一类优化的人类白细胞介素-2基因及其表达方法和应用与流程

本发明属于生物工程领域，具体涉及一类优化的人类白细胞介素-2基因及其表达方法和应用。

背景技术：

白细胞介素(interleukin，il)是一类细胞因子。至2013年12月为止，至少发现并认可的白细胞介素有38种，依次命名为il-1～il-38。其中白细胞介素-2(il-2)又称t细胞生长因子(tcgf)，主要由t细胞(特别是cd4+t细胞)产生，能够对多种细胞如t细胞、b细胞、nk细胞、巨噬细胞和少突胶质细胞等产生作用，il-2最显著的作用是影响t淋巴细胞的生长。il-2能有效地提高机体免疫功能，是机体免疫调节网络中的核心物质，在抗病毒、抗细菌感染和抑制肿瘤细胞等有很好的效果，因此在临床中被广泛应用。

人类的白细胞介素-2(hil-2)由133个氨基酸残基组成，分子量约15kd，等电点在6.6～8.2。il-2具有一定的种属特异性，据报道，人类细胞只对灵长类来源的il-2起反应，而几乎所有种属动物的细胞对人的il-2敏感。

1983年科学家首次在猴细胞系中表达出il-2，之后，不少学者在大肠杆菌中成功表达重组人白细胞介素-2，采用基因工程技术获得的hil-2具有与天然相似的生物活性，可以大规模生产，以满足市场需要。但目前多数hil-2的异源表达以大肠杆菌为宿主，其表达形式为包涵体，需要对细胞进行超声破碎，还需要后续的变性复性等复杂的工序，这种做法很难将工艺放大。且变性复性过程中容易破坏il-2结构中的二硫键，正确的二硫键对il-2的生物活性是必须的，因此用大肠杆菌表达的il-2容易在后处理中失活。

技术实现要素：

本发明的目的是提供了一类优化的人类白细胞介素-2基因及其表达方法和应用。本发明优化后得到的人类白细胞介素hil-2产量高，活性稳定，应用效果好，在医药，饲料等行业有很好的应用前景，本发明为基因工程方法规模化生产hil-2奠定了理论与实践基础。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了优化的人类白细胞介素-2hil-2c的编码基因，其核苷酸序列如seqidno：3所示。

本发明提供了优化的人类白细胞介素-2hil-2a，其氨基酸序列如seqidno：4所示。

本发明提供了权利要求2所述的hil-2a的编码基因，其核苷酸如seqidno：5所示。

本发明提供了包含所述hil-2c的编码基因或包含所述hil-2a的编码基因的重组表达载体。

本发明提供了包含所述hil-2c的编码基因或包含所述hil-2a的编码基因的基因工程菌。

进一步的：所述基因工程菌为毕赤酵母gs115和毕赤酵母x33。

本发明提供了所述的基因工程菌的表达方法，包括以下步骤：

(1)hil-2表达载体的构建：将优化后的hil-2的编码基因构建到ppic9k载体上，得到hil-2表达载体；

(2)hil-2基因的转化：将所述hil-2表达载体酶切线性化电击转化入毕赤酵母感受态细胞中，利用组氨酸缺陷作为筛选标记筛选阳性克隆；

(3)重组菌株摇瓶发酵：将验证正确的阳性克隆接种到摇瓶中发酵，震荡培养；诱导发酵产生hil-2；

(4)重组菌株放大发酵：将表达hil-2的基因工程菌株接种到发酵罐中，诱导发酵产生hil-2。

进一步的：所述步骤(4)中的放大发酵过程包括以下培养阶段：

1)菌体培养阶段：向发酵罐中接入种子液，30℃培养20～24h，使发酵液中甘油耗尽；

2)饥饿阶段：当碳源甘油耗尽后，暂不补加任何碳源，待溶氧上升至80％饥饿阶段结束；

3)诱导表达阶段：用氨水调节ph至所需值，流加甲醇诱导，并且保持溶氧在20％以上，诱导时间为160～200h直至发酵结束。

本发明提供了蛋白hil-2n、蛋白hil-2c或蛋白hil-2a在用于制备促进动物生长性能的饲料添加剂中的应用。

所述动物包括鸡、鸭、猪、牛。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明通过两步优化方法对人来源的il-2进行改造，这两步优化方法分别为：密码子优化和氨基酸序列优化。本发明经密码子优化后得到的hil-2比天然序列在毕赤酵母中的表达量提高了132.1％，氨基酸序列优化后表达量又提高了96.5％。本发明同时提供了上述hil-2工业化高密度的发酵方法，具体是将上述hil-2表达菌株接种到30l发酵罐中，在甲醇诱导条件下培养160～200h得到发酵液。本发明还提供了所述hil-2在白羽肉鸡和断奶仔猪养殖中的应用，具体是将上述得到的发酵液经板框压滤，过滤除菌后冷冻干燥，添加到饲料中改善了白羽肉鸡的生长状况，降低了白羽肉鸡体内炎症因子，极大提高了白羽鸡的免疫力；添加到断奶仔猪日粮中提高了断奶仔猪的采食量和日均增重，降低了其腹泻率。

毕赤酵母作为外源蛋白表达系统的优点是(1)蛋白表达量高，且为分泌表达；(2)蛋白胞外背景干净，基本无杂蛋白；(3)发酵工艺成熟，适合高密度培养；(4)相较于原核表达系统，有更为成熟的翻译后修饰功能。这些优点使得蛋白生产的成本低，工艺简单，且产品性质稳定。

本发明优化密码子和氨基酸序列并用毕赤酵母作为表达系统的技术方案的优点在于：1)所得蛋白产量高且活性好；2)发酵工艺简单且无需后续纯化，生产成本低；3)所得重组hil-2直接用于动物养殖，显著提高动物免疫力。

附图说明

图1本发明中表达的人白细胞介素-2蛋白电泳图；

图2本发明的hil-2基因序列优化前/后表达产生的蛋白表达水平对比；

图3是hil-2重组工程菌株在30l发酵罐中的发酵实验结果。

具体实施方式

为了便于理解本发明，以下将结合较佳的实施例对本文发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，可以参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。具体实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。

1.菌株和载体

毕赤酵母gs115，质粒ppic9k等购自invitrogen公司。

2.试剂与培养基

质粒提取试剂盒、片段纯化回收试剂盒、rnaextractionkit提取试剂盒、primescripttmrtreagentkit反转录试剂盒、premixextaqtmii荧光定量试剂盒等购自宝生物工程(大连)有限公司；限制性内切酶、蛋白标准品购自赛默飞；氨苄青霉素，遗传霉素等购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

lb培养基：1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％nacl；

md培养基：1.34％ynb，0.4mg/l生物素，2％葡萄糖；

ypd培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖；

bmgy培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mmol/l磷酸钾缓冲液(ph6.0)，1.34％ynb，0.4mg/l生物素，1％甘油；

bmmy培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mmol/l磷酸钾缓冲液(ph6.0)，1.34％ynb，0.4mg/l生物素，1％甲醇；

bsm培养基：26.7ml85％的磷酸，0.93g二水硫酸钙，14.9g二水硫酸镁，4.13g氢氧化钾，18.2g硫酸钾，40g甘油，4.0mllpmt1。

以上培养基为固体时加入2％的琼脂粉。

3.实验方法

菌株培养条件：大肠杆菌37℃培养，酵母30℃培养。液体培养时摇床转速为200rpm。

毕赤酵母gs115转化方法：将活化的毕赤酵母gs115接种到含有20mlypd液体培养基中，30℃摇瓶培养至od600为1.2～1.5后低温离心收集菌体，依次用20ml冰冷无菌水和5ml浓度为1mol/l的冰冷山梨醇溶液清洗菌体，最后用1ml山梨醇溶液重悬菌体制得酵母感受态悬液。将100μl酵母感受态与10μl线性化载体混匀后转移到预冷的电转杯中电击转化，电转化的条件为1.5kv，6msec。电击后加入1ml山梨醇溶液，转移至1.5ml离心管中30℃温育1h。5000rpm离心5min，收集菌体涂布于md筛选平板上倒置培养，直至长出阳性单克隆。

白羽鸡空肠黏膜rna提取方法：按照rnaextractionkit提取试剂盒(takara)试剂盒的说明书操作提取白羽肉鸡空肠黏膜总rna，以2.2％甲醛变性凝胶电泳和nanadrop-1000微量核酸测定仪检测总rna的纯度和浓度，吸光度d260nm/d280nm＞1.80表明纯度符合试验要求。

cdna合成反应参照primescript^tmrtreagentkit反转录试剂盒(takara)的要求进行。

rt-pcr扩增反应参照premixextaq^tmii荧光定量试剂盒(takara)的要求进行。反应体系为20μl：cdna2μl(1200ng/μl)，上、下游引物各0.8μl(10μmol/l)，2×sybrpremixextaqii10μl，rnasefreeh2o6.4μl。pcr反应条件：95℃预变性30s；95℃变性10s，60℃退火30s，72℃10s，44个循环。扩增结束后分析熔解曲线，表达水平以目的基因与内参β-actin的比值表示。

实施例1：人白细胞介素-2基因序列优化及载体构建

本发明参考人白细胞介素-2hil-2(genebankid：aah66254.1)成熟区的氨基酸序列(seqidno：1)，首先对hil-2的原始编码基因(seqidno：2)进行密码子优化确定了本发明密码子优化后的基因序列(seqidno：3)。然后在密码子优化后的基因序列(seqidno：3)的末端设计增加了一段序列得到核苷酸序列如seqidno：5所示的基因，该基因编码的蛋白质相较于天然的hil-2在肽链的n端增加了一段氨基酸序列，其优化后的氨基酸序列如seqidno：4所示。

所述序列为seqidno：2所示的基因编码表达的蛋白命名为hil-2n；序列为seqidno：3所示的基因编码表达的蛋白命名为hil-2c；序列为seqidno：5所示的基因编码表达的蛋白命名为hil-2a。

分别用化学方法人工合成序列分别为seqidno：2、seqidno：3和seqidno：5所示的基因片段，并构建到ppic9k的ecori和noti两个酶切位点之间，得到了重组表达质粒phil-2n、phil-2c和phil-2a。

seqidno：1：

seqidno：2：

seqidno：3：

seqidno：4：

seqidno：5：

实施例2：人白细胞介素-2在毕赤酵母中的转化与高拷贝筛选

用sali酶切线性化重组表达质粒phil-2n、phil-2c和phil-2a，采用电击转化的方法将线性化载体分别转化到表达宿主毕赤酵母gs115中，在md平板上筛选得到hil-2n、hil-2c和hil-2a表达菌株的转化子。

将生长出的转化子用牙签挑出，点在含不同浓度的遗传霉素的ypd平板上，筛选出高度耐受遗传霉素的转化子即为高拷贝重组转化子。

实施例3：hil-2重组表达菌株验证及诱导发酵

挑取转化子单菌落接种在ypd试管中振荡培养16h，提取基因组作为模板，用aox1通用引物(3’aox和5’aox)扩增，验证基因是否正确整合到转化子基因组中，pcr结束后用琼脂糖凝胶电泳检测目的条带，并将得到的dna测序验证。

将验证正确的重组菌株划线在ypd平板上，30℃静置培养72h，挑取单菌落接种于bmgy培养基中，30℃振荡培养18h后，离心获得菌体。将适量菌体转入bmmy培养基中，使菌体浓度达到od600＝1，继续振荡培养，每24h补加培养体积1％的甲醇。诱导表达96h后，将培养液离心获得上清。

实施例4：重组hil-2蛋白表达量及生物活性鉴定

sdspage分析发酵液中hil-2的表达情况，结果如图1。

发酵上清液通过微孔滤膜过滤后，经过离子交换柱和sephadexg-100分子筛柱层析纯化至纯度达到98％，mtt法检测纯化后hil-2n，hil-2c，hil-2a的生物活性，经检测hil-2n，hil-2c，hil-2a均具有与商品人源il-2纯品相同的生物活性。而本发明中的三种重组白介素hil-2n，hil-2c，hil-2a在蛋白表达量上有明显差异，hil-2c和hil-2a的表达量都显著高于hil-2n，具体如图2所示。

实施例5：hil-2重组工程菌在30l发酵罐中放大发酵

将hil-2c和hil-2a的表达宿主菌划线于ypd平板上，30℃倒置培养3天长出单菌落，挑取长势良好的单菌落继续在ypd平板上划线培养，如此活化三代得到的毕赤酵母单菌落接种于20mlbmgy培养基中，30℃、200rpm培养24h。以2％的接种量接种到300mlbmgy培养基中，30℃、200rpm培养至od600为5，用作种子液接种发酵罐。

发酵生产工艺：bsm培养基，ph5.0、温度30℃、搅拌速率500rpm、通风量1.0～1.5(v/v)，溶氧控制在20％以上。

发酵过程分为三个阶段：(1)菌体培养阶段：按8％比例接入种子液，30℃培养20～24h，使发酵液中甘油耗尽；(2)饥饿阶段：当碳源甘油耗尽后，暂不补加任何碳源，待溶氧上升至80％饥饿阶段结束；(3)诱导表达阶段：用氨水调节ph至所需值，流加甲醇诱导，并且保持溶氧在20％以上，诱导时间为160～200h。待发酵结束后，发酵液通过板框过滤机、过滤除菌后的酶液冷冻干燥，用于应用测试。发酵数据如图3所示，本发明中hil-2c和hil-2a的最高发酵蛋白量分别为8.84g/l和16.31g/l。

实施例6：hil-2a在白羽肉鸡养殖中的应用

试验产品：本发明中的hil-2n、hil-2c和hil-2a

试验目的：考察在热应激条件下本发明中的hil-2对白羽肉鸡生长性能及肠道屏障功能的影响。

试验设计：选择1日龄优质白羽肉鸡500羽，用粉料预饲7天，预饲期结束后筛除体重差异明显的鸡，将剩余450羽的鸡随机分为5个处理组，每个处理组的重复3组，每个重复组即1个栏位(每个栏位30只鸡)，要求每个栏位鸡的平均体重近似，试验处理方式如表1所示。

表1.白羽肉鸡的分组和处理

热应激条件：21日龄以后每天8个小时高温应激，温度35℃，湿度70％以上。热应激免疫检测：试验进行至第35日龄。取小肠粘膜，同时取空肠组织和肝脏组织，提取总rna，反转录后rt-pcr扩增免疫因子表达水平，表达水平以目的基因与内参β-actin的比值表示。

表2热应激对各处理组白羽肉鸡空肠黏膜致炎因子转录水平影响

表3热应激对各处理组白羽肉鸡空肠黏膜抑炎因子转录水平影响

表4热应激对各处理组白羽肉鸡空肠黏膜其它炎症相关因子转录水平影响

il-1β和il-6是巨噬细胞在感染早期分泌的致炎因子，动物肠道黏膜中致炎因子和抑炎因子动态平衡被打破，大量炎症因子和趋化因子迅速增多，加重了肠道炎症。诱导型一氧化氮合酶(inos)，可由ifn-γ诱导经巨噬细胞产生。上述都是动物体内重要的致炎因子。

由rt-pcr分析结果可以知道hil-2n/hil-2c/hil-2a组致炎因子il-1β、il-6、ifn-γ和inos的水平明显低于空白对照组和抗生素组，四组的肿瘤坏死因子tnf-α水平基本无差别；il-10、il-4、il-13和tgf-β是动物体内重要的抑炎因子，其中tgf-β可抑制免疫细胞增殖以及细胞因子产生。由表3数据可以看出hil-2n/hil-2c/hil-2a组的il-10、il-4、il-13的水平明显低于空白对照组和抗生素组，tgf-β的水平略高于空白对照组。除此之外，nf-κb和nrf2均是调控细胞氧化应激反应的转录因子，hil-2n/hil-2c/hil-2a组nf-κb和白细胞介素il-17的水平较空白对照组和抗生素组有非常明显的降低，而nrf2的mrna水平没有降低；tlr4和tlr5分别是识别细菌脂多糖和鞭毛蛋白的toll样受体，实验数据表明，四组tlr4的mrna水平差别不大，但是抗生素组和hil-2n/hil-2c/hil-2a组tlr5的水平明显低于空白对照组。

以上实验结果说明热应激条件下，抗生素和本试验所使用的hil-2n、hil-2c和hil-2a均能降低白羽肉鸡肠道黏膜中炎症因子的水平，且对于检测的大部分炎症因子而言，本试验使用的hil-2n、hil-2c和hil-2a的效果明显优于抗生素。说明本发明中的hil-2n、hil-2c和hil-2a可直接应用于动物养殖，并能降低动物体内炎症，提高动物免疫力。

进一步比较hil-2n、hil-2c组和hil-2a组数据，发现hil-2a组中抑炎因子il-1β、il-6、ifn-γ表达量更低，致炎因子il-4的表达量略低于hil-2n组和hil-2c组，另外hil-2a组中nf-κb、il-17、tlr5的表达量也低于hil-2n组和hil-2c组。这说明本发明优化的hil-2a在降低动物体内炎症方面的效果优于hil-2n和hil-2c。

实施例7：本发明中的hil-2对断奶仔猪生长性能影响

试验产品：本发明中的hil-2n、hil-2c和hil-2a

试验设计：选用23日龄120头8.0～8.2公斤左右体重接近的健康断奶仔猪，按照体重接近、公母比例一致的原则分为4个处理组，对照组饲喂无其它添加的基础日粮，hil-2n组饲喂的基础日粮中添加本发明的重组hil-2n，hil-2c组饲喂的基础日粮中添加本发明的重组hil-2c，hil-2a组饲喂的基础日粮中添加本发明的重组hil-2c，hil-2的添加水平为100mg/kg体重/天。

表5不同组别对断奶仔猪生长性能的影响

从表5可以看出，饲喂hil-2n、hil-2c和hil-2a的仔猪较对照组相比日均增重分别提高13.89％、11.26％和27.68％，平均日采食量分别提高7.56％、10.65％和7.92％，全程腹泻率分别降低54％、50％和75％，说明本发明的hil-2可以提高断奶仔猪的免疫力，改善其生长性能。hil-2a组的效果较hil-2n和hil-2c组更为显著，说明本发明改造后的hil-2a在饲喂断奶仔猪中有更好的应用效果。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110>青岛红樱桃生物技术有限公司

<120>一类优化的人类白细胞介素-2基因及其表达方法和应用

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