一种利用育性基因S44获得水稻雄性不育系的方法与流程

文档序号：17945766发布日期：2019-06-18 23:36阅读：366来源：国知局

本发明属于生物技术领域，具体涉及植物杂交育种方法，包括不育系繁殖和杂交种子制备，更具体地涉及一个育性基因s44及其突变体及其在杂交育种中的应用。

技术背景

杂交育种是提高农作物产量及其质量的重要方法，杂交种通常比常规种具有明显的产量、抗性和适应性优势，杂交种的选育通常也比常规种选育周期短、见效快。目前杂交育种已经成为许多作物的主要育种方法。

作物雄性不育系的选育是杂交育种的关键环节。雄性不育系是雄配子发育缺陷、雌配子发育正常的植物个体，作为母本接受来自父本的花粉。雄性不育系的选育需要考虑几个因素：1、杂交配组：不育系与相应的父本植物组合产生具有优良性状的杂交后代；2、不育系的繁殖：不育系能在一定条件下恢复育性使其得到保持；3、不育系自身繁殖以及杂交制种效率：好的不育系必须易于繁殖，而且杂交制种产量高。目前用于水稻杂交育种的雄性不育系包括细胞质不育系和细胞核不育系。细胞质雄性不育杂交育种体系涉及雄性不育系、恢复系和保持系，即所谓的“三系法”。三系杂交法需要有特定的恢复系和保持系，不但制种过程复杂，还大大限制了杂种优势对不同品种资源的利用。与“三系法”对应的“两系法”利用核基因控制的不育系和该不育系在特定生长环境条件下恢复育性的特点，使恢复系和保持系合二为一。与“三系法”相比，“两系法”具有明显的优势，既省去了保持系而简化了杂交种子的生产程序，且大大扩展了父本的选择范围，可以将各种优良性状组合到杂交后代中。

两系法杂交水稻是利用光温敏不育系水稻为基本材料培育的。运用两系法杂交水稻育种技术，中国分别于2000年、2004年、2012年先后实现了超级稻育种计划第一期亩产700公斤、第二期亩产800公斤、第三期亩产900公斤的育种目标，实现了超级杂交稻超高产、米质优、抗性强的有机结合，目前正在助力冲击第四期亩产1000公斤的育种目标。两系杂交水稻，稻米品质优，具有更丰富的营养，米饭清香可口，营养价值更高。用于两系杂交的不育系的关键特性是：在一定的条件下不育系保持不育性，可用于杂交制种；而条件改变时不育系可恢复育性自身繁殖，达到保持该不育系的目的。2014年1月10日，2013年度国家科学技术奖励大会在北京人民大会堂举行，袁隆平率领的“两系法杂交水稻技术研究与应用”获国家科技进步奖特等奖。

两系杂交技术在水稻中的成功应用，为提高产量、改进品质、增加抗性和适应性作出了重要贡献，在植物育种上具有重要的应用价值，但目前“两系杂交法”仍存在问题：光温敏材料的育性易受外界环境因素影响，低温会诱导不育系自交结实导致杂交种子纯度不达标，且多数光温敏核雄性不育系自交结实率低，繁殖产量不稳定。因此，如何在“三系法”和“两系法”的基础上，研究出对资源利用率高、杂交制种安全、更易于培育高产、优质、多抗杂交水稻的新技术已成为杂交水稻发展的迫切要求。并且，雄性不育是杂交育种过程的技术核心，但多数与水稻花药及小孢子发育相关的基因的分子机制及复杂的调控网络尚不清楚，从遗传学、细胞学、分子生物学以及生理生化等多层次共同研究花药发育的机制，有利于更为详尽全面地了解这一过程，促进水稻杂交技术在育种工作中的应用。

本发明通过ems诱变水稻籼稻品种“黄华占”，筛选得到一个由单个隐性核基因控制的雄性不育突变体，通过对其进行表型鉴定、遗传分析和遗传背景鉴定，并利用mutmap方法、高分辨率熔解曲线分析(high-resolutionmeltingcurveanalysis,hrm)技术和基因序列分析，成功定位并克隆了一个育性调节基因s44，该基因的突变可导致水稻产生雄性不育表型，通过调节该基因的表达可调控植物育性，用以获得植物雄性不育系以及调控植物育性的方法。本发明对于研究植物的花药发育机制和水稻杂交育种工作具有重要的意义和应用价值。且由于此基因会引起内外桴的形变，更方便区分杂交种子和自身繁殖所用的种子，为后期的种子分选增加了另一道保险。

技术实现要素：

本文提到的所有参考文献都通过引用并入本文。

除非有相反指明，本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。除非有相反指明，本文所使用的或提到的技术是本领域普通技术人员公知的标准技术。材料、方法和例子仅作阐述用，而非加以限制。

本发明提供了一个育性调节基因s44，所述该基因的点突变可影响其对植物雄性器官发育的调控，其核苷酸序列选自下列组的序列之一：

(a)如seqidno：1、2、4、5、20、21、23或24所示的核苷酸序列；

(b)其编码氨基酸序列如seqidno：3、6、22或25所示的核苷酸序列；

(c)在严谨条件下能够与(a)或(b)中所述序列的dna杂交的dna序列；或

(d)与(a)-(c)所述序列有至少80％(优选为至少85％)序列相似性，且具有育性调控功能的dna序列；或

(e)与(a)-(d)之任一所述序列互补的dna序列。

本领域技术人员应该知晓，本发明所述的育性调节基因还包括与s44基因的核苷酸序列或蛋白序列高度同源，并且具有同样的调控植物育性功能的高度同源的功能等价体序列。所述高度同源的功能等价体序列包括在严谨条件下能够与具有seqidno：1、2、4、5、20、21、23或24所示序列的dna杂交的dna序列，或是其编码的氨基酸序列与seqidno：3、6、22或25所示的蛋白氨基酸序列具有85％以上相似性的核苷酸序列。本文中使用的“严谨条件”是公知的，包括诸如在含400mmnacl、40mmpipes(ph6.4)和1mmedta的杂交液中杂交，所述杂交的温度优选是53℃-60℃，杂交时间优选为12-16小时，然后用含0.5×ssc、和0.1％sds的洗涤液洗涤，洗涤温度优选为62℃-68℃，洗涤时间为15-60分钟。

功能等价体序列还包括与本发明所公开的s44基因所示的序列有至少80％、85％、90％、95％、98％、或99％序列相似性，且具有调控植物育性功能的dna序列，可以从任何植物中分离获得。其中，序列相似性的百分比可以通过公知的生物信息学算法来获得，包括myers和miller算法、needleman-wunsch全局比对法、smith-waterman局部比对法、pearson和lipman相似性搜索法、karlin和altschul的算法，这对于本领域技术人员来说是公知的。

本发明所述的基因序列可以从任何植物中分离获得，包括但不限于芸苔属、玉米、小麦、高粱、两节荠属、白芥、蓖麻子、芝麻、棉籽、亚麻子、大豆、拟南芥属、菜豆属、花生、苜蓿、燕麦、油菜籽、大麦、燕麦、黑麦(rye)、粟、蜀黍、小黑麦、单粒小麦、斯佩尔特小麦(spelt)、双粒小麦、亚麻、格兰马草(grammagrass)、摩擦禾、假蜀黍、羊茅、多年生麦草、甘蔗、红莓苔子、番木瓜、香蕉、红花、油棕、香瓜、苹果、黄瓜、石斛、剑兰、菊花、百合科、棉花、桉、向日葵、芸苔、甜菜、咖啡、观赏植物和松类等。优选地，植物包括玉米、大豆、红花、芥菜、小麦、大麦、黑麦、稻、棉花和高粱。具体地，育性基因s44在籼稻黄华占中的基因组dna序列如seqidno:1所示，编码区dna序列如seqidno:2所示，氨基酸序列如seqidno:3所示；在粳稻日本晴中的基因组dna序列如seqidno:4所示，编码区dna序列如seqidno:5所示，氨基酸序列如seqidno:6所示。

本发明还提供了一种表达盒，所述表达盒含有本发明所公开的育性调节基因s44的dna序列，所述育性调节基因的核苷酸序列选自下列组的序列之一：

(a)如seqidno：1、2、4、5、20、21、23或24所示的核苷酸序列；

(b)其编码氨基酸序列如seqidno：3、6、22或25所示的核苷酸序列；

(c)在严谨条件下能够与(a)或(b)中所述序列的dna杂交的dna序列；或

(d)与(a)-(c)所述序列有至少80％(优选为至少85％)序列相似性，且具有育性恢复功能的dna序列；或

(e)与(a)-(d)之任一所述序列互补的dna序列。

具体地，上述表达盒中的育性调控基因还可操作性的连有一个可驱动其表达的启动子，所述启动子包括但不限于组成型表达启动子、诱导型启动子、组织特异表达启动子、时空特异表达启动子等。本发明所述的组成型启动子的基因表达不具有组织和时间特异性，外界因素对组成型启动子启动的外源基因表达几乎没有影响。所述组成型启动子包括但不限于camv35s、fmv35s、水稻肌动蛋白(actin1)启动子、玉米泛素(ubiquitin)启动子等。本发明所述的组织特异性启动子除包含应有的一般启动子元件外，还具有增强子以及沉默子的特性，该类启动子的优点在于可启动基因在植物特定组织部位的表达，避免外源基因的不必要表达，从而节约植物体的整体能量消耗。本发明所述的诱导型启动子是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下，可以大幅度地提高基因的转录水平的启动子，目前已经分离的诱导型启动子包括但不限于逆境诱导表达启动子、光诱导表达启动子、热诱导表达启动子、创伤诱导表达启动子、真菌诱导表达启动子和共生细菌诱导表达启动子等。本发明所述的组织特异性启动子包括但不限于ltp2种子特异表达启动子、end2种子特异表达启动子、糊粉层特异表达启动子等。更具体地，本发明所述启动子是一个花粉特异表达启动子，优选地，所述花粉特异表达启动子的核苷酸序列如seqidno：9所示。

本发明上述表达盒，还进一步的包含一个花粉失活基因，所述花粉失活基因可以干扰植株中含有该花粉失活基因的雄性配子的功能或形成。所述花粉失活基因包括但不限于barnase基因、淀粉酶基因、dam甲基化酶等，更具体的，所述花粉失活基因是玉米α淀粉酶基因zm-aa。

本发明上述表达盒，还进一步的可以包含一个筛选基因，所述筛选基因可以用于将含有该表达盒的植株、植物组织细胞或载体筛选出来。所述筛选基因包括但不限于抗生素抗性基因、或是抗除草剂基因、或是荧光蛋白基因等。具体地，所述筛选基因包括但不限于：氯霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、链霉素抗性基因、奇霉素抗性基因、磺胺类抗性基因、草甘磷抗性基因、草丁膦抗性基因、bar基因、红色荧光基因dsred、mcherry基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因等。

本发明还提供了一种调控植物育性的方法，即通过影响s44基因的核苷酸序列或者调控s44基因的转录表达来调控植物的育性。所述影响植株育性是指通过调控s44基因的表达，从而使所述植株的育性发生改变，如导致植株雄性不育或使相应的s44基因突变所导致的雄性不育突变体恢复成可育。具体地，取决于具体应用需求，可以通过多种方法来影响s44基因在植物体内的表达，从而达到调控植株雄性育性的效果。更具体地，调控s44基因的表达可以使用许多本领域普通技术人员可获得的工具进行，例如，通过突变、诱变、反义基因的转入、共抑制或发夹结构的引入等，都可以用于破坏s44基因的正常表达，从而获得雄性不育的植株。另一方面，本发明还包括通过将野生型s44基因的核苷酸序列引入突变体植株来恢复s44基因表达被破坏的植株的雄性生育力。

本发明还提供一种获得s44雄性不育突变体材料的方法，所述方法通过突变植物内源的育性调控基因s44，或突变与其高度同源的基因的核苷酸序列，使该植物体丧失雄性育性的过程。所述育性调控基因s44的核苷酸序列如seqidno：1或2所示，所述育性调控基因s44的氨基酸序列如seqidno：3所示。所述“突变”包括但不限于以下方法，如用物理或化学的方法所导致的基因突变，化学方法包括用ems等诱变剂处理所导致的诱变，所述突变还可以是点突变，也可以是dna缺失或插入突变，也可以是通过rnai等基因沉默手段或者通过基因定点突变的方法，所述基因定点突变的方法包括但不限于zfn定点突变方法、talen定点突变方法、和/或crispr/cas9等基因编辑方法。

本发明还提供了一种s44雄性不育突变体材料的应用方法，其特征在于所述突变材料是由s44基因的核苷酸序列的突变所造成，含有突变型s44基因的植株具有雄性不育的表型，其中所述核苷酸序列为s44基因的核苷酸序列，优选如seqidno：1或2所示。具体地，在本发明所提供的水稻雄性不育突变体中，s44基因的第9个外显子上发生一个单碱基突变，即鸟嘌呤(g)变为胞嘧啶(t)，对应蛋白产物的第354位氨基酸由甘氨酸(gly)变为亮氨酸(leu)(见图5)，导致得到的转录本与蛋白产物均发生变化，从而使植物丧失育性，突变后的核苷酸序列如seqidno:7所示，氨基酸序列如seqidno:8所示。所述突变体材料的应用，包括但不限于在杂交育种中的应用，更具体的是指将s44突变体植株作为不育系母本，与恢复系杂交，生产杂交种子。

本发明上述突变体材料的应用，还包括上述dna序列或突变体材料在以下(a)至(d)中任一项中的应用：

(a)培育植物品种或品系；

(b)培育授粉受精能力增强的植物品种或品系；

(c)培育授粉受精能力消弱的植物品种或品系；

(d)培育雄性不育植物品种或品系。

本发明还公开了一种雄性不育系的保持方法，所述方法以s44纯合突变体为转化受体材料，将紧密连锁的3个目标基因转化至该不育突变体受体植株中。所述3个目标基因分别是育性调控基因s44、花粉失活基因和筛选标记基因。其中，育性调控基因s44可使不育的转化受体育性恢复，花粉失活基因可使含有转化的外源基因的花粉失活，即失去授精能力，筛选基因可以用于转基因种子或组织和非转基因种子或组织的分拣，分拣出的非转基因种子用作不育系生产杂交种，转基因种子用作保持系来源源不断地、稳定地生产不育系。

上述雄性不育系的保持方法中，所述的花粉失活基因包括但不限于barnase基因、淀粉酶基因、dam甲基化酶等。更具体的，所述花粉失活基因是玉米α淀粉酶基因zm-aa。所述花粉失活基因与偏好于雄性配子表达的启动子相连。更具体地，所述偏好于雄性配子表达的启动子包括但不限于pg47启动子、zm13启动子等。所述筛选基因可以用于将含有该表达盒的植株或载体筛选出来。所述筛选基因包括但不限于抗生素抗性基因、或是抗除草剂基因、或是荧光蛋白基因等。具体地，所述筛选基因包括但不限于：氯霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、链霉素抗性基因、奇霉素抗性基因、磺胺类抗性基因、草甘磷抗性基因、草丁膦抗性基因、bar基因、红色荧光基因dsred、mcherry基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因等。

更具体地，本发明还公开了一种雄性不育系的繁殖方法，所述方法包括以下步骤：

(a)向s44雄性不育系中转入下述载体，以获得含有下述载体的保持系，所述载体包含：育性调控基因s44，所述育性调控基因s44可以恢复s44雄性不育系的雄性生育力；和花粉失活基因，所述花粉失活基因表达时，会干扰植株中含有该花粉失活基因的雄性配子的功能或形成，从而使得所述植株中产生的具有活性的雄性配子均不含所述载体；和筛选基因，所述筛选基因可以用于转基因种子或组织和非转基因种子或组织的分拣。

(b)将转入上述载体后形成的保持系植株自交，同时产生不含载体的s44雄性不育系和含载体的保持系种子；或是将保持系植株的花粉赶到s44雄性不育系植株上，使s44雄性不育系授粉繁殖出不含载体的s44雄性不育系的种子。

上述雄性不育系的繁殖方法中，所述的花粉失活基因包括但不限于barnase基因、淀粉酶基因、dam甲基化酶等。更具体的，所述花粉失活基因是玉米α淀粉酶基因zm-aa。所述花粉失活基因与偏好于雄性配子表达的启动子相连。更具体地，所述偏好于雄性配子表达的启动子包括但不限于pg47启动子、zm13启动子等。

所述筛选基因可以用于将含有该表达盒的植株或载体筛选出来。所述筛选基因包括但不限于抗生素抗性基因、或是抗除草剂基因、或是荧光蛋白基因等。具体地，所述筛选基因包括但不限于：氯霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、链霉素抗性基因、奇霉素抗性基因、磺胺类抗性基因、草甘磷抗性基因、草丁膦抗性基因、bar基因、红色荧光基因dsred、mcherry基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因等。

本发明还公开了一种保持系的生产方法，所述方法包括以下步骤：向s44雄性不育系中转入下述载体，即获得了s44雄性不育系的保持系，所述载体包含：育性调控基因s44，所述育性调控基因s44可以恢复s44雄性不育系的雄性生育力；和花粉失活基因，所述花粉失活基因表达时，会干扰植株中含有该花粉失活基因的雄性配子的功能或形成，从而使得所述植株中产生的可育雄性配子都是不含所述载体的；和筛选基因，所述筛选基因可以用于转基因种子和非转基因种子的分拣。

上述保持系的生产方法中，所述的花粉失活基因包括但不限于barnase基因、淀粉酶基因、dam甲基化酶等，更具体的，所述花粉失活基因是玉米a淀粉酶基因zm-aa。所述花粉失活基因与偏好于雄性配子表达的启动子相连。更具体地，所述偏好于雄性配子表达的启动子包括但不限于pg47启动子、zm13启动子等。所述筛选基因可以用于将含有该表达盒的植株或载体筛选出来。所述筛选基因包括但不限于抗生素抗性基因、或是抗除草剂基因、或是荧光蛋白基因等。具体地，所述筛选基因包括但不限于：氯霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、链霉素抗性基因、奇霉素抗性基因、磺胺类抗性基因、草甘磷抗性基因、草丁膦抗性基因、bar基因、红色荧光基因dsred、mcherry基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因等。

本发明还公开了一种保持系的繁殖方法，所述方法包括以下步骤：

(a)向s44雄性不育系中转入下述载体，即获得了s44雄性不育系的保持系，所述载体包含：育性调控基因s44，所述育性调控基因s44可以恢复s44雄性不育系的雄性生育力；和花粉失活基因，所述花粉失活基因表达时，会干扰植株中含有该花粉失活基因的雄性配子的功能或形成，从而使得所述植株中产生的可育雄性配子都是不含所述载体的；和筛选基因，所述筛选基因可以用于转基因种子和非转基因种子的分拣；和

(b)将转入上述载体后形成的保持系植株自交，即按1:1的比例繁殖获得了不含载体的s44雄性不育系种子和含载体的保持系种子。

本发明还公开了一种种子的生产方法，所述方法包括：

(a)向s44雄性不育系中引入下述载体，获得s44雄性不育系的保持系，所述载体包含：育性调控基因s44，所述育性调控基因s44可以恢复s44雄性不育系的雄性生育力；和花粉失活基因，所述花粉失活基因表达时，会干扰植株中含有该花粉失活基因的雄性配子的功能或形成，从而使得所述植株中产生的可育雄性配子都是不含所述载体的。

(b)将转入上述载体后的保持系植株自交；和

(c)自交后即获得含有所述载体的保持系种子和不含载体的s44雄性不育系。

本发明上述的雄性不育系的繁殖或保持方法、保持系的生产方法或繁殖方法、种子的生产方法等中，其中步骤(a)也可以是向普通的植株中引入含有育性调控基因s44、花粉失活基因和筛选基因的载体，获得含有所述载体的转基因植株后，再与s44雄性不育系杂交，经过定向选育，获得背景为s44雄性不育系、并且含有所述载体的保持系植株。

本发明上述的雄性不育系的繁殖方法或保持方法、保持系的生产方法或繁殖方法、种子的生产方法等中，其中所述的育性调控基因的核苷酸序列选自下列组的序列之一：

(a)如seqidno：1、2、4、5、20、21、23或24所示的核苷酸序列；

(b)其编码氨基酸序列如seqidno：3、6、22或25所示的核苷酸序列；

(c)在严谨条件下能够与(a)或(b)中所述序列的dna杂交的dna序列；或

(d)与(a)-(c)所述序列有至少80％(优选为至少85％)序列相似性，且具有育性恢复功能的dna序列；或

(e)与(a)-(d)之任一所述序列互补的dna序列。

上述育性调控基因s44还可操作性的连有一个花粉特异表达的启动子，可以驱动s44基因在植物花粉中的表达。所述花粉特异表达的启动子选自由ms26、np1、msp1、pair1、pair2、zep1、mell、pss1、tdr、udt1、gamyb4、ptc1、api5、wda1、cyp704b2、ms26、ms22、dpw、mads3、osc6、rip1、csa、aid1、5126或ms45等育性调控基因的启动子构成的组之一。更具体的，所述花粉特异表达启动子的核苷酸序列如seqidno：9所示。

上述育性调控基因s44还可操作性的连有一个终止子，所述终止子可以是已经公开的任一个基因的终止子。

本发明上述的雄性不育系的繁殖或保持方法、保持系的生产方法或繁殖方法、种子的生产方法等中，所述的花粉失活基因包括但不限于barnase基因、淀粉酶基因、dam甲基化酶等。更具体的，所述花粉失活基因是玉米a淀粉酶基因zm-aa。所述花粉失活基因与偏好于雄性配子表达的启动子相连。更具体地，所述偏好于雄性配子表达的启动子包括但不限于pg47启动子、zm13启动子等。

本发明上述的雄性不育系的繁殖或保持方法、保持系的生产方法或繁殖方法、种子的生产方法等中，其中所述的筛选基因包括但不限于抗生素抗性基因、除草剂抗性基因或荧光基因。具体地，所述筛选基因包括但不限于：氯霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、链霉素抗性基因、奇霉素抗性基因、磺胺类抗性基因、草甘磷抗性基因、草丁膦抗性基因、bar基因、红色荧光基因dsred、mcherry基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因等。

本发明还提供了一种花药特异表达启动子，相应启动子的序列为s44基因从atg到上游大约2500bp核苷酸组成的序列，更具体地，在水稻中，所述s44基因启动子的核苷酸序列如seqidno：9所示。将seqidno：9与报告基因gus相连，转化植物，对转基因阳性植株的根、茎、叶和花等部位进行gus染色分析，发现s44基因的启动子能驱动gus在花粉中特异表达，说明s44基因启动子为花粉特异型启动子。

本发明所提供的植物花药特异表达启动子，含有序列表中如seqidno：9所示的核苷酸序列，或包含与seqidno：9中所列核苷酸序列具有90％以上相似性的核苷酸序列，或包含来源于seqidno：9序列上的500个及500以上连续的核苷酸片段，并且可以驱动与该启动子操作性连接的核苷酸序列在植物花粉中的表达。含有上述序列的表达载体、转基因细胞系以及宿主菌等均属于本发明的保护范围。扩增本发明所公开的seqidno：9启动子的任一核苷酸片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明所提供的启动子核苷酸序列还可用于从水稻以外的其它植物中分离相应序列，尤其是从其他单子叶植物中进行同源克隆。根据这些相应序列与本文所列启动子序列间的序列同源性，或与本启动子基因的同源性，使用如pcr、杂交等技术来鉴别分离这些相应序列。因此，根据它们与本发明所列的seqidno：9启动子序列(或其片段)间的序列相似性而分离的相应片段，也包括在实施方案中。

本发明所述的“启动子”是指一种dna调控区域，其通常包含能指导rna聚合酶ii在特定编码序列的合适转录起始位点起始rna合成的tata盒。启动子还可包含其它识别序列，这些识别序列通常位于tata盒的上游或5’端，通常被称为上游启动子元件，起调控转录效率的作用。本领域技术人员应该知晓，虽然已经鉴定了针对本发明公开的启动子区域的核苷酸序列，但是分离和鉴定处于本发明鉴定的特定启动子区域的tata盒上游区域的其它调控元件也在本发明的范围内。因此，本文公开的启动子区域通常被进一步界定为包含上游调控元件，例如用于调控编码序列的组织表达性和时间表达功能的那些元件、增强子等。以相同的方式，可以鉴定、分离出使得能在目标组织(例如雄性组织)中进行表达的启动子元件，将其与其它核心启动子一起使用，以验证雄性组织优先的表达。

核心启动子指起始转录所需的最小限度的序列，例如被称为tata盒的序列，这是编码蛋白质的基因的启动子通常都具有的。因此，可选地，s44基因的上游启动子可与其自身的或来自其它来源的核心启动子关联使用。核心启动子可以是任何一种已知的核心启动子，例如花椰菜花叶病毒35s或19s启动子(美国专利no.5,352,605)、泛素启动子(美国专利no.5,510,474)、in2核心启动子(美国专利no.5,364,780)或玄参花叶病毒启动子。

所述基因启动子的功能可以通过以下方法进行分析：将启动子序列与报告基因可操作性连接，形成可转化的载体，再将该载体转入植株中，在获得转基因后代中，通过观察报告基因在植物各个组织器官中的表达情况来确认其表达特性；或者将上述载体亚克隆进用于瞬时表达实验的表达载体，通过瞬时表达实验来检测启动子或其调控区的功能。

用来测试启动子或调控区域功能的适当表达载体的选择将取决于宿主和将该表达载体引入宿主的方法，这类方法是本领域普通技术人员所熟知的。对于真核生物，在载体中的区域包括控制转录起始和控制加工的区域。这些区域被可操作地连接到报告基因，所述报告基因包括yfp、uida、gus基因或荧光素酶。包含位于基因组片段中的推定调控区的表达载体可以被引入完整的组织，例如阶段性花粉，或引入愈伤组织，以进行功能验证。

此外，本发明的启动子还可与并非s44基因的核苷酸序列相连，以表达其它异源核苷酸序列。本发明的启动子核苷酸序列及其片段和变体可与异源核苷酸序列一起组装在一个表达盒中，用于在目的植株中表达，更具体地，在该植株的雄性器官中表达。所述表达盒有合适的限制性酶切位点，用于插入所述启动子和异源核苷酸序列。这些表达盒可用于对任何植株进行遗传操作，以获得想要的相应表型。

本发明所公开的s44基因启动子，可用于驱动下列异源核苷酸序列的表达，以使转化的植株获得雄性不育的表型，所述异源核苷酸序列可编码促使碳水化合物降解的酶或修饰酶、淀粉酶、脱支酶和果胶酶，更具体的如barnase基因、玉米α淀粉酶基因、生长素基因、rotb、细胞毒素基因、白喉毒素、dam甲基化酶，或是显性的雄性不育基因。

在某些实施方式中，本发明中所提到的可操作性地连接在本发明启动子下游的核苷酸序列，其中所述的“核苷酸序列”可以是操作性连接于本文所公开的启动子之后的结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因或者能够干扰内源基因表达的小rna。

更具体地，可以将本发明所提供的育性调控基因seqidno:1或2构建到启动子seqidno:9的下游，从而驱动该育性调控基因在花粉中的特异表达，或是通过rnai的技术原理，构建由seqidno:9启动的可以沉默seqidno:1基因的rnai载体，从而获得seqidno:1基因的雄性不育突变体。

本发明所提供的启动子序列可分离自任何植物，包括但不限于芸苔属、玉米、小麦、高粱、两节荠属、白芥、蓖麻子、芝麻、棉籽、亚麻子、大豆、拟南芥属、菜豆属、花生、苜蓿、燕麦、油菜籽、大麦、燕麦、黑麦(rye)、粟、蜀黍、小黑麦、单粒小麦、斯佩尔特小麦(spelt)、双粒小麦、亚麻、格兰马草(grammagrass)、摩擦禾、假蜀黍、羊茅、多年生麦草、甘蔗、红莓苔子、番木瓜、香蕉、红花、油棕、香瓜、苹果、黄瓜、石斛、剑兰、菊花、百合科、棉花、桉、向日葵、芸苔、甜菜、咖啡、观赏植物和松类等。优选地，植物包括玉米、大豆、红花、芥菜、小麦、大麦、黑麦、稻、棉花和高粱。

本发明还提供了一种表达盒、载体或工程菌株，所述表达盒、载体或工程菌株中包含了本发明所提供的s44基因和/或其启动子。所述表达盒、载体或工程菌株中的启动子可以是天然启动子或被取代的启动子，其将驱动所连核苷酸序列在植株中的表达。构建体中的启动子可以是诱导型启动子。当将s44基因的核苷酸序列与另一个启动子相连，优选的是，该启动子在花粉发育早期充分驱动该序列的表达，例如可以在花粉发育的stage9期特异性表达。具体地，可使用的启动子的种类包括组成型病毒启动子，例如花椰菜花叶病毒(camv)19s和35s启动子，或玄参花叶病毒35s启动子，或泛素启动子。更具体地，可以将本发明所提供的育性调控基因s44的核苷酸序列构建到本发明所提供的启动子seqidno：9的下游，从而驱动该育性基因在转化受体植株中的表达。

组织特异表达启动子可用于靶向特定的植物组织中增强转录和/或表达。启动子可在目标组织中表达也在其它植物组织中表达，可在目标组织中强烈表达以及比其它组织程度低得多的表达，或者可高度优选在目标组织中表达。在一种实施方式中，启动子是偏好在植物的雄性或雌性组织中特异表达的类型。本发明不必须在方法中使用任何特定的雄性组织优先型启动子，本领域技术人员已知的很多此类启动子中的任何都可以使用。本文描述的天然的s44基因启动子是可使用的启动子的一个例子。另一种此类启动子是5126启动子、ms45启动子、ms26启动子、bs92-7启动子、sgb6调控元件和ta29启动子等，其偏好于指导其连接的基因在植物雄性组织中的表达。某些构建体中还可以包括配子组织优先表达启动子。雄性配子优先表达启动子包括pg47启动子以及zm13启动子。

上述构建体中还可包括其它组分，这主要取决于载体构建的目的和用途，例如可进一步包括选择标记基因、靶向或调控序列、稳定序列或引导序列、内含子等。表达盒还将在目标异源核苷酸序列的3’端包括在植物中具有功能的转录和翻译终止子。终止子可以是s44基因的自身终止子，也可以是来自外源的终止子，如胭脂氨酸合酶或章鱼碱合酶终止区域等。

在希望将异源核苷酸序列的表达产物引向特定细胞器，例如质体、造粉体，或者引向内质网，或在细胞表面或细胞外分泌的情况下，表达盒还可包含用于编码转运肽的核苷酸序列。此类转运肽是本领域所公知的，其包括但不限于rubisco的小亚基、植物epsp合酶、玉米brittle-1叶绿体转运肽等。

在制备表达盒的过程中，可对多种dna片段加以操作，以提供处于合适方向，或是处于正确读码框中的dna序列。为达到此目的，可使用衔接子或接头，将dna片段连起来，或者进一步包括其它操作，以提供方便的限制性酶切位点等。

进一步地，本发明所提供的构建体中还可包括选择标记基因，用于选择经转化的细胞或组织。所述选择标记基因包括赋予抗生素抗性或对除草剂抗性的基因。合适的选择标记基因包括但不限于：氯霉素抗性基因，潮霉素抗性基因，链霉素抗性基因，奇霉素抗性基因，磺胺类抗性基因，草甘磷抗性基因，草丁嶙抗性基因。所述选择标记基因还可以是红色荧光基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、花青甙p1等基因。

本发明所提供的表达盒或载体可被插入质粒、粘粒、酵母人工染色体、细菌人工染色体或其他适合转化进宿主细胞中的任何载体中。优选的宿主细胞是细菌细胞，尤其是用于克隆或储存多核苷酸、或用于转化植物细胞的细菌细胞，例如大肠杆菌、根瘤土壤杆菌和毛根土壤杆菌。当宿主细胞是植物细胞时，表达盒或载体可被插入被转化的植物细胞的基因组中。插入可以是定位的或随机的插入。优选地，插入通过诸如同源重组来实现。另外，表达盒或载体可保持在染色体外。本发明的表达盒或载体可存在于植物细胞的核、叶绿体、线粒体和/或质体中。优选地，本发明的表达盒或载体被插入植物细胞核的染色体dna中。

本发明所提供的花粉特异表达启动子可用于外源基因在花粉中的特异性表达，从而避免该外源基因在植物其他组织中持续表达所带来的不利影响，还可以用于植物花粉生长发育相关基因的功能分析和鉴定；可用于雄性不育系和保持系的繁殖和保持；并可应用于花粉败育实验中，从而避免由植物转基因漂移或花粉逃逸所带来的生物安全问题，对植物雄性不育系和保持系的创造具有重要意义。

本发明所提供的s44基因的核苷酸序列和启动子序列或表达盒可被插入载体、质粒、酵母人工染色体、细菌人工染色体或其他适合转化进宿主细胞中的任何载体中。优选的宿主细胞是细菌细胞，尤其是用于克隆或储存多核苷酸、或用于转化植物细胞的细菌细胞，例如大肠杆菌、根瘤土壤杆菌和毛根土壤杆菌。当宿主细胞是植物细胞时，表达盒或载体可插入至被转化的植物细胞的基因组中。插入可以是定位的或随机的插入。

本发明所述的将核苷酸序列、载体或表达盒转入植株或引入植株或对植株进行转化，均指通过常规的转基因方法，将核苷酸序列、载体或表达盒转入到受体细胞或受体植株中。植物生物技术领域技术人员已知的任何转基因方法均可被用于将重组表达载体转化进植物细胞中，以产生本发明的转基因植物。转化方法可包括直接和间接的转化方法。合适的直接方法包括聚乙二醇诱导的dna摄入、脂质体介导的转化、使用基因枪导入、电穿孔、以及显微注射。所述转化方法也包括农杆菌介导的植物转化方法等。

本发明还提供了一种植物的生产方法，其包括：

(a)构建本发明所提供的表达盒；

(b)将步骤(a)获得的表达盒导入植物细胞；

(c)再生出转基因植物；和

(d)选择出转基因植物；并且

(e)任选地，增殖步骤(d)获得的植物以获得后代。

本发明的转基因植物使用植物生物技术领域技术人员已知的转化方法制备。任何方法可被用于将重组表达载体转化进植物细胞中，以产生本发明的转基因植物。转化方法可包括直接和间接的转化方法。合适的直接方法包括聚乙二醇诱导的dna摄入、脂质体介导的转化、使用基因枪导入、电穿孔、以及显微注射等。在本发明的具体实施方式中，本发明使用了基于土壤杆菌的转化技术(可参见horschrb等(1985)science225：1229；whiteff，vectorsforgenetransferinhigherplants，transgenicplants，第1卷，engineeringandutilization，academicpress，1993，pp.15-38；jenesb等.techniquesforgenetransfer，transgenicplants，第1卷，engineeringandutilization，academicpress，1993，pp.128-143，等)。土壤杆菌菌株(例如根瘤土壤杆菌或毛根土壤杆菌)包含质粒(ti或ri质粒)和t-dna元件，所述质粒和元件在用土壤杆菌转染后被转移至植物，而t-dna被整合进植物细胞的基因组中。t-dna可位于ri-质粒或ti-质粒上，或独立地包含在所谓的双元载体中。土壤杆菌介导的转化方法描述于例如中。土壤杆菌介导的转化最适合双子叶植物，但是也适合单子叶植物。土壤杆菌对植物的转化描述于例如中。转化可导致瞬时或稳定的转化和表达。尽管本发明的核苷酸序列可被插入落入这些广泛种类中的任何植物和植物细胞中，但是其尤其适用于作物植物细胞。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明提供了一种水稻花粉发育基因及其启动子，以及基于该基因突变所产生的雄性不育系，该不育系的育性稳定、不受环境条件影响、能够被野生型转基因恢复。该基因以及该基因突变产生的不育系为构建第三代杂交育种体系提供了必要的元件，该基因突变产生的雄性不育系，用来生产杂交种子，对于突破并改良现有的“三系”和“两系”杂交技术有重要意义。并且在杂交种子和不育系自我繁种时，在低温时用育性恢复基因产生的种子外形正常和不育系在高温自交的种子外形呈现镰刀状，使得在不育系自繁种时很容易鉴别出杂交种子，进一步保证了不育系种子的纯度。

附图说明

图1为野生型黄华占(左)与突变体s44(右)小花形态对比。

图2为野生型黄华占(左)与突变体s44(右)花药形态对比。

图3为野生型黄华占(左)与突变体s44(右)花粉染色对比。

图4为野生型黄华占(左)与突变体s44(右)雌器官(包括子房、花柱和柱头)形态对比。

图5为黄华占(hhz)、突变体s44和日本晴(nip)的s44蛋白的氨基酸序列比对结果。

图6为s44基因在水稻不同组织器官中的表达水平。

图7为s44基因启动子表达载体的构建示意图。

图8为转s44基因启动子的转基因水稻植株的gus染色分析。

图9为s44基因的功能互补载体的构建示意图。

图10为s44基因的crispr敲除载体的构建示意图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1、水稻雄性不育突变体s44的筛选

该突变体的获得是通过ems诱变籼稻黄华占种子(m0)的方法，其中ems诱变浓度和诱变时间分别为0.7％和12小时，将来自m0代种子的植株结实后混收，获得突变体库(m1)。来自m1代种子的植株在种子成熟期用于筛选，通过表型观察，获得不育株。不育株割稻桩再生，再生株在生殖期用i2-ki染色检测花粉发育和染色反应，发现其中一个突变体表现为无花粉粒的典败型不育(lodineloss)，将其命名为s44突变体。

实施例2、水稻雄性不育突变体s44的遗传分析

s44突变体与野生型黄华占杂交，其f1代植株全部表现为可育。再将f1代进行自交，获得的f2代植株中可明显的区分为可育植株与不育植株两组，且可育植株与不育植株的分离比接近3:1(见表1)，表明s44突变体的不育突变性状是由单隐性核基因控制。

表1水稻雄性不育突变体s44杂交f2代分离比

实施例3、水稻雄性不育突变体s44的生殖器官表型分析

与野生型黄华占相比，s44突变体植株生长发育正常，抽穗较迟，内外稃形状与野生型有明显差异，表现为突变体的内外稃呈月牙状，整个宽度变窄，长度变化不明显(见图1)，并且突变体的花药瘦小，呈白色略透明(见图2)。进一步用i2-ki溶液对突变体的花粉进行染色检测，发现野生型的花粉染色正常，而突变体表现为无花粉粒，即呈现典败状态(见图3)。进一步发现，突变体的雌器官(包括子房、花柱和柱头)均比野生型略大(见图4)，柱头外露率达85％以上，而野生型的柱头则很少外露，且突变体的叶片和内稃上的毛状体变多且变小。

实施例4、水稻雄性不育突变体基因s44的克隆

突变体基因克隆采取mutmap方法，即利用突变体与原野生亲本杂交构建f2群体，通过对f2群体重测序进行基因定位的方法。具体地，将不育突变体s44与野生型黄华占杂交获得f1个体，f1自交获得f2分离群体，种植f2群体，并在f2群体中选取30棵具有雄性不育表型的植株，取叶片提取基因组dna，等量混合后用于高通量基因组测序，共获得约18.5gb基因组序列数据，覆盖深度为43x(见表2)，将测序数据与野生型黄华占的基因组序列进行对比，找寻差异snp位点，最终将水稻第3染色体上的loc_os03g44150等位基因作为突变体s44的候选突变基因。

表2水稻雄性不育突变体s44的重测序数据

在野生型黄华占中，s44基因的核苷酸序列如seqidno:1所示，其编码区全长1401bp，核苷酸序列如seqidno:2所示，该基因编码的蛋白含466个氨基酸，其氨基酸序列如seqidno:3所示。而在本发明所提供的水稻雄性不育突变体中，突变后的s44基因的第9个外显子上发生1个单碱基突变，即鸟嘌呤(g)变为胞嘧啶(t)，其cds编码的蛋白产物的第354位氨基酸由甘氨酸(gly)变为亮氨酸(leu)(见图5)，即突变后的编码区核苷酸序列如seqidno:7所示，氨基酸序列如seqidno:8所示。

采用高分辨率熔解方法(highresolutionmelt，hrm)对上述775株f2代群体进行基因分型，结果显示所有的不育植株均携带s44基因的纯合突变型位点，而可育植株则携带s44基因的纯和野生型位点或杂合型位点(见表3)。含野生纯和型位点的植株自交后代全部可育，而含杂合型位点的植株自交后代表现为可育植株与不育植株接近3:1的性状分离。实验结果进一步表明，隐性核基因s44的突变可以导致水稻完全雄性不育。

表3突变基因s44的hrm分型结果

利用国际水稻基因组计划公开的日本晴(典型粳稻基因组供体)全基因组测序数据，提取该基因在日本晴中的序列，发现s44编码区序列在野生型黄华占和日本晴之间存在多个snp位点，且日本晴中s44蛋白含466个氨基酸，比籼稻黄华占中相应蛋白多了7个氨基酸。差异氨基酸具体表现在，日本晴的ala(gcg)变为黄华占val(gtg)，gly(ggc)变为ser(agc)，gly(ggg)变为ala(gcg)，tyr(tac)变为tyr(tat)，glu(gag)变为asp(gat)，ala(gca)变为ala(gcg)，thr(aca)变为thr(act)，gly(ggg)变为gly(gga)，thr(act)变为att(ile)，asp(gat)变为glu(gag)，asp(gat)变为asp(gac)，ser(tca)变为ser(tcg)，leu(tta)变为leu(ttg)。具体地，日本晴中s44基因的基因组核苷酸序列如seqidno:4所示，其编码区的核苷酸序列如seqidno:5所示，其编码的氨基酸序列如seqidno:6所示。

实施例5、s44基因在水稻各器官中的表达分析

根据s44基因的cdna序列设计引物，上游引物为yw3：5’-gatcaggcagaaaggctcacactg-3’(seqidno:10)，下游引物为yw2：5’-gatgttgccgatgaatactggagc-3’(seqidno:11)，同时以水稻actin基因作为内参对照设计引物，上游引物为5’-gctatgtacgtcgccatcca-3’(seqidno:12)，下游引物为5’-ggacagtgtggctgacaccat-3’(seqidno:13)。分别提取野生型黄华占水稻材料的不同组织的总rna并合成cdna模板，再采取实时定量pcr方法，分析s44基因在水稻的根、茎、叶、雌蕊、内稃、外稃、颖片和幼穗颖花原基分化期(stage6)、幼穗花粉母细胞减数分裂时期(stage7)及四分体形成时期(stage8)、单核花粉早期(stage9)、单核花粉中晚期(stage10)、双核花粉期(stage11)及成熟花粉期(stage12)的表达谱。结果如图6所示，s44基因在单核花粉早期(stage9)特异表达且表达量高，在单核花粉中晚期(stage10)表达量开始降低，且在根、雌蕊、内外稃及颖片中也均有相对较高的表达。实验表明s44基因的表达与水稻育性紧密联系。

实施例6、s44基因的启动子表达载体构建及功能分析

s44基因的启动子表达载体(见图7)的构建：用引物ngus-bamhⅰ-f(taccgagctcggatccgagtgtggcttggattttgatggc,seqidno:14)和ngus-ecorⅰ-r(actgcagtgggaattctcgtgacgcgcccccacgcc,seqidno:15)扩增水稻基因组，得到2545bp的s44基因启动子片段(seqidno:9)，扩增产物利用in-fusion方法连入载体phpg中，得到phpg-s44载体。通过农杆菌介导的方法转化至野生型武运粳水稻的愈伤组织中，筛选再生得到转基因植株。通过分析转基因水稻植株β-半乳糖苷酶的活性分析s44启动子的表达模式(见图8)，发现s44基因的启动子在花发育早期表达量较高，能够用染色方法鉴定出来。

实施例7、水稻雄性不育突变体s44的功能互补实验

互补载体的构建(见图9)：用引物ncom-ecorⅰ-f(ccatgattacgaattcgagtgtggcttggattttgatggc，seqidno:16)和ncom-hindⅲ-r(ggccagtgccaagcttcatcaagacctaagacagcatccg，seqidno:17)对野生型黄华占水稻的基因组进行扩增，获得含有s44基因起始密码子atg上游的2545bp左右到终止密码子tga下游的2110bp的全长基因组序列片段(seqidno：1)，扩增产物通过in-fusion方法连入互补表达载体pcambia-1300中，得到互补载体pcambia-1300-s44。通过农杆菌介导的方法转化至黄华占s44纯和突变体的种子诱导的愈伤组织中，筛选再生得到转基因植株。分析获得的所有转基因阳性植株，发现全部表现可育。实验结果证明水稻基因s44参与花粉发育调控，该基因突变可导致典败表型。

实施例8、s44基因的crispr敲除载体的转基因株系的获得与表型分析

s44基因的crispr敲除载体(见图10)的构建：合成引物ncrispr-s44-1(ggcaggaaaacatacgacctgatg，seqidno:18)和ncrispr-s44-2(aaaccatcaggtcgtatgttttcc，seqidno:19)，用ddh2o稀释至100μm，各取2μl与10xmbuffer配置成20μl体系，95℃混匀加热3min，然后将体系放入沸水中自然冷却，形成oligo。将用aarⅰ酶切回收的crispr-osu3载体，与退火形成的oligo连接，构建crispr-s44载体。通过农杆菌介导的方法转化武运粳的愈伤组织，筛选再生得到转基因植株。分析所有获得的转基因阳性植株，发现所有转基因阳性植株均表现不育。实验结果进一步证明水稻基因s44参与花粉发育调控，该基因突变可导致典败表型。

序列表

<110>深圳市作物分子设计育种研究院

<120>一种利用育性基因s44获得水稻雄性不育系的方法

<160>19

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>8496

<212>dna

<213>籼稻(oryzasativaindica)

<400>1

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465

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