一种lncRNASGOL1-AS1在作为胃癌诊断标志物的应用的制作方法

本发明涉及胃癌的诊断技术领域，更具体地，涉及一种lncrnasgol1-as1在作为胃癌诊断标志物的应用。

背景技术：

胃癌是世界上最高发的恶性肿瘤之一，在所有恶性肿瘤中其发病率排名第四，死亡率高居第二位。全球每年胃癌新增病例高达100万例，约有70万患者死亡。其5年生存率不足20％，而早期胃癌经治疗后的5年生存率可达90％以上。因此早期诊断对提高胃癌疗效非常重要。目前胃癌诊断最有价值的方法是胃镜检查。但胃镜检查属侵入性检查，不适宜作为常规筛选检查。目前用于临床的胃癌标志物主要有cea、ca19-9、ca-125等，但这些指标诊断的灵敏度和特异性较低，用于临床诊断价值有限。因此亟需找到胃癌高特异性和敏感性的分子诊断标记物。

长链非编码rna(longnon-codingrna，lncrna)是一类片段长度大于200bp不编码蛋白质的rna分子，其表达具有组织特异性及时空特异性。研究发现lncrna在肿瘤发生、发展中扮演极其重要的角色。但是尚未寻找到合适的lncrna作为癌症标志物。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是为了克服现有技术的不足，提供一种lncrnasgol1-as1其cdna全长序列。

本发明的第二个目的是提供一组基于race技术的扩增lncrnasgol1-as1的pcr引物组。

本发明的第三个目的是提供一种重组载体。

本发明的第四个目的是提供所述lncrnasgol1-as1或其片段在作为胃癌诊断标志物中的应用。

本发明的第五个目的是提供所述lncrnasgol1-as1或其片段，或所述重组载体在制备用于胃癌诊断的试剂盒中的应用。

本发明的第六个目的是提供一个用于胃癌检测的引物组。

本发明的第七个目的是提供所述引物组在制备胃癌检测试剂盒中的应用。

本发明的第八个目的是提供一种用于胃癌诊断的试剂盒。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一种lncrnasgol1-as1，其cdna全长序列如seqidno:1所示。

一组基于race技术的扩增lncrnasgol1-as1的pcr引物组，包括：5’race巢式pcr第一次pcr引物序列如seqidno.3所示；5’race巢式pcr第二次pcr引物序列如seqidno.4所示；3’race巢式pcr第一次pcr引物序列如seqidno.5所示；3’race巢式pcr第二次pcr引物序列如seqidno.6所示

一种重组载体，所述lncrnasgol1-as1的cdna序列或其片段，所述片段的序列如seqidno:2所示。

所述lncrnasgol1-as1或其片段在作为胃癌诊断标志物中的应用也属于本专利的保护范围。

优选地，所述lncrnasgol1-as1是指seqidno:1所示序列，所述片段为seqidno:2所示序列。

lncrnasgol1-as1或其片段，或所述重组载体在制备用于胃癌诊断的试剂盒中的应用也属于本专利的保护范围。

一个用于胃癌检测的引物组，其序列如seqidno:7～8所示。

优选地，还包括内参基因gapdh引物如seqidno:9～10所示。

所述引物组在制备胃癌检测试剂盒中的应用也属于本专利的保护范围。

一种用于胃癌诊断的试剂盒，所述的引物组。

优选地，所述试剂盒，包含所述lncrnasgol1-as1或其片段、所述重组载体。

优选地，所述试剂盒，其检测的样本可以是组织标本，也可以是血浆、血清、血小板等血液样本。

优选地，所述试剂盒，其检测的样本为血小板，其血小板样品的制备方法为：空腹采集新鲜血5ml，保存于edta抗凝管。150g室温离心10min，吸以上层富含血小板的血浆，然后400g，室温离心20min，吸掉上清，沉淀为血小板，血小板加30μlrnalater，4℃过夜，移入-80℃长期贮存。

长链非编码rna(longnon-codingrna，lncrna)是一类片段长度大于200bp不编码蛋白质的rna分子，其表达具有组织特异性及时空特异性。研究发现lncrna在肿瘤发生、发展中扮演极其重要的角色。本发明发现lncrnasgol1-as1在癌/癌旁差异十分显著。目前lncrnasgol1-as1在肿瘤中的功能尚未见报道，所以本发明将lncrnasgol1-as1的cdna序列或其片段，作为胃癌诊断标志物。

本发明利用荧光定量rt-pcr进行检测胃癌组织及配对癌旁组织发现lncrnasgol1-as1在胃癌组织中的表达与癌旁组织相比显著下调。并且其表达水平与胃癌进展、侵袭转移呈负相关。进一步，通过分离胃癌患者及健康人血小板，利用荧光定量rt-pcr进行检测，发现胃癌血小板中lncrnasgol1-as1或其片段含量比健康人血小板lncrnasgol1-as1或其片段含量明显低。据此，本发明提出可通过检测lncrnasgol1-as1或其片段的表达水平高低，从而对胃癌进行早期诊断、进展转移判断及预后预测。

现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明发现lncrnasgol1-as1或其片段在作为胃癌诊断标志物中的应用。

本发明构建的胃癌诊断试剂盒组织标本，也可以是血浆、血清、血小板等血液样本。针对血液样本的无创诊断方式更具有临床应用价值。

附图说明

图1为lncrnasgol1-as1或其片段在70对胃癌组织及相应癌旁组织中表达；normal表示：癌旁组织；gc表示：胃癌组织。

图2为lncrnasgol1-as1或其片段在不同临床分期胃癌中的表达；i表示：ajcc临床分期i期；ii表示：ajcc临床分期ii期；iii表示：ajcc临床分期iii期；iv表示：ajcc临床分期iv期。

图3为lncrnasgol1-as1或其片段表达与胃癌淋巴结转移的关系，n0表示：区域淋巴结无转移；n1-3表示：n1：区域淋巴结转移1～2个，n2：区域淋巴结转移3～6个，n3：区域淋巴结转移7个以上。

图4为lncrnasgol1-as1或其片段表达与胃癌远处转移相关m0表示：无远处转移；m1表示：有远处转移。

图5为胃癌患者及健康人血小板中lncrnasgol1-as1或其片段表达情况，normal表示：健康人血小板；gc表示：胃癌患者血小板。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1采用race技术获得sgol1-as1的全长cdna序列

1、引物设计

lncrnasgol1-as1的片段的cdna序列如seqidno:2所示，设计5’race巢式pcr引物和3’race巢式pcr引物。

5’race巢式pcr第一次pcr引物，seqidno.3：

ccttcctggagtccctgaaaatgt；

5’race巢式pcr第二次pcr引物，seqidno.4：

ttcaggagatgattccgatgacc

3’race巢式pcr第一次pcr引物，seqidno.5：

tccattggttggctgggaggcgg；

3’race巢式pcr第二次pcr引物。seqidno.6：

acattcgctcaagtccacatccg；

经过实验验证，巢式pcr引物能够达到预期的实验目的，特异性的扩增出目标片段。

以trizol法常规抽提人sgc-7901细胞总rna。然后按clontech公司race5’/3’试剂盒(cat.no.634860)说明书进行race实验。

2、实验步骤如下：

(1)cdna的合成：

首先分别针对5’race和3’race，分别配制如下体系：

反应条件：72℃3min,42℃2min。

然后在上述管中分别加入下列成分：

反应条件：42℃，90min；70℃，10min。加90μl水稀释cdna。

(2)3’racepcr反应：使用通用upm引物及特异引物3’gsp1、3gsp2进行巢式pcr获得3’race产物。

3’gsp1序列如seqidno.3所示；

3’gsp2序列如seqidno.4所示。

反应体系为：

反应条件为：

stage1：95℃3min

stage2：32cycle

95℃15sec

55℃15sec

stage3：72℃3min

(3)5’racepcr反应：使用同样方法进行巢式pcr获得5’race产物，反应体系中特异性引物使用5’gsp1or5gsp2，余与3’racepcr相同。5’gsp1序列如seqidno.5所示；5’gsp2序列如seqidno.60示。反应条件同3’racepcr条件。

(4)分别将5’racepcr产物和3’racepcr产物克隆到pgem-teasy载体中进行测序。

3、经5’race及3’race序列拼接，得到长度为1392bp全长序列，如seqidno:1所示。

实施例2一种用于胃癌诊断的试剂盒

1、一种用于胃癌诊断的试剂盒，包括一个用于胃癌检测的引物组，阳性质控品和内参基因gapdh引物。其中，用于胃癌检测的引物组序列如seqidno:7～8所示；阳性质控品为插入lncrnasgol1-as1的cdna序列或其片段的重组载体；内参基因gapdh引物如seqidno:9～10所示。本试剂盒使用还需要用到的其他试剂均为市售。

2、检测方法

(1)用trizol提取样品rna，具体步骤如下：

(i)向样品中加入适量trizol，室温下裂解样品15min。

(ii)每毫升trizol加入0.2ml氯仿，充分震荡混匀，常温放置2-3min。

(iii)4℃，12000g，离心15min。离心后液体分三层，吸取上层无色水相至新ep管中。

(iv)向ep管中加入0.5ml异丙醇，混匀，-20℃放置20min。

(v)4℃，12000g，离心10min，可以在ep管底部看到白色沉淀，即为rna，弃上清。

(vi)加入1ml预冷的75％乙醇，4℃，7500g，离心5min，弃上清。重复一次。

(vii)晾干，待rna样品干燥后，往ep管中加入适量depc水溶解rna，测定总rna浓度和纯度，-80℃保存。

(2)逆转录

采用takara公司的primescriptrtmastermix试剂盒将总rna逆转录成cdna。

(i)rt反应体系：

5×primescriptrtmastermix4μl

totalrna200ng～1μg

rnasefreedh2oupto20μl

(ii)逆转录反应条件:37℃15min，85℃5sec，4℃。

(3)real-timepcr：以逆转录产物为模板，通过荧光定量pcr检测lncrnasgol1-as1的编码dna序列或其片段的表达，其中：

上游引物(seqidno.7)：gaaattttccgcctcgctcc；

下游引物(seqidno.8)：gacttgagcgaatgtgcgtc。

以gapdh为内参照，

上游引物(seqidno9)：gactcatgaccacagtccatgc

下游引物(seqidno.10)：agaggcagggatgatgttctg

反应体系为：

反应条件为：

stage1：95℃3min

stage2：40cycle

95℃5sec

60℃30sec

60℃-95℃绘制溶解曲线

实施例3检测70例胃癌组织及配对癌旁粘膜组织样本

1、临床组织样品准备收集70例胃癌组织及配对癌旁粘膜组织样本，贮存于-80℃冰箱。所有患者手术前未接受过放疗、化疗，登记患者详细的临床资料，所有患者均知晓并且同意该检测。检测前将样品从冰箱取出，加入液氮研磨至粉末，移入1.5mlep管中。

2、检测方法：按照实施例2所述的方法对上述样品进行检测。

3、结果：

在70对胃癌/癌旁组织中检测lncrnasgol1-as1的表达，发现lncrnasgol1-as1表达在癌组织中显著下调(图1)；分析lncrnasgol1-as1表达与胃癌临床分期关系发现，随着胃癌临床分期进展lncrnasgol1-as1表达逐渐降低(图2)；分析lncrnasgol1-as1的表达与胃癌转移之间的关系，发现有淋巴结转移组明显低于无淋巴结转移组(图3)，有远处转移的胃癌lncrnasgol1-as1表达明显低于无远处转移胃癌(图4)。

实施例4检测胃癌患者及健康人血小板样品

1、采集50例胃癌患者全血及45例健康人全血，所有患者及健康人均知晓并且同意该检测。

2、血小板样品

空腹采集新鲜血5ml，保存于edta抗凝管，室温放置不超1小时。150g室温离心10min，吸以上层富含血小板的血浆，然后400g，室温离心20min，吸掉上清，沉淀为血小板，血小板加30μlrnalater,4度过夜，移入-80℃长期贮存。

3、按照实施例2所述的方法对上述样品进行检测。

4、结果：lncrnasgol1-as1表达在胃癌患者血小板中表达明显低于健康人血小板(图5)。

序列表

<110>广州医科大学附属肿瘤医院

<120>一种lncrnasgol1-as1在作为胃癌诊断标志物的应用

<160>10

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1392

<212>dna

<213>人(homosapiens)

<400>1

gtgatatccttcaggctaagatgaggtgactgctgagtttcaggtggtgcttactggtag60

gagtttttgttggcttagaaccctccgtctctttttcatctgtgtatttcagtgctcttt120

tagctagaggcctggtgactggtctatctgaattgctcgtgggattctgaatgtacttgc180

aagtgggcaaatagaggtcatcggaatcatctcctgaaccacttgattcacagaggctca240

cttcagactcgttgttttcttctctattagagtcattgctcactttttgtcggaaaggag300

taagatgaacaccctcttccaaattaaaatttaaacgttcctggctgaatcagctttggt360

gataagttaacttggtccttgctccattgacaagcattgtgttgtacattttcagggact420

ccaggaaggccggggggaggtggggctggcggaagtggacgcggcgaccctcctgccgca480

ggcgcgtccagaacgataccttggccactacttctgcaacagctatcttcctcctcctca540

catttcaaggctcttcgaagctctccagccacggctagccccgcgcactgggccctccag600

gaccgtaccaccgtccgccgtcgcctggaactaccgccgccacattcgaaattttccgcc660

tcgctcctccattggttggctgggaggcggtcacgtggcgcaggatgcacccaacaccac720

cgtcgcaggcagagtcccgccccgccaggcgacgtcacgtgacgcacattcgctcaagtc780

cacatccgggcatccacctggccctggggcggagcctgcggtcgggtctcggcgacccgc840

cgggactttctaatcagagtcgtggggattttacgggtggagttactccgaaacctttaa900

ggccgtgtgtgataggtagttcaaagcttcctgtttcttcagtctgacagcttcaaatgt960

cccgggttgtgctcaaagcctccctcttgtgagaagaatctctttggttgcctgttaaag1020

cggtcagccagcttgcaacgcggaagcagcttttagaggaattaaaaccaaaacaaggag1080

caaattctggattaaaaaggtattagggaaactgcagatacctgaaaattctagctccat1140

gtttctctttgccggctatctctggctctttaactcttctcgagaaatggcaccaacatc1200

catccagttaccgactagaagcctgagaaatcgtccttaatgattatttatcctctctta1260

acctttgcccgtccagtcggtcacacgatcttctcaactctgctttccaagtttctctca1320

tgcccatctttttccccccaatccagcttccagcctaatctcattccctaaattgcacta1380

gtacccactctg1392

<210>2

<211>819

<212>dna

<213>人(homosapiens)

<400>2

cttactggtaggagtttttgttggcttagaaccctccgtctctttttcatctgtgtattt60

cagtgctcttttagctagaggcctggtgactggtctatctgaattgctcgtgggattctg120

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tcggaaaggagtaagatgaacaccctcttccaaattaaaatttaaacgttcctggctgaa300

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ctcctgccgcaggcgcgtccagaacgataccttggccactacttctgcaacagctatctt480

cctcctcctcacatttcaaggctcttcgaagctctccagccacggctagccccgcgcact540

gggccctccaggaccgtaccaccgtccgccgtcgcctggaactaccgccgccacattcga600

aattttccgcctcgctcctccattggttggctgggaggcggtcacgtggcgcaggatgca660

cccaacaccaccgtcgcaggcagagtcccgccccgccaggcgacgtcacgtgacgcacat720

tcgctcaagtccacatccgggcatccacctggccctggggcggagcctgcggtcgggtct780

cggcgacccgccgggactttctaatcagagtcgtgggga819

<210>3

<211>24

<212>dna

<213>人(homosapiens)

<400>3

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<210>4

<211>23

<212>dna

<213>人(homosapiens)

<400>4

ttcaggagatgattccgatgacc23

<210>5

<211>23

<212>dna

<213>人(homosapiens)

<400>5

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<210>6

<211>23

<212>dna

<213>人(homosapiens)

<400>6

acattcgctcaagtccacatccg23

<210>7

<211>20

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<213>人(homosapiens)

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<210>8

<211>20

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<400>8

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<210>9

<211>22

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<213>人(homosapiens)

<400>9

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<210>10

<211>21

<212>dna

<213>人(homosapiens)

<400>10

agaggcagggatgatgttctg21