用于鉴别患者是否感染及感染种类的试剂盒的制作方法

本发明涉及疾病检测领域，特别涉及用于鉴别患者是否感染及感染种类的试剂盒。
背景技术：
：呼吸道感染和消化道是人类最常见的传染性疾病之一，而儿童呼吸道和消化道感染更是儿童面临的主要公共健康问题之一，在发展中国家已成为5岁以下儿童死亡的首要病因。研究报道学龄前儿童每年平均患呼吸道和消化道感染6-10次，并有大约3％的1岁以下儿童由于中重度的呼吸道和消化道感染而住院治疗。引发呼吸道和消化道感染的病原体种类复杂，既有病毒，也有细菌、支原体等。这些病原体引发呼吸道感染后，患者的临床表现往往都有发热、咳嗽、咽痛、流涕，可伴随全身无力、头晕、肌肉酸痛等全身症状；消化道感染则出现水样大便，甚至血便。在临床上首先区分出病毒感染还是细菌感染，对临床治疗策略的选择是有很大帮助的。例如若是病毒感染，则不用抗生素治疗，可以防止抗生素滥用。目前临床上区分病毒和细菌感染已经有一些方法，例如通过外周血中的中性粒细胞和淋巴细胞含量的变化，以及c反应蛋白检测，来大致区分是细菌还是病毒感染，但已有的这些方法特异性和灵敏度不够，临床急需特异性和灵敏度更好的方法来区分细菌和病毒的感染。国际学术界一直尝试着从宿主的血液中的有核疾病的基因表达的差异来区分细菌和病毒感染，因为细菌和病毒感染机体后，存在激活宿主免疫系统途径的机制差异，就必然在宿主细胞中存在针对细菌和病毒感染差异表达的基因。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术区分细菌和病毒感染方法的不足，挑选了ifi44l和fam89a两个基因，针对这两个基因，以及内对照gapdh基因；设计了逆转录pcr的引物和荧光taqman探针，在一管反应中就能准确检测出ifi44l和fam89a两个基因的表达丰度，从而判断患者是感染了病毒还是细菌。在一种实施方式中，本发明提供用于鉴别患者是否感染及感染种类的试剂盒，所述试剂盒包括检测患者的基因ifi44l和/或fam89a的表达水平的试剂以及看家基因的表达水平的试剂，所述看家基因优选为基因actb和gapdh。在一种实施方式中，所述试剂盒是检测基因ifi44l、fam89a和看家基因gapdh三个基因一步法反转录pcr试剂盒。在一种实施方式中，所述试剂盒包括以下引物：用于人gapdh基因pcr扩增的引物:正向引物seqidno:1，gctcatttcctggtatgacaacg，反向引物seqidno:2，ctccccagcagtgagggt；用于人ifi44l基因pcr扩增的引物：正向引物seqidno:3，tgcactgaggcagatgct，seqidno:4，gtacaggctgggccaaat；和用于人ifi44l基因pcr扩增的引物：正向引物seqidno:5，aagcctcccaacctggac；反向引物seqidno:6tcatcgaagaagccgttc。在一种实施方式中，所述试剂盒包括以下探针：用于人gapdh基因检测的探针seqidno:9：ccctgttgctgtagccaaattcgt；用于人ifi44l基因检测的探针seqidno:10：aactggtgcaattgagagagcgt；和用于人fam89a基因检测的探针seqidno:11：agaccaaccatctctttgcgga。在一种实施方式中，所述试剂盒包括以下探针：seqidno:9探针荧光标记如下：fam-ccctgttgctgtagccaaattcgt-dabcyl；seqidno:10探针荧光标记如下：tamra-aactggtgcaattgagagagcgt-bhq2；和seqidno:11探针荧光标记如下：joe-agaccaaccatctctttgcgga-bhq1。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。图1a是fam89a优化前的引物pcr扩增结果图，和图1b是fam89a优化后的引物pcr扩增结果图；图2是荧光定量rt-pcr反应图，其中内侧线条-gapdh基因，直接线条-ifi44l基因，外侧线条-fam89a基因；图3是ifi44l基因在正常人群和病毒感染人群中的表达丰度散点图；和图4是图4fam89a基因在正常人群和细菌感染人群中的表达丰度散点图。具体实施方式为了使本领域
技术领域：
人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合以下实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。一、多重pcr引物设计除了需要检测ifi44l和fam89a基因的表达丰度，还需要检测看家基因gapdh的表达丰度作为数据归一化的参照，因此需要同时在一管中一步法反转录pcr扩增出三个基因，从而先需要设计三个基因的一步法反转录pcr引物，参见表1。表1.检测三个基因的一步法反转录pcr引物上述引物是经过本发明人进行优化选择，它们不仅保证了上述三个基因在一步法反转录pcr中进行扩增，而且上述引物大大增强了扩增的特异性，使得扩增产物特异性更好，以下是fam89a基因引物优化前后的序列：表2fam89a基因引物优化前的序列图1a和图1b是fam89a基因引物优化前后的比较，图1a中fam89a优化前的引物产生很多非特异性扩增，背景高；图1b优化后的引物特异性强，背景低。二、探针设计针对三个基因的taqman探针序列如表3。表3.三个基因的taqman探针序列三、pcr扩增本发明所检测的标本类型外周全血的临床样本，血样在离体30分钟内，置于tripurelsreagent全血裂解液中(北京百泰克生物技术有限公司,200l全血放在750l的裂解液中)，-20℃可长期保存。需要使用rna时，可以用trizol(lifetechnologies公司)提取样本rna。一步法反转录pcr反应体系采用大连宝生生物公司的一步法反转录pcr体系，如表4，反应条件如表5。表4.rt-pcr扩增rna病毒的a反应体系名称体积(25μl反应体系)终浓度2×superrtonestepbuffer12.51×forwardprimermix(每种10μm)1每种0.4mreverseprimermix(每种10μm)1每种0.4msuperrtonestepenzymemix0.5核酸模板2补水8表5.rt-pcr反应条件在荧光定量pcr仪器abi7500上，一次检测三个基因的典型荧光定量反应曲线图参见图2。图2.荧光定量rt-pcr反应图。内侧线条-gapdh基因，直接线条-ifi44l基因，外侧线条-fam89a基因5.本发明试剂盒的应用在用本发明所设计的针对ifi44l、fam89a和gapdh基因的荧光定量rt-pcr方法检测人外周血有核细胞基因表达丰度。先针对正常人群外周血，检测其中ifi44l、fam89a和gapdh基因的表达丰度；然后针对临床有呼吸道感染和腹泻感染症状的患者，我们先用13项呼吸道病原体液相芯片，和12项腹泻病原体芯片检测患者具体感染的病原体类别，然后再检测分析患者外周血ifi44l、fam89a和gapdh基因的表达丰度。13项呼吸道病原体液相芯片包括8种病毒5种细菌，具体是：流感病毒a型(inf-a)、流感病毒b型(inf-b)、副流感病毒(piv)、人偏肺病毒(hmpv)、鼻病毒(hrv)、博卡病毒(hbov)、腺病毒(r-adv)、呼吸道合胞病毒(rsv)、肺炎支原体(mp)、卡他莫拉菌(mc)、流感嗜血杆菌(hi)、肺炎链球菌(sp)、百日咳杆菌(bp)，11项腹泻病原体芯片包括5种病毒6种细菌，具体是腺病毒(d-adv)、星状病毒(asv)、诺如病毒(gi)、轮状病毒(rov)、沙波病毒(sapv)、单增李斯特菌(lis)、沙门氏菌(sal)、志贺氏菌(sc)、空肠弯曲杆菌(cj)、霍乱弧菌(vc)、艰难梭菌(cd)。表6.正常人群中的20例样本的检测数据表7.感染人群中的50例样本的检测数据把表6、表7的数据整理成图，分别如图3和图4。可以发现，分析ifi44l基因表达水平，在病毒感染的人群中，明显高于正常人群；而fam89a基因表达水平，在细菌感染的人群中，明显高于正常人群。因此ifi44l表达升高，可以判断为病毒感染；而fam89a基因表达升高，可以判断为细菌感染。应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。序列表<110>广州奥百阕谱生物科技有限公司<120>用于鉴别患者是否感染及感染种类的试剂盒<130>br3665<141>2018-01-24<160>11<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gctcatttcctggtatgacaacg23<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ctccccagcagtgagggt18<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tgcactgaggcagatgct18<210>4<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gtacaggctgggccaaat18<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5aagcctcccaacctggac18<210>6<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6tcatcgaagaagccgttc18<210>7<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7caacctggacgccgctct18<210>8<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8ccccttgtactcctgaatcgact23<210>9<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9ccctgttgctgtagccaaattcgt24<210>10<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10aactggtgcaattgagagagcgt23<210>11<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11agaccaaccatctctttgcgga22当前第1页12