一种人原代结肠癌肝转移细胞株HCS1220的制作方法

本发明涉及一种结肠癌肝转移细胞株及其应用，属于生物医药技术领域。

背景技术：

结肠癌是我国目前最常见的恶性肿瘤之一，在多数结肠癌患者中肝脏是唯一的或主要的转移灶。据文献资料，15％～25％的病人在诊断时已发生肝转移， 50％～70％的晚期病人会出现肝转移，这一方面与肝部与结肠癌的位置比较接近有关，另一个方面与结肠癌癌细胞通过血液造成癌细胞的转移有关；因此控制和治疗肝转移是提高结肠癌患者生存率的重要因素。

人原代肿瘤细胞株对于研究人体内肿瘤的发病机制及制定个性化的治疗措施极为重要。目前来源于患者肿瘤组织的肿瘤细胞株已被广泛应用于药物的筛选及耐药的研究、肿瘤微环境、结肠癌的发病及转移机制研究。而人结肠癌肝转移细胞株目前存在不多，现有的存于ATCC、DSMZ、JCRB和RIKEN数据库的人结肠癌肝转移细胞株只有十余株，所以建立更多的人结肠癌肝转移细胞株是本领域研究人员亟需解决的问题。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种新型人原代结肠癌肝转移细胞株，为研究病人体内肿瘤转移的发生、耐药机制及治疗提供良好的体外模型，进而促进转移性结肠癌的基础研究、预防及临床诊治。

本发明为了实现上述目的所采取的技术方案是：

一种人原代结肠癌肝转移细胞株HCS1220，其特征在于：所述人原代结肠癌肝转移细胞株HCS1220保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学，保藏号为CCTCC NO：C2017150，保藏日期2017年10月24日。

所述人原代结肠癌肝转移细胞株HCS1220经染色体G带核型分析表明其存在染色体异常。

所述人原代结肠癌肝转移细胞株HCS1220能够导致裸鼠成瘤。

所述人原代结肠癌肝转移细胞株HCS1220对肝细胞癌标志物AFP、hep-1 和glypican-3免疫组化测定呈阴性，对结肠癌标志物CK20和CDX2免疫组化测定呈阳性。

所述人原代结肠癌肝转移细胞株HCS1220可应用于建立转移性结肠癌发生机理模型。

所述的人原代结肠癌肝转移细胞株HCS1220可应用于制备、筛选、评价抗肿瘤药物。

有益效果：本发明构建了一种新型人原代结肠癌肝转移细胞株HCS1220，可在培养基中进行体外培养，且体外培养生长快速稳定、能连续传代，进而方便建立转移性结肠癌发生机理模型；免疫缺陷鼠皮下成瘤性好，且肿瘤随着时间的延长生长迅速且浸润性强，良好的成瘤性为药物的体内试验提供了重要的保证，可作为结肠癌肝转移发病机制及个体化治疗体外研究的细胞材料，进而为制备、筛选、评价抗肿瘤药物提供基础。

附图说明

图1所示为400×镜下HCS1220细胞；

图2所示为HCS1220细胞染色体核型分析；

图3所示为支原体检测电泳图；

图中泳道M为DNAMaker，1为阴性对照管PCR产物，2为内标对照管PCR 产物，3为阳性对照管PCR产物，4为HCS1220细胞检测管PCR产物，5为 HCS1220细胞重复检测管PCR产物；

图4所示为HCS1220细胞免疫缺陷小鼠成瘤试验所得肿瘤块；

图5所示为200×镜下临床手术标本；

图6所示为200×镜下裸鼠种植瘤标本；

图7所示为40×镜下肝细胞癌标志物AFP测定结果；

图8所示为40×镜下肝细胞癌标志物hep-1测定结果；

图9所示为40×镜下肝细胞癌标志物glypican-3测定结果；

图10所示为40×镜下结肠癌标志物CK20测定结果；

图11所示为40×镜下结肠癌标志物CDX2测定结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详述：

实施例1：人原代结肠癌肝转移细胞株HCS1220的建立

1.取材

人原代结肠癌肝转移细胞株HCS1220来源于一名结肠癌肝转移患者，女性， 69岁，肝脏腺癌II～III期，于2016年12月20日行肝部肿瘤切除手术。将切下的结肠癌肝转移肿瘤组织放入盛有1/31640培养基+1％双抗的50ml离心管中，并将离心管插入盛有冰块的泡沫盒中，快速运到实验室，马上进行处理。

2.标本处理

1)取出肿瘤组织，PBS(l×PBS，无Ca²⁺、Mg²⁺)清洗2遍后用移液管吸取1×WashMedium(Invitrogen公司)反复吹洗组织，洗去血污，弃去Wash Medium。

取一平皿加8ml消化液(Invitrogen公司，0.1％Collagenase Type IV加入 DMEM中)，将组织放入平皿中，用刀片切碎。

2)切好后，弃液；再加12ml消化液冲洗，放入50ml离心管中。

3)将离心管倾斜放入培养箱消化30min，中途每10min摇一下。

4)消化完毕后组织已沉淀在底部，用移液管吸取大部分上清，通过0.45μm 过滤器过滤到50ml离心管中。

5)使用移液管轻轻吹打离心管内剩余部分并将其吸到滤膜上，将10ml培养基滴在滤膜上终止消化。

其中，培养基的配置：在1LDMEM/F12(Invitrogen公司)中依次加入50ml 10％FBS(BD公司)、5ml青链霉素(100u/ml)、1ml胰岛素。用过滤瓶过滤，混匀后，封口膜封口，-4℃保存。

6)步骤5)中离心管离心，1500r，5min。

7)离心完毕，吸弃上清，加入1ml培养基混匀，依据计数铺瓶，放入培养箱中培养。

3.挑选单克隆纯化培养

培养第2天观察贴壁细胞，纤维细胞呈星型扁平状。之后隔天换液，每天观察细胞。后续观察到多个成团细胞，细胞团似被包膜包裹，放大观察，细胞核大，可观察到核仁1～4个。继续培养细胞团中细胞增多，细胞扁平，卵圆状，细胞边界清晰，细胞周边有凋亡细胞。后续纤维细胞呈老化状态，细胞边缘薄呈雾状，成团细胞继续增多增大，4个月后绝大多数纤维细胞死亡，有贴壁肿瘤细胞团。继续培养消化传代至六孔板，隔天换液观察，持续观察到有明显细胞团，细胞团被包膜包裹，继续消化传代，截至2017年12月已经传代至12个月，并能进行每周一次稳定传代。

4.细胞传代

每天观察细胞的生长情况，隔天更换一次新鲜的培养基。7天后，对生长比较稳定的细胞进行传代处理。吸去旧培养基，用4ml PBS洗一次，以除去残留的旧培养基，利于胰酶消化细胞。洗后弃去PBS，加入lml0.25％的胰酶(GIBCO 公司)，均匀铺满整个培养皿，消化约3min，镜下观察，然后向培养皿加入3ml 培养基终止消化，然后用枪慢慢打散细胞团，以1:3的比例将细胞移至三个T75 的培养瓶中，放入CO₂培养箱培养。

5.冻存细胞

吸去旧培养基，用4mlPBS洗一次，去PBS；加入lml0.25％胰酶，放入 CO₂培养箱消化约3min；加入2ml培养基终止消化，用移液枪打散细胞团后移入15ml离心管中，1500rpm，离心3min，去除上清液，2mlPBS洗一次，去PBS。

用食指轻弹管底的细胞沉淀，然后视沉淀量的多少加入适量用培养基配制的7％的DMSO，轻轻均匀将细胞团打散，混匀，分装至冻存管中，每管装1.5ml 细胞悬液。先放入-80℃冰箱冻存，次日转移至液氮罐中永久冻存。

6)冻存细胞复苏

从液氮罐内取出冻存管，立即放入37℃水浴锅内，轻晃冻存管，使细胞悬液快速融化，约1min，将冻存管拿出，用75％的酒精擦拭管壁，然后移入无菌工作台。将细胞悬液用枪移入装有适量新鲜培养基的培养皿中，混合均匀。

如图1所示，HCS1220细胞排列紊乱，大小形态不一，多数呈不规则的多边形和卵圆形，占90％以上，核体积增大，核质比明显高于正常细胞。

当细胞长满整个培养皿后，继续培养，可见细胞重叠堆积生成，说明该细胞己失去接触性抑制，呈现恶性肿瘤细胞的形态。

实施例2：HCS1220细胞STR检测

用Axygen的基因组抽提试剂盒提取细胞DNA，并设置平行对照，以细胞 DNA为模板采用20-STR扩增方法扩增，在ABI 3730XL型遗传分析仪上对STR 位点和性别基因Amelogenin进行检测。

采用DSMZ tools进行细胞系比对，其中包含来自于ATCC、DSMZ、JCRB 和RIKEN数据库的2455个细胞系STR数据。结果发现，HCS1220细胞检测样本没有找到匹配的细胞系，本次检测在该细胞株中没有发现多等位基因，检测结果如表1所示。

表1

实施例3：HCS1220细胞核型分析

1.常规染色体标本制备

a收获细胞：将处于对数生长期的细胞用胰酶消化下来，加适量培养基终止反应。细胞悬液移入10ml离心管中，1000rpm，4min，弃上清。

b低渗处理：向离心管中加入8ml已温浴达37℃的0.56％KCl溶液，用移液管混匀，37℃恒温水浴箱中低渗30min。

c预固定：加lml新鲜配制的固定液(甲醇：冰醋酸＝3：1)并混匀，1000rpm， 8min，弃上清。

d固定：加入6ml固定液，混匀，室温下静置30min，1000rpm，8min，弃上清。

e再固定：加入4ml固定液，混匀，室温下静置30min，1000rpm，8min，弃上清。

f制片：加入0.4ml的固定液，混匀。用吸管吸取细胞悬液以20～35cm高的距离滴于清洁预冷的玻片。每片滴2～3滴，滴完后立即对准玻片吹起以助细胞分散，并立即将玻片放在酒精灯上来回过几下，静置空气中晾干。

2.G带染色

将制好的染色体玻片放在80℃烘箱中烘烤2h，置于室温。4℃冰箱中PBS 缓冲液含胰蛋白酶浓度0.0025％，消化10min。ddH₂O洗净胰酶，吉姆萨染色 20min，ddH₂O洗净染色液，晾干镜检拍照。

如图2所示，HCS1220细胞来源于人类女性的非整倍体细胞，细胞为高度异倍体，多条染色体的数目和结构都发生了异常。

细胞的恶性增殖特性包括：核分裂加速，核浆分裂失去平衡，细胞增殖失控，基因拷贝数的大量增加。这些特征是多倍体细胞出现的标志，染色体结构异常可能与细胞独立生长、生长增殖优势及免疫缺陷鼠的致瘤性等恶性细胞的特性有很明显的关联。

实施例4：HCS1220细胞污染初步鉴定

新建立的细胞株容易感染支原体，使用中乔新舟生物提供的Myco-PCR-Mix 支原体检测试剂盒进行支原体检测。

1.PCR反应

取200μl HCS1220细胞培养2-3天的新鲜培养物上清至灭菌1.5ml离心管中， 95℃保温5min，离心5s；在PCR管中将待检测样品上清液2μl加入到18μl Myco-PCR-Mix中，并以Positive control模板2μl加入到18μl Myco-PCR-Mix中作为阳性对照，Negative control模板2μl加入到18μl Myco-PCR-Mix中作为阴性对照，Internal control模板2μl加入到18μl Myco-PCR-Mix中作为内标对照。

PCR程序为：95℃ 5min，1个循环；95℃ 30s，55℃ 45s，72℃ 45s，36 个循环；72℃ 5min，10℃保存。

2.凝胶电泳

1.2％琼脂糖凝胶电泳，TBE缓冲液，PCR产物及Maker均点样5μl，50V 下电泳1h，核酸染料染色15min。

如图3所示，阴性对照管PCR产物无带，内标对照管在191bp处有一条带，阳性对照管在278bp处有一条带，证明本次实验准确可靠。样品检测管中均只有一条与内标检测管相同位置的条带，说明样品检测管PCR反应未受到抑制，样品HCS1220细胞检测结果为支原体阴性。

实施例5：HCS1220细胞免疫缺陷小鼠成瘤实验

1.用0.25％的胰酶将处于对数生长期的HCS1220细胞消化打散后，用细胞计数仪计数，然后950rpm离心3min，弃上清。

2.用适量PBS重悬细胞，制成1×10⁶/ml的细胞悬液，备用。

3.3-4周龄BALB/c裸鼠，购自上海斯莱克公司。实验过程中，裸鼠饲养于局部100级净化饲养柜中，自由进水、进食。细胞接种在局部100级净化工作台中进行，每只BALB/c裸鼠腹股沟皮下接种0.2ml细胞悬液，共4只，接种后第7天开始观察成瘤情况。

3周后4只裸鼠腹股沟全部出现肿块，成瘤率为100％且部分瘤体浸润肌层。将肿瘤取出，如图4所示，肉眼观察肿瘤块有明显的血供和包膜。良好的成瘤性为药物的体内实验提供了重要的保证。

实施例6：种植瘤病理学鉴定

临床手术标本镜下观察，肿瘤组织细胞异性型明显，胞核大，深染，核浆比例大，周围被间质细胞包围，形成大量腺管样结构(图5)；裸鼠种植瘤标本镜下观察，细胞异性型明显，细胞生长旺盛，细胞核增大深染(图6)。其临床病理诊断均为粘液腺癌，符合结肠癌的病理学特征。

实施例7：肿瘤标志物检测

对HCS-1220细胞株裸鼠种植瘤进行免疫组化鉴定，包括结肠癌标志物 CK20、CDX2，肝细胞癌标志物AFP、hep-1、glypican-3的测定，具体方法如下：

1.石蜡切片脱蜡至水，3％H₂O₂室温孵育5-10min，以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min×2次。

4.5-10％正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10min，倾去血清，勿洗；滴加一抗工作液，4℃过夜。

5.PBS冲洗，5min×3次。

6.滴加适量生物素标记二抗工作液，37℃孵育10-30min。

7.PBS冲洗，5min×3次。

8.滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育 10-30min。

9.PBS冲洗，5min×3次。

10.显色剂显色3-15min(DAB或NBT/BCIP)。

11.自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。

如图7-11所示，对种植瘤细胞进行免疫组化鉴定，包括结肠癌标志物CK20、 CDX2，肝细胞癌标志物AFP、hep-1、glypican-3的测定，结果显示：肝细胞癌标志物AFP、hep-1、glypican-3呈阴性，结肠癌标志物CK20、CDX2呈现阳性结果，因此可以明确种植瘤细胞来源于肠组织。

综上所述，根据建系标准，HCS1220细胞株具有人原代结肠癌肝转移肿瘤细胞的特性，符合建系标准，是一株新建的人结肠癌肝转移肿瘤细胞系，可作为结肠癌肝转移发病机制及个体化治疗体外研究的细胞材料，进而为建立转移性结肠癌发生机理模型及制备、筛选、评价抗肿瘤药物提供基础。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅限制于本文所示的实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干修改和润饰也应视为本发明的保护范围。