快速突变Y染色体短串联重复序列的复合扩增体系、试剂盒及应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，含有16个高突变率y-str位点，其中7个位点属于多拷贝y-str位点，整个体系可扩增26个片段。本体系使用荧光标记引物同时扩增多个人类男性基因组y染色体dna短串联重复序列(str)，高效准确的进行str分型，进而灵敏高效的对法医个体识别和亲缘鉴定，种群遗传分析，疾病基因定位研究等提供判断依据。
背景技术：
：人类基因组str(短串联重复序列)是以少数几个碱基为核心单位，串联重复形成的dna遗传标记。不同种族、不同人群甚至不同个体之间的区分是通过核心单位序列和重复数的差异，这也构成了str的遗传多态性。在基因组中,平均每15～20kb就有一个str位点,占基因组的10％,多存在于非编码区及内含子中,重复单位为2～6bp,重复次数10～60次,片段大小在70～500bp,并按孟德尔规律呈共显性遗传。因此str复合扩增检测技术可以广泛应用于法医个体识别、亲子鉴定等领域。在人类的23对染色体中，其中一对为性别染色体即为x染色体和y染色体。而在男性精子细胞生成的过程中，y染色体是不会发生重组的，所以一般形式上会稳定遗传给自己的男性后代，故在对相同家系或相同地域男性的遗传分析中，突变率低、突变位点少的传统y-filer基因座具有明显局限性，个体识别率达不到法庭科学的要求。只能作为一种辅助检测手段，在进行dna鉴定时，配合常染色体试剂盒使用。技术实现要素：为了克服上述缺陷，本发明提供一种含有高突变率y-str位点、大幅提高男性间的区分能力的快速突变y染色体短串联重复序列的复合扩增体系、试剂盒及应用，其为含有16个短串联重复序列的扩增体系及试剂盒，具有五色荧光标记。从15pg的dna模板均可检测获得完整的基因分型图谱。本发明含有的位点均为男性高突变率的y-str位点(突变率>1％)。本发明具有极高的男性个体识别率和非父排除率，可用于法医个体识别、亲缘鉴定以及种群遗传分析，高效、精准、灵敏。为了实现上述发明目的，本发明所采取的技术方案：快速突变y染色体短串联重复序列的复合扩增体系，该复合扩增体系中包括16对引物，可同时扩增16个str位点：dys630，dys464，dyf403s1b，dyf399s1,dys518,dyf403s1a,dys527,dys713,dys612,dys626,dys627,dys526,dyf404s1,dyf387s1,dys449,dys547。所述的16对高效的特异性引物分别为(表1)：表1：复合扩增体系各基因座引物序列所述扩增体系中的被扩增位点分别由四种颜色的荧光标记，第五种荧光标记为橙色内标。相同荧光标记视为同一组，四组组合分别为：第一组dys630，dys464，dyf403b，标记为fam；第二组dyf399,dys518,dyf403a，dys527,dys713，标记为hex，第三组dys612,dys626,dys627,dys526,标记为tamra，第四组dyf404,dyf387,dys449,dys547，标记为rox，第五种荧光标记org为内标。所述扩增体系还包括pcr缓冲液、模板dna和taqdna聚合酶。所述pcr缓冲液成分包括：5mm的硫酸铵，15mm的氯化钾，50mm的ph8.3的tris-hcl，2mm的镁离子和0.3mm的dntp，所述taqdna聚合酶用量为2u。所述扩增体系扩增时的反应条件为：第1步：95℃变性5分钟，第2步：94℃变性30秒，第3步：59℃退火1分钟，第4步：70℃延伸1分钟，重复2至4步30次，最后60℃延伸10分钟。所述模板dna来自于人类的骨骼、唾液、血液、毛发，精斑或接触性检材等dna提取物。本发明还提供上述扩增体系或试剂盒在个体识别、亲子鉴定、种群遗传分析、疾病基因定位研究中应用。本发明通过对str基因座的遗传多样性研究，选择的16个位点皆为人类男性高突变率的y染色体str位点，这些位点相互之间独立性好，多态性高，能够达到更好的系统效能。本发明采用五色荧光标记系统，将上述的16个基因座按上文分组并进行荧光标记。在各基因座等位基因核心序列的上游、下游各设计一对引物，将扩增产物按照分子量大小差异分开，两个基因座之间不重叠。将所有引物混合进行复合扩增实验，无非特异扩增的现象。同时本发明的检测组分中标准物采用orange标记，能够很明确的标记区分出检测样本各个基因座位点的大小。本发明所涉及的复合扩增体系中使用的反应缓冲液(5*bufferx)具有特殊的配方(表2)表2：反应缓冲液(5*bufferx)配方本发明每个反应需要2u的热启动taqdna聚合酶。加入硫酸铵等添加剂，增强了引物、缓冲液、酶等组成的扩增体系，使得pcr扩增体系在扩增时用时较短，且能同时准确检测16个位点。而本发明申请的扩增体系具有种属特异性，且适用于多种检材，能扩增疑难样本，可扩增来源于人的血液、血痕、精液、精斑、唾液、体液、毛发、肌肉、组织、指甲等，可扩增被污染的样本、有抑制剂的样本(比如血液)及各种接触性检材(如口腔擦拭物，眼镜布，擦拭手机屏幕或鼠标的棉签)等，作为法医试剂盒其对样本的兼容性非常好。本发明所涉及的复合扩增体系使用的pcr扩增程序(表3)。表3：本发明复合扩增体系的扩增程序本发明的扩增产物需经过毛细管电泳，可用abi系列的遗传分析仪进行检测，检测结果可以在genemapper等数据分析软件上进行分析。本发明的荧光标记复合扩增检测系统适用于各种来源不同的检材。所述dna样品可用试剂盒法、酚氯仿抽提法、chelex-100法、磁珠法进行dna提取处理。本发明选择高突变率的人类y染色体dna位点，一次性扩增16个基因座，适用于所有涉及有人类男性细胞的物证案件中的法医dna分析。本发明的设计策略为：1.基因座的选择目前美国abi公司的扩增试剂盒和美国promega公司的16试剂盒，国内的如公安部二所的dnatyper15试剂盒被广为应用在身份鉴定，一般包含15个左右的基因座。随着技术的发展和客户需求的增长，试剂盒基因座数目，兼容性，信息量也逐步提高。很多遗传鉴定需要更多的基因座和更多的信息量。比如亲缘鉴定、失踪人口比对等等。y-filer基因座，突变率相对过低，突变的位点相对过少，使得其在具有相同家系或相同地域的男性的分析、排查中有明显的局限性。通常解决方法是选择两个复合扩增试剂盒作为补充以满足工作需要，此举提高成本降低效率。本发明含有高突变率y-str位点的产品，能够提高无关男性间的区分能力，一个试剂盒能够提供足够多的信息量。本发明能够分析男性的16个str位点，这些位点具有高突变率(>1％),因而使此试剂盒具备高精准度。2.引物设计所述的引物采用primerpremier5和ncbiblast等软件设计而成，设计引物时应尽量确保各引物的tm值在(59±2)℃的范围内，扩增效率类似并确保各对引物的扩增产物大小相差100bp以上。设计完成后，用autodimer等软件分析引物二聚体和不同引物之间的相互作用，如果有相互作用可产生非特异产物或者二聚体的需要重新设计，直至得到符合要求的引物序列。选用男性人源dna模板，分别用上述16对引物进行单重扩增，将扩增产物置于1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，根据电泳结果来调整pcr体系及扩增条件以得到16对引物共同的扩增条件。最终期望的效果是：在相同体系及扩增条件下，所有的引物对均能出现明亮且较单一的目的条带。如果有引物满足不了上述条件，则重新设计引物。3.荧光标记系统的建立所述选择了fam、hex、tamar、rox、org建立五色荧光复合扩增体系，将所设计的16对引物，分为四组进行荧光标记，每组采用一种荧光标记，分别是fam、hex、tmr和rox，再加上org内标。得到荧光标记引物后，用其相配对的非荧光引物组合，然后分别进行单重扩增，将扩增产物置于3500遗传分析仪上进行毛细管电泳，根据毛细管电泳检测的结果来评估每对引物的扩增效率。其后，将同一荧光标记的引物混合置于同一管中扩增，将扩增产物置于3500遗传分析仪上进行毛细管电泳，根据毛细管电泳检测的结果来确定每对引物的扩增效率，以及判断该组引物混合扩增是否引起非特异性。最后，根据单重扩增及组合扩增的毛细管电泳结果来初步确定各引物对的加入量，将16对引物混合置于同一管中扩增，再根据复合扩增的电泳结果来调整各自的浓度，使各引物对的扩增效率(反应在电泳结果的峰高上)基本一致为准。最终确定的16对引物序列。4.扩增反应体系的优化通过多次反复实验来确定16个基因座复合扩增体系的参数，包括：taqdna聚合酶的选择、mg2+浓度、缓冲液的离子强度、taqdna聚合酶用量、dna模板用量。5.反应程序的优化经过大量实验摸索了反应程序的变性、退火及延伸的温度和时间范围，认为在以下条件下(见表4)进行的扩增可以得到较好的结果：表4聚合酶链式反应扩增条件相对于现有技术，本发明的优势在于：1.含有16个人类男性y染色体高突变率str，独特新颖，信息量大，兼容性好。2.适应范围广，指向性强，精准度高，适用于所有涉及男性的有细胞的物证案件中的法医dna分析。凡是含有男性细胞的生物检材，如血迹、精斑、唾液、毛发、指甲、软骨及其它接触性检材等均能鉴定。3.系统特异性和稳定性好，经过反复验证多次，无非特异扩增产物产生，信号强度稳定。4.灵敏度高，低至15pg的dna模板量可以得到准确分型。5.抗抑制能力强，可有效抵抗血红素，腐殖酸，单宁酸，靛蓝等常见抑制剂的影响。附图说明图1为9948(国际标准品)扩增效果图；图2为等位基因分型标准物示意图；图3为chelex-100提取dna效果图；图4为磁珠法提取dna扩增效果图；图5为全血直接扩增效果图；图6为口腔拭子直接扩增效果图；图7为家系样本1扩增效果图；图8为家系样本2扩增效果图。具体实施方式下面结合说明书附图和实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。实施例1利用快速突变y染色体短串联重复序列的复合扩增体系扩增各种检材的样本1.获得dnaa.采用chelex-100法或磁珠法提取基因组dna。b.全血直接扩增c.口腔拭子直接扩增采用chelex-100法提取基因组dna(参考《forensicdnaprotocol》.humanapress,1998)；或者取0.5-5μl的抗凝全血置于500μl离心管中，振荡混匀chelex溶液使chelex充分悬浮，每管加入195μlchelex-100(5％)溶液和5μl蛋白酶k(20mg/ml)振荡混匀，56℃保温两小时或者过夜后，取出振荡2分钟，沸水中加热10分钟后13000rpm离心5分钟，小心移取150μl上清至新离心管中。2.反应体系将各反应试剂(缓冲液、引物混合物、基因组dna(如不进行dna提取，取1ul全血置于25ul反应体系中或者直接放入0.5cm*0.5cm的口腔拭子)等振荡混合后按以下方式配成pcr反应混合液，扩增体系总体积为25μl，包括引物混合物(5*primermix)5μl，其中引物浓度见表6，反应缓冲液(5*bufferx)5μl、热启动dna聚合酶1μl，基因组dna2μl(提取模板dna，直扩检材等)，ddh2o12μl。3.pcr反应程序本发明所涉及的复合扩增体系使用的pcr扩增程序(表5)。表5扩增程序表6各引物浓度在具体实施例中，各引物浓度取引物浓度范围的中间值。4.毛细管电泳检测将orange500内标和甲酰胺按比例2.5:100混合，取12.5μl混合物加入到96孔板，再加入扩增产物样品或者是等位基因标准物1μl，混合静置数分钟，95℃变性3min，立即冰浴3min，离心后放入abi3500测序仪上，准备检测。5.数据分析导入原始数据，在主页面的file菜单选择addsampletoproject，找到样品文件，选中文件夹，点击addtolist，点击add,样品文件即显示在project窗口；选择分析参数。定义analysismethod、panel、sizestandard。浏览样本电泳的原始数据，选中某样本的文件名，在“sample”菜单下选择“rawdata”。移动追踪线，使光标停在引物峰右侧(第一个橙色的内标峰前)，以此时窗口左下角x轴上显示的数值作为analysismethod分析参数中的起始点；点击绿色分析按钮，出现saveproject对话框，命名后保存，软件即开始处理数据，分析完成后左下角显示analysiscompleted。采用genemapperrid-x软件分析得到的数据并生成图谱。如下图3、图4、图5、图6，证明该体系扩增不同类型检材均可得到清晰准确的分型图。实施例2利用快速突变y染色体短串联重复序列的复合扩增体系区分家系样本1.收集家系的血液样本(血液样本由某遗传检验中心提供)2.取0.5-5μl的抗凝全血至于500μl离心管中，振荡混匀chelex溶液使chelex充分悬浮，每管加入195μlchelex-100(5％)溶液和5μl蛋白酶k(20mg/ml)振荡混匀，56℃保温两小时或者过夜后，取出振荡2分钟，沸水中加热10分钟后13000rpm离心5分钟，小心移取150μl上清至新离心管中。3.按照实施例1中的扩增条件进行pcr扩增。4.按照实施例1中在遗传分析仪上进行检测，扩增效果见图7，图8。5.结果分析见表7；表7：父子分型统计表基因座样本1样本2dys6303131dys46412/13/15/1512/13/15/16dyf403s1b13/5413/54dyf399s123/23/25.123/23/25.1dys5184343dyf403s1a16/1716/17dys52720/2220/22dys7133232dys6123636dys6263333dys6272424dys5263939dyf404s113/1413/14dyf387s136/4236/42dys4492929dys5475052结论：对同家系两个样本鉴定，常规y-filer试剂盒检测出来的y染色体基因座分型完全一致，选用突变率更高，多态性更好的快速突变y染色体短串联重复序列的复合扩增体系进行扩增，可区分开两个样本。实施例3抗抑制能力验证用1ng的阳性对照进行扩增，并向体系中加入不同浓度的腐殖酸。实验证明，在体系中含有高浓度抑制剂的情况下，该复合体系仍然能够完全扩增，除部分片段受到抑制外，大部分片段未受影响。因此，本发明的扩增体系的抗抑制能力高，适用于常见的案件检材。实施例4男女混合样本验证虽然y染色体为男性特有的，但在实际应用中我们发现，由于y染色体和x染色体具有高度同源性，某些y-str同样有可能扩增出女性样本，而在奸杀案中，警方经常能够采集到男女混合样本。这就要求y-str的引物设计必须具有很好的特异性，才能避免在女性样本含量过高的混合斑中检出非目的条带，对犯罪嫌疑人的dna鉴定造成困扰。用1ng的男性样本与不同浓度的女性样本混合。实验证明，在超高浓度的女性模板影响下，仍能扩增出完整的男性样本条带，且无非特异扩增。上述实施例仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和等同替换，这些对本发明权要求进行改进和等同替换后的技术方案，均落入本发明的保护范围。序列表<110>苏州阅微基因技术有限公司<120>快速突变y染色体短串联重复序列的复合扩增体系、试剂盒及应用<130>xhx2017121304<141>2017-12-13<160>32<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>16<212>dna<213>homosapiens<400>1agactccacctcaaaa16<210>2<211>22<212>dna<213>homosapiens<400>2ttgtgaggacttcccagccatg22<210>3<211>23<212>dna<213>homosapiens<400>3gactgacagaaccctgagtttac23<210>4<211>19<212>dna<213>homosapiens<400>4tttcacggaagaaaagaaa19<210>5<211>22<212>dna<213>homosapiens<400>5atattactttaaacatagtttg22<210>6<211>22<212>dna<213>homosapiens<400>6aacagagcaggattccatctaa22<210>7<211>20<212>dna<213>homosapiens<400>7accagtttgcataggtagag20<210>8<211>21<212>dna<213>homosapiens<400>8aacccagaagtctcatatgct21<210>9<211>18<212>dna<213>homosapiens<400>9gcacgttctcgaaaaaag18<210>10<211>19<212>dna<213>homosapiens<400>10tagttttctaatcacatct19<210>11<211>19<212>dna<213>homosapiens<400>11ttaatgtaaacatagttca19<210>12<211>21<212>dna<213>homosapiens<400>12agagcaggattccatctaaaa21<210>13<211>20<212>dna<213>homosapiens<400>13tcgcaaacatagcacttcag20<210>14<211>25<212>dna<213>homosapiens<400>14aaaaccatttataagcacttctcag25<210>15<211>25<212>dna<213>homosapiens<400>15gtgcaagccaagggctttataagtt25<210>16<211>23<212>dna<213>homosapiens<400>16aaatacaaaaaggtgtctgggca23<210>17<211>16<212>dna<213>homosapiens<400>17gccttaagacatagga16<210>18<211>19<212>dna<213>homosapiens<400>18aataatttggaaaagtgac19<210>19<211>18<212>dna<213>homosapiens<400>19cctgggtgacagagtgca18<210>20<211>17<212>dna<213>homosapiens<400>20atgtttgttctttcttt17<210>21<211>22<212>dna<213>homosapiens<400>21catctaaaaacaaaaatcaaag22<210>22<211>19<212>dna<213>homosapiens<400>22acataattcaaaaaccatg19<210>23<211>25<212>dna<213>homosapiens<400>23gtttgttttcagcaaacaccttagc25<210>24<211>25<212>dna<213>homosapiens<400>24aagtaaacgtttgggttacttcgcc25<210>25<211>17<212>dna<213>homosapiens<400>25actgaagtttatcaaag17<210>26<211>17<212>dna<213>homosapiens<400>26agtccatctttgacaaa17<210>27<211>19<212>dna<213>homosapiens<400>27cactccagcctgggtgaca19<210>28<211>20<212>dna<213>homosapiens<400>28tgtgagaagtgctaccacag20<210>29<211>20<212>dna<213>homosapiens<400>29tttttttaggctagagattc20<210>30<211>20<212>dna<213>homosapiens<400>30aacaagagtaagacagaaac20<210>31<211>16<212>dna<213>homosapiens<400>31tacacaatcttatttt16<210>32<211>18<212>dna<213>homosapiens<400>32acactccagcctgagtga18当前第1页12