一种快速检测腐食酪螨的LAMP试纸条及其应用的制作方法

本发明属于试纸条检测领域，具体为一种快速检测腐食酪螨的lamp试纸条及其应用。

背景技术：

腐食酪螨(tyrophagusputrescentiae)属于蛛形纲(arachinida)、蜱螨亚纲(acari)，真螨目(acariformes)粉螨亚目(acaridida)，是世界性分布的仓储害螨，寄主范围广，包括大米、麸皮、小麦、花生、奶酪、干果和蜜饯、面粉等各种储藏物及各类中药材，也是食用菌栽培中常见的害螨。还携带并传播病原菌，造成储藏物霉变，引起人类过敏性皮炎、肺螨病、肠螨病等。我国是食用菌生产大国也是出口大国，螨虫是危害食用菌的一个重要类群。在栽培中，食用菌菌种培养期温度控制在22～23℃、相对湿度在60～80％，虽适宜食用菌菌丝的快速生长，但温暖潮湿的环境为螨虫的滋生提供有利条件，螨虫成为食用菌栽培中的隐患。

螨虫既取食菌丝又为害子实体，寄主受害症状与病害相似，给螨虫的防治和鉴定工作带来困难，加之螨虫通常从栽培袋袋口或出菇(耳)孔处侵染袋(瓶)内，钻蛀到基质内取食为害，给鉴定工作带来很大的挑战。目前，鉴定农业害螨的方法主要是电镜观察法和dna指纹图法等。电镜观察法虽然经典，但是要求具有相关专业背景，且操作繁琐、花费时间长，且较难区分同属内形态相近的不同种，如腐食酪螨与同食酪螨(t.communis)等；利用dna指纹图谱的pcr方法，具有很大优势，但需要对扩增产物进行凝胶电泳后测序确定信息，需要2～3天完成鉴定，花费时间长，费用较高，其中用到的核酸eb染料具有致癌性，对人造成潜在安全。尘螨属于粉螨亚目中的屋尘螨(dermatophagoidespteronyssinus)和粉尘螨(d.farinae)是最主要的室内过敏原之一，能诱发哮喘、过敏性鼻炎和湿疹等过敏性疾病的重要变应原。临床上，一般采用酶免疫法通过筛查患者血清或血浆中是否还有尘螨过敏源进行定性和定量检测。但，这种方法不适用于农业害螨。因此，迫切需要建立一种新型、简便、可靠的腐食酪螨检测技术。

近年，环介导等温扩增技术(lamp技术)结合可视化染料建立的方法与其它方法相比具有很大的优势，首先不需要操作人员的具有较强的专业水平，操作方法简单，并且简化了操作程序、降低了样品交叉污染，最后根据试纸条颜色差异和强弱，就可判断是否含有有害生物，在操作性和时效性上具有巨大的优势。只用肉眼观察到试纸条条带，就能鉴定扩增与否，而不需要繁琐的电泳和染色过程，也不需要开盖添加染料增加结果的假阳性。同时，lamp反应不需要pcr仪和昂贵的试剂，有着广泛的应用前景。

但是，目前尚未有利用环介导等温扩增(lamp)对腐食酪螨进行检测的报道。

技术实现要素：

为解决lamp反应不需要pcr仪和昂贵的试剂，但是目前尚未有利用环介导等温扩增(lamp)对腐食酪螨进行检测的报道的缺陷，本发明提供一种用于空调蓄冷的无机相变材料及其制备方法。

本发明根据lamp技术原理，以腐食酪螨gr基因作为模板，通过对反应条件和试纸条检测方法进行研究，建立腐食酪螨的lamp试纸条快速检测技术。

一种快速检测腐食酪螨的lamp试纸条，包含以下的引物组：

f3：5'-gatctgcgaactggtggac-3'；

b3：5'-ccgacagtgagatgaaggc-3'；

fip：5'-biotin-agcagttgcagggaatgtgaca-gaacagcttctggcagtct-3'；

bip：5'-fitc-ttcgccgactttgatgacctgc-gaagaggatggagtggagga-3。

所述的lamp试纸条为通用型的核酸检测纸条。

所述的腐食酪螨的lamp试纸条包含全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置和上述引物，所述全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置为通用型的核酸检测纸条置入一个掌上塑料装置内得到。

进一步的，所述的腐食酪螨的lamp试纸条，还包括反应缓冲液、链置换dna聚合酶、镁离子、dntps混合物溶液，余量为水。优选的，所述的镁离子为100mmol/l的mgso4溶液。

进一步的，所述的腐食酪螨的lamp试纸条，包括10pmol/l的引物f3、10pmol/lb3、10pmol/lfip和10pmol/lbip、8u/l的链置换dna聚合酶、2.5mmol/l的dntps混合物溶液。

一种快速检测腐食酪螨的lamp试纸条的应用，包括以下步骤：

(1)提取待检样品的总dna；

(2)配置lamp-tp检测体系，包括反应缓冲液、链置换dna聚合酶、镁离子、dntps混合物溶液、引物f3、b3、fip和bip；

(3)向(2)中加入步骤(1)提取的待检样品总dna，混合均匀后置于恒温设备；

(4)按反应程序进行扩增反应，反应程序依次为：60℃～65℃40min～60min，80℃15min；

(5)反应结束后，将步骤(4)的反应体系得到的产物用核酸试纸条检测，5分钟后观察颜色反应判断检测结果；

判断标准为：肉眼直接判读

阴性(-)：仅在质控区有(c)出现一条红色条带，在检测区(t)内无红色，证明所检测的样本没有腐食酪螨为害；

阳性(+)：出现两条红色条带，一条位于检测区(t)内，另一条位于质控区有(c)内，证明所检测的样本为腐食酪螨为害；

无效：质控区(c)和检测区(t)内均无红色条带出现，表明核酸试纸条失效。

所述的检测猪瘟病毒的rt-lamp核酸试纸条试剂盒的应用于非疾病诊断目的。

本发明所提供的快速检测方法简便高效，可以在60min内完成反应，样本灵敏度高，可检测到0.5ng/μldna无需反转录，即使样品含有1头腐食酪螨，也可以检测出来。本发明的检测方法中基因序列的特异性高，并且在引物的5’添加了生物素降低了样品的假阳性，整个反应在封闭容器内完成，不需要开盖，防止污染，检测结果直观准确。

本发明所述的腐食酪螨lamp试纸条快速检测方法可简便、快速、灵敏地检测腐食酪螨，无需昂贵的仪器设备，只需保温杯或水浴锅即可完成反应，该方法操作简单、成本低廉，反应结果易于观察，特异性高，可实现农业生产或粮食储藏中腐食酪螨危害田间检测，易于大范围的应用推广。

附图说明

图1是lamp核酸试纸条检测法的特异性检测。图1a为核酸试纸条显色反应；图1b为琼脂糖凝胶电泳，m:dl2000dnamaker；

其中1-6分别为腐食酪螨(t.putrescentiae)、同食酪螨(t.communis)、罗宾根螨(rhizoglyphusrobini)、异型迟眼蕈蚊(bradysiadifformis)、托拉斯假单胞杆菌(pseudomonastolaasii)和糙皮侧耳(pleurotusostreatus)。

图2是lamp反应体系温度优化电泳图；图2a温度优化的核酸试纸条显色反应；图2b为温度优化的琼脂糖凝胶电泳；m:dl2000dnamaker；

图3是lamp反应体系扩增时间的优化电泳图；图3a扩增时间优化的核酸试纸条显色反应；图3b为扩增时间优化的琼脂糖凝胶电泳；m:dl2000dnamaker；

图4是lamp核酸试纸条检测法的灵敏度检测结果图；其中，图4a为核酸试纸条显色反应；图4b为琼脂糖凝胶电泳；m:dl2000dnamaker，dna终浓度设置为50ng/ul、10ng/ul、1.0ng/ul、0.5ng/ul、0.3ng/ul和0.15ng/ul。

图5和图6是利用lamp-tppcr法对田间样品灵敏度检测的琼脂糖凝胶电泳；

编号1～5样品是成都双孢蘑菇a.bisporus(ab)上腐食酪螨为害的样品，编号6～15是哈尔滨金针菇f.velutipes(fv)上腐食酪螨为害的样品，16～37是济南糙皮侧耳p.ostreatus(po)上腐食酪螨为害的样品。

具体实施方式

实施例

1.样品dna提取

在体视镜下从样品中挑取50头腐食酪螨，研杵棒研碎后利用genomicdnapurificationsystem(promega,usa)试剂盒提取50头腐食酪螨样品的总dna，ddh2o溶解置于-20℃保存。

2.lamp-tp检测体系配制

1)引物设计

根据gr1蛋白基因序列，设计4条特异性lamp-pcr扩增引物，其中，bip引物的5’端进行fitc(异硫氰酸荧光素)标记，fip引物的5’端用biotin(生物素)标记，引物由南京擎科生物科技有限公司合成，合成后的引物用灭菌的ddh2o稀释成10pmol/l溶液，-20℃保存。序列如下：

f3为5'-gatctgcgaactggtggac-3'；

b3为5'-ccgacagtgagatgaaggc-3'；

fip为5'-biotin-agcagttgcagggaatgtgaca

-gaacagcttctggcagtct-3'；

bip为5'-fitc-ttcgccgactttgatgacctgc-gaagaggatggagtggagga-3'；

2)反应试剂

反应缓冲液bstdnapolymerasebuffer购于newenglandbiolabs公司、链置换dna聚合酶bstdnapolymerase(8u/l)购于newenglandbiolabs公司、镁离子(100mmol/l)购于大连takara公司、dntps混合物溶液(2.5mmol/l)购于大连takara公司，余量为超纯水。

3)在pcr管或离心管中依次加入上述对腐食酪螨快速检测的lamp试纸条检测液体系所需的各种试剂的加入量和浓度如下：

pcr反应体系(25μl)如下：

表1

最后用ddh2o补齐。

试验同时设立空白对照1份，以ddh2o代替dna为模板。

将上述配制好的含lamp体系的pcr管或离心管置于恒温水浴锅或保温杯中，设定反应条件60℃保持60min，然后80℃保持10min，10℃5min或在冷水中保持5min。

对步骤3)的结果判定：

反应结束后，将步骤3)的lamp反应体系得到的产物用琼脂糖凝胶电泳和核酸试纸条检测，5min后肉眼观察颜色反应判断检测结果，判断标准为：

阴性(-)：仅在质控区有(c)出现一条红色条带，在检测区(t)内无红色，证明所检测的样本没有腐食酪螨为害；如图1a中罗宾根螨样品2、同食酪螨样品3、食用菌异迟眼蕈蚊样品4、平菇黄斑病的致病菌托拉斯假单胞杆菌5和寄主糙皮侧耳6。

阳性(+)：出现两条红色条带，一条位于检测区(t)内，另一条位于质控区有(c)内，证明所检测的样本为腐食酪螨为害；如图1中1腐食酪螨危害的样品。

无效：质控区(c)和检测区(t)内均无红色条带出现，表明核酸试纸条失效。

图1b的检测结果与图1a一致，仅在1中检测到核酸。

3.lamp-tp检测条件的优化

为了得到最优化的反应温度，将lamp反应分别设置58℃、60℃、62℃、65℃，反应时间为60min，反应体系同前，通过琼脂糖凝胶电泳和试纸条检测确定最佳的反应温度，如图2所示，最佳反应时间为62℃。

以最佳反应温度62℃，将反应时间按20min、30min、40min、50min和60min递增，反应体系同前，多次重复试验中确定最佳的反应时间为50min，如图3所示，优化后的检测条件为62℃保持50min。

4.lamp-tp检测体系灵敏度和特异性分析

使用分别被腐食酪螨、罗宾根螨、同食酪螨、异迟眼蕈蚊、托拉斯假单胞杆菌危害的糙皮侧耳的样品中总dna为模板检测lamp-tp检测体系的特异性，同时以水代替模板作为阴性对照。反应体系如步骤2所述，反应条件为步骤3确定的优化条件，使用pcr管或离心管将反应液和模板添加后密闭反应60min后，对产物进行试纸条的快速检测。得到的结果显示(图1a)，其它害虫危害的糙皮侧耳的样品-罗宾根螨、同食酪螨、异迟眼蕈蚊、托拉斯假单胞杆菌以及糙皮侧耳寄主本身的lamp-tp试纸条法检测在仅在质控区有(c)出现一条红色条带，在检测区(t)内无红色；而腐食酪螨危害的糙皮侧耳样品lamp-tp检测结果为阳性，即出现两条红色条带，一条位于检测区(t)内，另一条位于质控区有(c)内，证明所检测的样本有腐食酪螨为害；使用琼脂糖凝胶电泳(30min)的检测结果(图1b)同样在腐食酪螨危害的样品里面出现了目的基因条带，而其他没有。

将成都、哈尔滨和济南三地收集到危害寄主-金针菇(flammulinavelutiper)、糙皮侧耳、双孢蘑菇(agaricusbisporus)和毛木耳(auriculariapolytricha)上的37个样品进行腐食酪螨检测。利用f3和b3一对引物对lamp-tp检测体系得到的pcr产物琼脂糖凝胶电泳(图5和图6)，反应体系见表2。

表2

pcr程序如下：94℃预变性5min，然后94℃30s，55℃50s，72℃1min为一个循环运行25次，最后72℃延伸10min，4℃保存。

37个样品的pcr产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测如图5和图6所示，具有一条目的基因条带，而在三个寄主(镜检无腐食酪螨)上没有扩增出目的条带。

以上结果证明lamp-tp体系的特异性良好，可特异检测出不同种类害虫危害的寄主样品，且操作更简单、快捷。

在thermobiomate3s紫外可见核酸蛋白分析仪上测定genomicdnapurificationsystem(promega,usa)试剂盒提取的50头螨虫dna的含量(58.2ng/ul)，即单头螨虫的dna量约为1.2ng/ul，将dna进行10倍稀释后测定lamp-tp检测法的灵敏度。反应体系除了模板有变化，其他的反应条件按步骤3优化后的结果。dna模板的终浓度为50ng/ul、10ng/ul、1.0ng/ul、0.5ng/ul、0.3ng/ul和0.15ng/ul。多次重复试验中确定检测的模板最低浓度为0.5ng/ul，反应产物在琼脂糖凝胶电泳，如图5和图6所示。说明lamp-tp检测法具有较高的灵敏度，样品仅含一头成螨即可检测出来。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的规定范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110>江苏省农业科学院

<120>一种快速检测腐食酪螨的lamp试纸条及其应用

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gatctgcgaactggtggac19

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<212>dna

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