一种针对禽偏肺病毒分型鉴定的荧光定量检测试剂盒的制作方法

文档序号：14649991发布日期：2018-06-08 21:35阅读：318来源：国知局

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种针对禽偏肺病毒分型鉴定的荧光定量检测试剂盒。

背景技术：

禽偏肺病是由禽偏肺病毒(Avian metapneumovirus，aMPV)引起家禽呼吸道感染的急性高度传染性疾病，禽偏肺病毒又称为火鸡鼻气管炎病毒(Turkey rhinotracheitis virus，TRTV)或禽肺炎病毒(Avian pneumovirus，APV)。主要通过空气传播，禽偏肺病对世界范围内的养禽业造成严重的经济损失。目前我国是世界上排名第一的养鸡大国，鸡的饲养量96亿只，每年因各类禽病带来的死亡率高达20％～25％，损失几百亿人民币。因此，研制特异、灵敏、简便的鉴别检测试剂盒是我国当前防控疫病的迫切需求。

aMPV现有的常规诊断方法如免疫荧光、病毒分离、虽有各自的优点，但均存在敏感性、特异性及时耗等方面的不足，这给禽偏肺病的低成本快速净化措施的制定带来了巨大难度。因此，建立一种快速、敏感、特异地鉴别禽偏肺病，规避干扰的分子生物学诊断方法势在必行。同时，Real-time RT-PCR技术以其独有的准确定性与定量优势备受研究者青睐，相比其他半定量方法，实现了真正意义上的定量，相对定量技术更使得真正意义上的核酸动态研究成为可能。根据G基因核苷酸序列的差异性，a MPV被划分为A、B、C、D四个亚型，其G蛋白长度依次为391、414、252和389个氨基酸，目前的血清学检测技术还不能提供禽偏肺病毒的分型鉴定。在应用Real-time RT-PCR技术检测的时候需要考虑的是设计亚型特异性引物。

TaqMan探针全称TaqMan Minor Groove Binder probe，与普通TaqMan水解探针不同之处在于探针的3'端连接一个不发荧光的Q基团和一个特殊的小沟结合子(Minor Groove Binder probe)，这种特殊的设计赋予了MGB探针三大优势一是显著提高Tm值，这样可以减少探针设计长度，对AT富含区的探针设计更为有利；二是可以降低背景荧光信号，提高信噪比，使实验结果更精确，分辨率更高；三是提高了探针与互补模板的结合特异性，即使一个碱基的不匹配都能精确分辨。

技术实现要素：

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种针对禽偏肺病毒分型鉴定的荧光定量检测试剂盒，以解决现有技术中缺乏一种此类试剂盒的技术问题。

本发明要解决的另一技术问题是现有技术中针对禽偏肺病毒的血清学检测方法无法实现禽偏肺病毒不同亚型的分型鉴定。

本发明要解决的再一技术问题是现有技术中针对禽偏肺病毒的检测方法灵敏度低。

本发明要解决的又一技术问题是现有技术中针对禽偏肺病毒的检测方法难以实现定量检测。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种针对禽偏肺病毒分型鉴定的荧光定量检测试剂盒，所述试剂盒包括五条探针，分别为：序列如SEQ ID NO.3所示的、用于检测禽偏肺病毒A亚型G蛋白表达基因的特异性探针；序列如SEQ ID NO.6所示的、用于检测禽偏肺病毒B亚型G蛋白表达基因的特异性探针；序列如SEQ ID NO.9所示的、用于检测禽偏肺病毒C亚型G蛋白表达基因的特异性探针；序列如SEQ ID NO.12所示的、用于检测禽偏肺病毒D亚型G蛋白表达基因的特异性探针。

作为优选，所述试剂盒还包括序列如SEQ ID NO.15所示的、用于检测鸡ACTB基因的特异性探针；其中所述鸡ACTB基因是所述试剂盒中的内参基因。

作为优选，所述试剂盒还包括序列如SEQ ID NO.1所示的、针对禽偏肺病毒A亚型G蛋白表达基因的特异性上游引物，还包括序列如SEQ ID NO.2所示的、针对禽偏肺病毒A亚型G蛋白表达基因的特异性下游引物。

作为优选，所述试剂盒还包括序列如SEQ ID NO.4所示的、针对禽偏肺病毒B亚型G蛋白表达基因的特异性上游引物；还包括序列如SEQ ID NO.5所示的、针对禽偏肺病毒B亚型G蛋白表达基因的特异性下游引物。

作为优选，所述试剂盒还包括序列如SEQ ID NO.7所示的、针对禽偏肺病毒C亚型G蛋白表达基因的特异性上游引物，还包括序列如SEQ ID NO.8所示的、针对禽偏肺病毒C亚型G蛋白表达基因的特异性下游引物。

作为优选，所述试剂盒还包括序列如SEQ ID NO.10所示的、针对禽偏肺病毒D亚型G蛋白表达基因的特异性上游引物，还包括序列如SEQ ID NO.11所示的、针对禽偏肺病毒D亚型G蛋白表达基因的特异性下游引物。

作为优选，所述试剂盒还包括序列SEQ ID NO.13所示的针对鸡看家基因的特异性上游引物；还包括序列SEQ ID NO.14所示的针对鸡看家基因的特异性下游引物。

作为优选，所述试剂盒包括针对鸡ACTB基因的第一反应体系，所述第一反应体系包括以下成分：10×PCR Buffer 5μL，0.07μM的dNTP Mixture 1.4μL，2U/μL的SSIII反转录酶0.5μL，0.05U/μL的Taq HS DNA聚合酶0.5μL，浓度为0.4μM、序列如SEQ ID NO.13所示的上游引物2μL，浓度为0.6μM、序列如SEQ ID NO.14所示的下游引物3μL，浓度为0.08μM、序列如SEQ ID NO.15所示的探针0.8μL，RNA溶液10μL，DEPC水26.8μL。

作为优选，所述试剂盒包括针对禽偏肺病毒A亚型G蛋白表达基因、禽偏肺病毒B亚型G蛋白表达基因、禽偏肺病毒C亚型G蛋白表达基因、禽偏肺病毒D亚型G蛋白表达基因的第二反应体系，所述第二反应体系包括以下成分：10×PCR Buffer 5μL，0.08μM的dNTP Mixture 1.6μL，2U/μL的SSIII反转录酶0.5μL，0.05U/μL的Taq HS DNA聚合酶0.5μL，浓度为0.6μM、序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.10所示的混合上游引物3μL，浓度为0.6μM、序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.11所示的混合下游引物3μL，浓度为0.16μM、序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.12所示的混合探针1.6μL，RNA溶液10μL，DEPC水24.8μL。

作为优选，所述试剂盒的PCR反应条件为：50℃反转录20min，94℃预变性2min，88℃变性8s，60℃退火、延伸35s，共40个循环，而后收集荧光。

本发明提供了一种针对禽偏肺病毒分型鉴定的荧光定量检测试剂盒，该技术方案首先通过特异的荧光引物的设计和筛选，FQ-PCR反应体系和条件的优化，经特异性试验、灵敏度试验、敏感性、重复性、稳定性及符合性试验的验证，建立快速、灵敏、特异的鉴别检测方法，并应用于临床检测。然后以鸡的ACTB基因为内参，建立ACTB FQ-PCR反应体系，与aMPV TaqMan-MGB PCR条件进行兼容优化，建立aMPV核酸的相对定量FQ-PCR方法。

本发明通过反应体系和循环条件的系统优化，建立一套相对完善的aMPV荧光定量PCR检测方法，并能应用于临床检测，为禽偏肺病的控制和净化提供有力的技术手段。

此外，本发明以上述aMPV荧光定量PCR体系为基础，建立一套基于鸡ACTB基因的ACTB FQ-PCR体系，并将两个体系进行反应条件的兼容优化，实现aMPV与ACTB的同板PCR扩增，利用Livak的2^-△△CT模型，进行急性感染鸡实体组织、器官中aMPV核酸含量的定量检测。

附图说明

图1是本发明具体实施方式中aMPV TaqMan-MGB A(F/R)PCR引物熔解曲线。

图2是本发明具体实施方式中aMPV TaqMan-MGB B(F/R)PCR引物熔解曲线。

图3是本发明具体实施方式中aMPV TaqMan-MGB C(F/R)PCR引物熔解曲线。

图4是本发明具体实施方式中aMPV TaqMan-MGB D(F/R)PCR引物熔解曲线。

图5是本发明具体实施方式中aMPV MGB引物优化扩增曲线。

图6是本发明具体实施方式中ACTB1熔解曲线。

图7是本发明具体实施方式中ACTB2熔解曲线。

图8是本发明具体实施方式中aMPV MGB引物优化扩增曲线。

图9是本发明具体实施方式中ACTB探针浓度优化扩增曲。

图10是本发明具体实施方式中10倍梯度稀释的aMPV RNA RT-nPCR结果。

图11是本发明具体实施方式中TaqMan-MGB PCR扩增结果。

图12是本发明具体实施方式中10倍梯度稀释的aMPV RNA RT-nPCR和TaqMan-MGB PCR扩增结果。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

实施例1 aMPV鉴别检测试剂盒引物和探针的设计

1、aMPV TaqMan-MGB PCR鉴别检测试剂盒分型鉴定引物、探针的设计：

对GeneBank公布的A、B、C、D四个亚型的基因全序列进行综合比对,避开四个亚型的同源区,保证荧光探针和引物的特异性，利用Primer Express 2.0软件,设计四套引物，分别命名为MGB-A(F/R)、MGB-B(F/R)、MGB-C(F/R)、MGB-D(F/R)。引物和探针设计结果见表1

表1 aMPV分型鉴定引物和探针

2、鸡看家基因的设计与筛选。

对GeneBank公布的鸡看家基因序列,设计了2对引物和探针作为候选内参,分别命名为ACTB-F1、ACTB-P1、ACTB-R1；ACTB-F2、ACTB-P2、ACTB-R2。引物和探针见表2.

表2鸡看家基因ACTB的探针和引物

3、aMPV TaqMan-MGB PCR鉴别检测试剂盒引物和探针的验证

(1)验证方法：将以上设计的引物对MGB-A(F/R)、MGB-B(F/R)、MGB-C(F/R)、MGB-D(F/R)、ACTB-F1、ACTB-P1、ACTB-R1；ACTB-F2、ACTB-P2、ACTB-R2首先进行普通扩增,琼脂糖凝胶电泳检测,扩增产物测序,进行第1轮验证,淘汰不理想引物对。反应体系见表3

表3 Universal SYBR Green One-Step Kit反应体系

用引物进行普通RT-PCR扩增,1.5％琼脂糖凝胶电泳检测,扩增产物测序合格的引物对采用Universal SYBR Green One-Step Kit(BIO-RAD)试剂盒进行引物熔解曲线检测分析,验证其特异性。反应条件50℃30min，95℃5min，95℃10s，60℃30s(40个循环)，试验检测结束后，以Excel格式输出CT值，待数据分析。

(2)结果判定：

电泳检测出现单一目的条带,PCR产物测序正确,Real-time熔解曲线呈单一熔解峰,满足以上3条标准的引物对判为合格。

aMPV引物MGB-A(F/R)、MGB-B(F/R)、MGB-C(F/R)、MGB-D(F/R)经普通RT-PCR扩增后,电泳检测分别出现104bp、112bp、168bp、156bp大小的目的条带,产物测序结果正确。

引物MGB-A(F/R)、MGB-B(F/R)、MGB-C(F/R)、MGB-D(F/R)经SYBR PremixExTaq熔解曲线显示单一熔解峰,说明该引物对模板具有很好的特异性,见图1至图5。

ACTB-F1、ACTB-R1；ACTB-F2、ACTB-R2两对引物经普通RT-PCR扩`增后,均出现101bp大小的目的条带,产物测序结果均正确。

ACTB-F1、ACTB-R1，ACTB-F2、ACTB-R2，引物经SYBR premixExTaqTM熔解曲线分析结果示,ACTB-F1、ACTB-R1引物对显示单一熔解峰,说明该对引物对对模板具有很好的特异性,ACTB-F2、ACTB-R2引物对显示双峰，结果见图6、图7。

实施例2 aMPV TaqMan-MGB PCR鉴别检测试剂盒反应体系的优化：

以下所有的优化均采用如下参考反应体系和参考循环参数进行：见表4和表5

表4参考反应体系

1、aMPV TaqMan-MGB PCR鉴别试剂盒上下游引物浓度的优化

aMPV引物的浓度优化采用梯度递增的方法,选0.3、0.4、0.5、0.6、0.7um 5个梯度,进行交叉配对组合试验,反应条件同表5。每个浓度组合重复次,取平均值,结合曲线平滑度、荧光强度综合判定优化结果。

选用经过验证的aMPV引物MGB-A(F/R)、MGB-B(F/R)、MGB-C(F/R)、MGB-D(F/R),进行浓度组合的优化,取3个重复的平均值。引物优化扩增曲线如下图8，引物浓度优化结果见表6。

表6引物浓度优化结果

由图8和表6可以见,上下游引物浓度各取0.6uM时,CT值相对较小、扩增曲线较陡峭(扩增效率高)、荧光值最高,所以O.6uM应为最佳引物浓度。

2、aMPV TaqMan-MGB PCR鉴别检测试剂盒探针浓度的优化

选用优化后的引物配比(0.6uM/0.6uM),进行探针浓度优化,取3个重复的平均值,探针终浓度选0.06、0.08、0.1、0.12、0.14、0.16、0.18、0.2uM 8个梯度,反应条件同上。每个浓度组合重复3次,取平均值,结合曲线平滑度、荧光强度综合判定优化结果见表7。

表7 aMPV MGB探针浓度优化结果

由表7可见,探针浓度为0.16uM时,CT值最小且扩增曲线陡峭、荧光值最高,所以0.16uM应为最佳探针浓度。

3、aMPV TaqMan-MGB PCR鉴别检测试剂盒SSIII反转录酶用量的优化

采用以上优化好的引物、探针浓度进行SSIII反转录酶的优化,选0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8uL 8个梯度,反应条件见表5。每个浓度组合重复3次,取平均值,结合曲线平滑度、荧光强度综合判定优化结果。结果见表8：

表8 aMPV TaqMan-MGB PCR鉴别检测试剂盒SSIII反转录酶用量优化结果

SSIII反转录酶取0.5ul可达到较小CT值、较高荧光增幅、较好扩增质量,SSIII反转录酶用量选0.5ul。

4、aMPV TaqMan-MGB PCR鉴别检测试剂盒DNA聚合酶Taq HS用量的优化

采用以上优化好的引物、探针、反转录酶用量进行Taq HS聚合酶的优化,Taq HS选0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0uL 8个梯度,反应条件见表5。每浓度组合重复次,取平均值,结合曲线平滑度、荧光强度综合判定优化结果见表9。

表9 aMPV TaqMan-MGB PCR鉴别检测试剂盒DNA聚合酶Taq HS用量优化结果

5、aMPV TaqMan-MGB PCR鉴别检测试剂盒dNTP浓度的优化

采用以上优化好的引物、探针、反转录酶、聚合酶用量进行dNTP优化,选0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0uL 10个梯度,反应条件见表5。每个浓度组合重复次,取平均值,结合曲线平滑度、荧光强度综合判定优化结果见表10。

表10 TaqMan-MGB PCR鉴别检测试剂盒dNTP浓度的优化结果

选用以上优化好的组分用量,进行dNTP用量优化,由表10可见,dNTP用量超过1.6ul后CT值,荧光增幅变化不大,所以1.6为合适用量。

综上各组分系统的优化结果,aMPV TaqMan-MGB PCR反应体系确定,见表11.

表11 aMPV TaqMan-MGB PCR最佳反应体系

实施例3 ACTB FQ-PCR反应体系的优化

1、ACTB FQ-PCR上下游引物浓度的优化

选用经过验证的ACTB引物ACTB-F、ACTB-R,进行浓度组合优化,取3个重复的平均值。ACTB引物浓度优化采用梯度递增方法,选0.3、0.4、0.5、0.6、0.7uM 5个梯度,进行交叉配对组合试验,反应条件同见表5。每浓度组合重复次,取平均值,结合曲线平滑度、荧光强度综合判定优化结果。由表12可见,上游引物(ACTB-F)取0.4uM,下游引物(ACTB-R)取0.6uM时,CT值相对较小，扩增质量最好、荧光增幅最高。所以0.4uM/0.6uM应为最佳引物配比。

表12 ACTB引物浓度优化结果

2、ACTB FQ-PCR探针浓度的优化

选用优化后的引物配比(0.4uM/0.6uM),进行探针浓度优化,取3个重复的平均值，探针终浓度选0.06、0.08、0.1、0.12、0.14、0.16uM 6个梯度,反应条件见表5。每浓度组合重复次,取平均值,结合曲线平滑度、荧光强度综合判定优化结果。结合图9,表13可见,探针浓度为0.08uM时,CT值较小、重复性最好:且由图可以看出在该浓度时,扩增曲线陡峭、荧光值高,所以0.08uM应为最佳探针浓度。

表13 ACTB探针浓度优化结果

3、ACTB FQ-PCR SSIII反转录酶用量的优化

选用优化后的引物和探针浓度,进行反转录酶优化,选0.3、0.4、0.5、0.6、0.7uL5个梯度,反应条件见表5。每浓度组合重复次,取平均值,结合曲线平滑度、荧光强度和重复性综合判定优化结果。由表14可见,SSIII取0.5uL时,CT值最小且扩增曲线与荧光值最佳,所以SSIII用量选0.5uL。

表14 ACTB反转录酶SSIII用量优化结果

4、ACTB FQ-PCR Taq HS DNA聚合酶用量的优化

采用以上优化好的引物、探针、反转录酶用量进行聚合酶酶优化,选0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0uL 8个梯度,反应条件见表5。每浓度组合重复次,取平均值,结合曲线平滑度、荧光强度综合判定优化结果。由表15可见,TaqHS用量从0.3-1.0uL时,CT值差异不大,但0.5uL时重复性最好,且用量相对较小,所以为节约TaqHSDNA聚合酶用量,即选用0.5uL。

表15 ACTB DNA聚合酶TaqHs用量优化结果

5、ACTB FQ-PCR dNTP浓度的优化

采用以上优化好的引物、探针、SSIII反转录酶、Taq HS聚合酶用量进行优化,

选1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0uL 5个梯度,反应条件见表5。每浓度组合重复次,取平均值,结合曲线平滑度、荧光强度综合判定优化结果。由表16可见,dNTP 1.0-2.0uL CT值差异不明显,荧光增幅变化也不大,而取1.4uL时,变异系数最小,重复性最好,所以选用1.4uL作为最佳dNTP用量。

表16 ACTB dNTP用量优化结果

综上各组分系统的优化结果,ACTB FQ-PCR反应体系确定,见表17

表17 ACTB FQ-PCR最佳反应体系

实施例4反应条件优化

1、aMPV TaqMan-MGB PCR鉴别检测试剂盒循环条件的优化

在完成以上所有反应试剂优化的基础上进行反应参数优化,按以下5组参数进行同一样品aMPV TaqMan-MGB PCR检测,样品设3个重复,并设阴性对照,以同样的标准手动设定阈值线,比较5组参数下反应的CT值。

50℃30min，95℃5min，95℃15s，60℃35s，40cycle

50℃20min，95℃5min，95℃15s，60℃35s，40cycle

50℃20min，94℃3min，92℃15s，60℃35s，40cycle

50℃20min，94℃2min，88℃15s，60℃35s，40cycle

50℃20min，94℃2min，88℃8s，60℃35s，40cycle

从5组参数对同一样品进行aMPV TaqMan-MGB PCR反应结果分析,CT值变化不大,但50℃20min，94℃2min，88℃8s，60℃35s，40cycle可以明显节省时间,由熔解曲线可以看出,FQ-PCR目标产物在84℃出现熔解峰,说明在此温度以上即可使产物片段解链变性,所以将变性温度降至88℃,由于目标片段较短,变性时间缩短至8sec,可保护Taq酶,提高灵敏度,预变性94℃4min为Taq酶活性热启动所必须。所以,反应参数选定为50℃20min，94℃2min，88℃8s，60℃35s，40cycle时收集荧光。

2、aMPV TaqMan-MGB PCR鉴别检测试剂盒临界点的确定

10倍梯度稀释的RNA,同时进行aMPV TaqMan-MGB PCR反应和RT-nPCR反应，对两个体系的反应产物同时进行测序,以测序结果对应梯度的CT值作为试剂盒的临界点判断依据。10倍梯度稀释的RNA,同时进行aMPV TaqMan-MGB PCR反应和RT-nPCR反应结果见图10/11。

将图10和11中8个梯度的RT-nPCR和TaqMan-MGB PCR扩增产物送上海生工测序,测序结果见表18

表18 RT-nPCR和TaqMan-MGB PCR扩增产物测序结果

注:“+”表示测序结果阳性；“一”表示测序结果阴性

由表18可见,RT-nPCR产物测序可达10^-7梯度,TaqMan-MGB PCR产物测序可达10^-6梯度,对应梯度的CT值分别为34.02和30.44,由此结果,我们将aMPV TaqMan-MGB PCR鉴别检测试剂盒的阳性临界点确定为30.44,阴性临界点确定为34.02,当CT值介于30.44与34.02之间时,样本判为可疑,建议重做,重做CT值≤30.44判为阳性,>30.44判为阴性。

3、aMPV TaqMan-MGB PCR相对定量体系扩增效率的测定

10倍梯度稀释的RNA,按上述优化后的体系和循环条件,进行同板FQ-PCR扩增,分别得到aMPV和ACTB的扩增标准曲线,软件自动计算斜率(Slope),再由公式E＝10^(-1/Slope)-1,计算扩增效率E_aMPV和E_ACTB，分别为91.7％和92.4％。

两体系标准曲线在CT值<35范围内R²值均为0.998,说明本方法直线相关性好,能保证较宽范围准确定量；扩增效率分别为91.7％和92.4％,保持相近,满足2^-△△CT相对定量方法数据处理模型的前提。

实施例5 aMPV TaqMan-MGB PCR鉴别检测试剂盒特异性试验

1、aMPV TaqMan-MGB PCR鉴别检测试剂盒三批试剂的制备

按表19配制3批aMPV TaqMan-MGB PCR鉴别检测试剂盒的反应液,记为20150801、20150802、20150803,供以下优化试验使用。

表19 aMPV TaqMan-MGB PCR最佳反应体系

2、aMPV TaqMan-MGB PCR鉴别检测试剂盒19个质控样品的制备

背景清楚的19个质控样本作为试剂盒的试验样本,其中包括禽偏肺病毒A/B/C/D四个亚型样本,且每个样本按每管200ul分装,用于试剂盒特异性、敏感性、灵敏度、重复性、稳定性和符合性试验。表20，试剂盒质控样本信息。

表20试剂盒质控样本信息

上述背景清楚的19个质控样本作为试剂盒的试验样本,其中包括A亚型、B亚型、C亚型、D亚型禽偏肺病毒样本,且每个样本按每管200uL分装,用于试剂盒特异性、敏感性、灵敏度、重复性、稳定性和符合性试验。

3、aMPV TaqMan-MGB PCR鉴别检测试剂盒特异性试验

采用20150801、20150802、20150803三个批号的aMPV TaqMan-MGB PCR鉴别检测试剂盒反应液,对19个背景清楚的质控样本200ul提取的总RNA,按优化后的体系和循环条件,进行TaqMan-MGB PCR反应,检测其特异性。

20080801、20080802、20080803三个批号的aMPV TaqMan-MGB PCR鉴别检测试剂盒反应液对19个质控样本FQ-PCR检测结果显示,3个aMPV质控株检测为A亚型,1个aMPV质控株检测为B亚型,13个aMPV质控株检测为C亚型,2个aMPV质控株检测为D亚型。证实该方法具有很好的特异性,能鉴别禽偏肺病毒的四个亚型，检测结果见表21

表21 aMPV TaqMan-MGB PCR鉴别检测试剂盒特异性检测结果

4、aMPV TaqMan-MGB PCR鉴别检测试剂盒灵敏度试验

200ul样本提取RNA,紫外分光光度计(Nano Drop-2000)测定OD₂₆₀、OD₂₆₀/OD₂₈₀,换算成浓度为64ng/ul，10^-1到10^-8梯度稀释后,同时进行FQ-PCR和RT-nPCR反应,检测其灵敏度。

10倍梯度稀释的样品RNA平行进行TaqMan-MGB PCR反应和RT-nPCR检测,TaqMan-MGB PCR鉴别在10^-8都有阳性扩增信号,而RT-nPCR的阳性条带只能持续到10^-7,同时对阳性条带进行序列测定，证实测序结果正确,说明我们建立的TaqMan-MGB PCR鉴别方法的灵敏度比本实验室的RT-nPCR方法高1个数量级,结果见图12。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 天津瑞普生物技术股份有限公司

<120> 一种针对禽偏肺病毒分型鉴定的荧光定量检测试剂盒

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 0

<212> DNA