏水、5％苯硫基甲烷、5％苯酚、2.5％edt和1％tis]反应2小时。过滤并用少量tfa溶液洗涤该树脂，之后将滤出液与母液合并。在减压下蒸馏以减小至总体积的一半后，使用50ml冷醚诱导沉淀并且通过离心法收集形成的沉淀，随后用冷醚洗涤2次。除去母液后，在氮气气氛下干燥该生成物以制得未纯化的7种类型的肽：
nhcys-met-tyr-ile-glu-gly(n)-arg-gly-asp-gly-0h。在它们中，
nh2-cys-met-tyr-ile-glu-gly-gly-gly-gly-arg-gly-asp-gly-0h组成的肽(在下文中称为十三肽)产量为0.82g并且使用分子量分析器测定的分子量为1272.0。本发明合成的十三肽分析具有大约20分钟的保留时间，说明所制得的肽具有适合的纯度。
实施例2:稳定性的评价
为评价实施例1所合成和纯化的十三肽的稳定性，在
50mmtris-hcl(ph8.0)中溶解十三肽至浓度为10ug/ml。将在大肠杆菌中产生的重组egf蛋白以相同缓冲液至浓度为1ug/ml而制成对照。将该制备的溶液引入玻璃瓶中并静置。而后，将该溶液在第0、1、10、25、50、75和100天取出并使用nih-3t3细胞(koreancelllinebank)进行mtt分析来确定肽和egf的剩余活性。结果给出与第0天取出的样品的活性(100％)的相对值。随着时间的流逝，重组egf蛋白的活性急剧下降。相反，本发明的十三肽的活性显示其不随时间过去而降低。这些结果使我们推出本发明的egf肽与具有全长氨基酸残基的egf蛋白相比具有显著提高的稳定性。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。