NGN2介导成年鼠嗅鞘细胞直接重编程为神经元的方法及其应用与流程

技术特征：

1.NGN2介导成年鼠嗅鞘细胞直接重编程为功能性神经元的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、成年小鼠OECs原代培养

成年小鼠鼻中隔两侧的粘膜以及鼻甲表面粘膜放入4℃的解剖液中，在显微镜下剥离粘膜外边的薄膜，剪碎，或取成年小鼠嗅球的嗅神经层和嗅小球层部分剪碎；剪碎后，用0.25％的胰酶在37℃细胞培养箱中消化15min，加入DF12-15％FBS培养基终止消化，离心机800rpm离心4min后吸去上清，重新加入适量培养液后反复吹打单细胞悬液，然后种到不涂胶的T25培养瓶中；36h后将悬浮的细胞液移到新的不涂胶的T25培养瓶中，再过36h后，将没有贴壁的细胞悬液种在涂有0.1mg/ml L-型多聚赖氨酸的培养板上；随后在嗅鞘细胞的培养液中加入2uM的Forskolin和10ng/ml的bFGF；在细胞培养过程中每隔两天换一次液，一周左右即可传代，传代1～2次后用于细胞诱导；

B、NGN2质粒构建和慢病毒包装

利用PCR仪扩增含有NGN2的目的基因片段，反转录得到cDNA，将携带有人源性NGN2基因的cDNA片段构建到第三代慢病毒载体pCSC-SP-IRES-GFP上，获得pCSC-SP-PW-NGN2-IRES-GFP，简称为NGN2慢病毒质粒；病毒包装时，在DMEM中将NGN2慢病毒质粒与包装质粒pMDL，VSV-G，和pREV按照4：1：1：1混合，通过瞬时转染HEK293T细胞的方法产生出携带有NGN2-GFP基因的复制缺陷型慢病毒，在转染后第10-15h换成培养HEK293T细胞的培液，之后在第24h收集一次病毒上清，在第48h收集第二次病毒上清，将两次收集的病毒液混合离心，经滤器过滤后可直接用于感染OECs；

C、OECs重编程为神经元

将OECs传代后种在铺有PLL及基质胶的细胞培养板上或者细胞玻片上，待细胞完全贴壁后培养2-3天，将离心纯化后的慢病毒添加6μg/ml聚凝胺polybrene之后加入到培养孔板中感染OECs，10-12h后换成OECs培养液，待细胞感染病毒约48h后换成神经元诱导培养基，在此诱导培养基中含有DMEM/DF12、Neurobasal溶液、0.8％N-2、0.4％B27、Forskolin 2uM、BMP通路抑制剂Dorsomorphin 1μM、成纤维细胞生长因子10ng/ml及1％青链霉素，每隔一天更换一次培养基。

2.根据权利要求1所述的NGN2介导成年鼠嗅鞘细胞直接重编程为功能性神经元的方法，其特征在于，所述的成年小鼠取自成年C57/BL6J小鼠。

3.一种采用如权利要求1或2所述的方法从成年小鼠OECs重编程得到的神经元样细胞。

4.一种采用如权利要求3所述的从成年小鼠OECs重编程得到的神经元样细胞在制备治疗脊髓损伤的药物中的应用。