本发明属于甘薯生物活性物质提取技术领域，具体涉及一种响应面法优化超声波-微波协同提取甘薯渣中DHEA的方法。
背景技术：
甘薯是我国主要的农作物之一，种植面积大，约占世界甘薯种植总量的75.3％。甘薯别名甜薯、地瓜、番薯、红薯、白薯，不仅含有丰富的膳食纤维、糖、维生素、矿物质等人体必需营养成分，还含有许多活性功能性物质，如多糖、酚类化合物等，不仅能预防肥胖而且还有助于防三高、防癌和抗癌等，具有较高的营养价值和保健功能。我国甘薯大部分用于生产甘薯淀粉和甘薯粉条，因此薯渣是甘薯产品加工的副产物，约占原料的10％～14％，甘薯渣中含有丰富的营养物质和活性物质，而长期以来，我国把薯渣主要作为畜禽饲料，而对其营养成分活性成分没有进行充分利用，不仅造成资源浪费，而且为环境增添负担。美国生物学家阿塞唯兹从甘薯中分离出一种名叫“去氢表雄酮”的活性物质。去氢表雄酮(Dehydroepiandrosterone，DHEA)是一种甾体物质，它以硫酸酯(DHEA-S)的形式参与人体血液循环，在相关外周组织中转化为雄激素或雌激素发挥间接生物学效应。近年国内外的专家学者对DHEA进行了大量的临床试验，证明DHEA的主要用途不止限于作为甾体激素类药物的中间体，其在免疫、抗肿瘤、改善记忆力、抗衰老、生理代谢、骨质、改善性功能、修复免疫系统、平衡机体内激素、调节以及控制胰岛素分泌等方面起着至关重要的作用。
超声波-微波协同提取新技术充分运用超声波振动过程中产生的空化效应和微波产生的热效应，集超声波微波两者优势于一体。克服了单独使用超声波或微波提取之不足，对甘薯渣中目标成分DHEA的快速、高效提取。
技术实现要素：
本发明的目的是构建超声波-微波提取甘薯渣中活性物质DHEA模型，为提高甘薯加工副产物附加值及甘薯生物活性物质工业化生产提供参考和依据。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种响应面法优化超声波-微波协同提取甘薯渣中DHEA的方法，该方法包括以下步骤：
(1)DHEA提取与检测
①将甘薯渣清洗去杂后在45℃下烘干，磨粉，取100g甘薯渣粉加200mL水后静置24小时使甘薯渣粉充分吸水；②向充分吸水后的甘薯渣粉中加入30mL甲醇丙酮混合液，混合后进行超声波-微波协同萃取，提取时间30min、微波功率为300W、提取温度25℃；③过滤，滤液真空冷冻干燥，用10mL甲醇超声波洗脱后加入到100mL pH 4.6的0.05mol/L醋酸钠缓冲溶液(制备方法为：25.5mL0.2mol/L的醋酸溶液和24.5mL0.2mol/L的醋酸钠溶液混合后缓冲溶液稀释至0.05mol/L)中，用二氯甲烷萃取，向萃取液中加入30mLpH 9.8的0.05mol/L碳酸钠缓冲溶液(制备方法为0.1mol/L的碳酸钠溶液4mL，0.1mol/L的碳酸氢钠溶液6mL，混合后缓冲溶液稀释至0.05mol/L)，去水层，无水硫酸钠脱水，真空冷冻干燥，5mL色谱甲醇洗脱，HPLC定量分析；
(2)实验设计与统计分析
改变甘薯渣粉与甲醇丙酮混合液的料液比1:0.15～0.35(g/mL)，超声波-微波协同萃取的提取时间10～50min、提取温度20～40℃、微波功率为100～500W，进行单因素实验，测定DHEA提取量；根据单因素试验结果，选取DHEA提取量影响较显著的料液比、提取时间、提取温度、微波功率这四个因素，并对其进行实验因素与水平的设定，然后进行实验；
(3)模型的建立和统计分析
根据所得数据进行多元回归分析，得到响应变量料液比A、提取时间C、提取温度D、微波功率B与响应值DHEA提取量Y的二次多项回归方程：
Y＝115.94-11.67A+14.68B-7.21C-1.87D+9.34AB+8.91AC-0.29AD+2.17BC+4.15BD-0.072CD-31.68A2-8.93B2-30.67C2-27.77D2；
(4)试验结果分析与优化
根据回归方程进行绘图分析，得到回归方程的响应面三维图，响应值由此得到优化，根据模型分析可得到料液比、提取时间、提取温度和微波功率的最优化工艺参数。
HPLC定量分析具体方法为：Diamonsil C18柱(5μm，250mm×4.6mm)；检测波长218nm；流速0.6mL/min；柱温25℃；进样量20μL；流动相A(100％色谱甲醇)和流动相B(超纯水)；样品峰保留时间与标准品保留时间进行对比，按照峰面积计算DHEA含量，结果以(μg/100g)甘薯渣干粉计。
本发明以单因素试验为基础，设计方案采用Box-Benhnken中心组合进行4因素3水平试验。经回归分析得出各因素对DHEA的提取主次关系为：微波功率>液料比>提取时间>提取温度；超声-微波协同提取法提取DHEA的最佳工艺参数：料液比1：25，微波功率300W，提取时间30min，提取温度30℃。在最佳工艺条件下，进行3次重复试验，取平均值得DHEA提取量为117.25μg/100g，与理论预测值119.70μg/100g非常接近，证明了响应面优化DHEA提取工艺参数的准确性和有效性，表明构建超声波-微波提取甘薯渣中活性物质DHEA模型与实际拟合相当可靠，不仅促进农副产品的综合利用，还为提取天然DHEA提供理论和实践依据。
附图说明
图1为DHEA标准曲线；
图2为DHEA对照品及甘薯渣中提取DHEA样品HPLC图；
图3为料液比对DHEA提取量的影响；
图4.微波功率对DHEA提取量的影响；
图5为提取时间对DHEA提取量的影响；
图6为提取温度对DHEA提取量的影响；
图7两因素交互作用的响应面图和等高线图；a为微波功率和料液比，b为提取时间和料液比，c为提取温度和料液比，d为提取时间和微波效率，e为提取温度和微波功率，f为提取温度和提取时间。
具体实施方式
材料与方法
1.1试验与试剂
DHEA：叶源生物公司；甲醇、色谱甲醇、丙酮、二氯甲烷、无水硫酸钠、醋酸钠、碳酸钠其余化学试剂均为国产分析纯。
1.2仪器与设备
CW-2000型超声波-微波协同萃取仪：上海新拓分析仪器科技有限公司；TU-1810型紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；101型电热鼓风干燥箱：北京市永光明医疗器械厂；DFD-100型恒温震荡水浴锅：德国；Agilent1260高效液相色谱仪：德国。
1.3方法
1.3.1 DHEA高效液相分析
采用HPLC方法对DHEA进行定性定量分析，具体方法为：Diamonsil C18柱(5μm，250mm×4.6mm)；检测波长218nm；流速0.6mL/min；柱温25℃；进样量20μL；流动相A(100％色谱甲醇)和流动相B(超纯水)。样品峰保留时间与标准品保留时间进行对比，按照峰面积计算DHEA含量，结果以(μg/100g)甘薯渣干粉计。
1.3.2甘薯渣中DHEA标准曲线绘制
DHEA标准液的配置：称取标准样DHEA 20mg，用色谱甲醇溶解并定容至20mL，标准贮备液浓度为1000μg/mL。精密量取标准贮备液2、4、6、8、10mL置于5个10mL容量瓶中，用色谱甲醇稀释定容至10mL，振荡摇匀，配置好的溶液浓度分别为200、400、600、800、1000μg/mL，进样量20μL。
1.3.3 DHEA的提取
DHEA的提取方法如下：甘薯渣→清洗去杂45℃烘干→磨粉→取100g渣粉加水200mL水后静置24小时→以6:4的比例向萃取后的甘薯渣中加入30mL甲醇丙酮混合液(甲醇与丙酮的体积比为6:4)→超声波-微波协同萃取→过滤→滤液真空冷冻干燥→用10mL甲醇超声波洗脱→加100mLpH 4.6醋酸钠缓冲溶液→加二氯甲烷萃取(萃取3次，每次间隔30min，每次加入量为25mL)→萃取液加30mL pH 9.8碳酸钠缓冲溶液→去水层→无水硫酸钠脱水→真空冷冻干燥→5mL色谱甲醇洗脱→HPLC定量分析。
甘薯渣中DHEA含量计算公式：
式中：X：样品中DHEA含量(μg/100g)；S1：样品峰面积；S2：标准峰面积；C：标准品溶液浓度(μg/uL)；V：样品定容体积(μL)；M：试样质量(g)。
1.3.4单因素实验
1.3.4.1料液比对DHEA提取量的影响
称取5份100g甘薯渣，在提取时间为30min、微波功率为400W、提取温度为25℃前提下，分别以料液比1:15、1:20、1:25、1:30、1:35(所述料液比为甘薯渣干粉与甲醇丙酮混合液的比例，g/mL％，)提取DHEA，考察料液比对DHEA提取量的影响。
1.3.4.2微波功率对DHEA提取量的影响
称取5份100g甘薯渣，在料液比为1:30、提取时间为30min、提取温度25℃前提下，分别设定微波功率为100、200、300、400、500W提取DHEA，考察微波功率对DHEA提取量的影响。
1.3.4.3提取时间对DHEA提取量的影响
称取5份100g甘薯渣，在料液比为1:30、微波功率为400W、提取温度25℃前提下分别以提取时间为10、20、30、40、50min提取DHEA，考察提取时间对DHEA提取量的影响。
1.3.4.4提取温度对DHEA提取的影响
称取5份100g甘薯渣在保持料液比为1:30、提取时间为30min、微波功率为400W前提下分别设定温度为20、25、30、35、40℃提取DHEA，考察提取温度对DHEA提取量的影响。
1.3.5响应面实验设计
表1响应面分析因素和水平表
响应面分析法是利用多元二次回归方程拟合因素与响应值间的函数关系，依据回归方程分析结果来寻求最佳的工艺参数。此次实验考察料液比、微波功率、提取时间、提取温度对DHEA提取量的影响，根据回归方程分析结果确定每个影响因素的最适范围，以DHEA的提取量为响应值作响应面分析图，通过响应优化分析得出最佳提取工艺条件。
1.4统计分析
试验中涉及的每组试验均重复三次，所得数据以平均值±标准差表示。所得试验数据使用Design Expert 8.0软件统计分析，利用Orgin8.0作图。
结果与分析
2.1标准曲线绘制
标准曲线如图1所示，横纵坐标为标准品的浓度X(μg/mL)，纵坐标为峰面积值Y(mAU)绘制标准曲线，得出该色谱条件下的线性回归方程为Y＝98.733X-874.89，R2＝0.9992，线性范围为0.010～1.0，最低检测限为0.06μg/mL(以信噪比为3计算)。
2.2HPLC测定甘薯中DHEA含量
选用Diamonsil C18柱(5μm，250mm×4.6mm)；流动相A(100％色谱甲醇)和流动相B(超纯水)；检测波长218nm；流速0.6mL/min；柱温25℃；进样量20μL；对照品及样品的HPLC色谱图，见图2。
2.2单因素试验结果
2.2.1料液比对DHEA提取量的影响
料液比对DHEA提取量的影响如图3所示，由图3可知，甘薯渣中DHEA提取量随料液比的增加而增加，在1：30时基本达到最高值(89.03±0.37)μg/100g，随着料液比的继续增加，在1：35时DHEA提取量基本保持平稳(89.03±0.26)μg/100g。这可能是因为料液比在1:30时溶剂与活性成分DHEA已达到饱和。故在超声波微波协同提取的条件下，合适的料液比有利于有效成分DHEA的溶解，继续加大提取溶剂量不仅增加成本造成资源浪费而且增大了后续目标成分分离提纯的工作量。响应面实验料液比水平应选择1:20、1:25、1:30。
2.2.2微波功率对DHEA提取量的影响
微波功率对DHEA提取量的影响如图4所示，由图4可知，DHEA提取量随微波功率的增大而增大，当微波功率为300W时DHEA提取量达到最大值(98.03±0.29)μg/100g，随着微波功率的增大DHEA提取量有所下降，在500W时下降至(72.34±0.23)μg/100g。可以初步推断，在适宜的范围内微波功率的增加，导致体系内温度升高，有利于目标成分的溶解，但继续增大微波功率，则会破坏目标成分DHEA的结构，致使目标成分的提取量下降。所以，响应面优化试验应选择微波功率范围为200W、300W、400W。
2.2.3提取时间对DHEA提取量的影响
提取时间对DHEA提取量的影响如图5所示，由图5可知，甘薯渣中DHEA提取量随提取时间增加而增加，在30min时达到最高值(91.31±0.34)μg/100g，在超声波微波协同萃取的作用下，极大的缩短了目标物质的提取时间。但30min后DHEA提取量随时间的增加呈现下降趋势，在50min时降低至(61.14±0.26)μg/100g，这可能由于有效成分DHEA结构遭到破坏，且时间过长会造成超声波微波协同提取设备的机械损伤。响应面优化试验应选择提取时间范围为20min、30min、40min。
2.2.4提取温度对DHEA提取量的影响
提取温度对DHEA提取量的影响如图6所示，由图6可知，随温度升高DHEA提取量随之增加，在30℃时达到最大值(93.87±0.19)μg/100g，但随着温度的继续升高DHEA提取量出现下降趋势，在40℃时下降至(78.65±0.19)μg/100g。这可能由于适当的温度范围内有利于目标成分的溶解，但目标成分热稳定差，一旦超出合适温度范围，容易破坏目标成分的结构。所以，响应面优化试验应选择提取温范围为25℃、30℃、35℃。
2.3响应面结果分析
2.3.1回归方程的建立和方差分析
以单因素实验结果为基础，采用Box-Benhnken设计四因素三水平实验方案进一步优化，所得实验数据如表2，并采用Design-Expert 8.0进行多元回归拟合，得到DHEA提取量对料液比、微波功率、提取时间、提取温度的二次多项回归方程为：
Y＝115.94-11.67A+14.68B-7.21C-1.87D+9.34AB+8.91AC-0.29AD+2.17BC+4.15BD-0.072CD-31.68A2-8.93B2-30.67C2-27.77D2。
表2响应面设计方案及结果
对回归模型进行方差分析及显著性检验分析，结果见表3。可知：该回归方程模型显著性极强(P＜0.0001)，失拟项P＝0.2614＞0.05不显著。相关系数R2＝0.9895，说明有98.95％的总体变异能够用该响应模型解释，而响应模型不能解释的变异仅有1.05％，表明回归模型具有高度相关性，能够用于超声波-微波协同提取甘薯渣中DHEA的理论预测。试验结果表明，一次项A、B、C；二次项A2、B2、C2、D2；交互项AB、AC对DHEA提取量影响均为极显著，交互项BD对DHEA提取量为显著，D、AD、BC对DHEA提取量影响为不显著。各影响因素对DHEA提取量的影响顺序依次是B(微波功率)＞A(液料比)＞C(提取时间)＞D(提取温度)。
表3回归模型方差分析及显著性检验
注：*表示差异显著(p<0.05)；**表示差异极显著(p<0.01)。
2.3.2两因子间交互作用分析
响应面分析如图7，在不同的提取条件下，DHEA提取量的响应灵敏度直接由曲面坡度凸起程度反映，若曲面坡度凸起不明显，则表明对于不同提取条件响应值不敏感，相反，明显凸起即敏感。图7是由响应值和实验影响因素构成的立体曲面图，表示料液比、微波功率、提取时间、提取温度中任意组合的两个因素保持不变另外两个因素对DHEA提取量的影响。
响应曲面法和等高线图是回归方程的图表解释法，考察料液比、微波功率、提取时间、提取温度四个影响因素两两组合的交互作用对甘薯渣中DHEA提取量的影响。从图7(a-f)的响应面的最高点和等值线可以看出，在所选的范围内存在极值，既响应面的最高点同时它也在等值线最小椭圆的范围内。响应曲面a、b、f表现为曲线较陡，等高线密集，与方差分析结果相一致。响应面立体图可以看出，当各因素从四周逐渐趋向中心点时，立体图中的曲面越凸，等高线也越密集即甘薯渣中DHEA提取量越大，说明存在最大响应值。通过Design-Expert 8.0.软件分析计算得出，当DHEA预测的响应值最大时，四个因素的最佳值为：料液比1：25，微波功率300W，提取时间30min，提取温度30℃，此时预测的DHEA提取量最大值为119.7μg/100g。
2.3.3.DHEA最佳提取条件的确定及验证
通过Design expert 8.0对响应面优化工艺参数结果分析得到最佳提取工艺：料液比1：25，微波功率300W，提取时间30min，提取温度30℃，此条件下模型给出的DHEA提取量预测值为119.70μg/100g。验证最佳提取工艺条件验证响应曲面法所得预测值的可靠性，在最佳提取工艺条件下进行重复试验3次，取平均值，得到DHEA提取量为117.25μg/100g。与理论预测值119.70μg/100g非常接近(p<0.05)。表明回归方程与实际拟合良好，此模型的准确性得以充分验证。
结论
以单因素试验为基础，设计方案采用Box-Benhnken中心组合进行4因素3水平试验。经回归分析得出各因素对DHEA的提取主次关系为：微波功率>液料比>提取时间>提取温度；超声-微波协同提取法提取DHEA的最佳工艺参数：料液比1：25，微波功率300W，提取时间30min，提取温度30℃。在最佳工艺条件下，进行3次重复试验，取平均值得DHEA提取量为117.25μg/100g，与理论预测值119.70μg/100g非常接近，证明了响应面优化DHEA提取工艺参数的准确性和有效性，表明构建超声波-微波提取甘薯渣中活性物质DHEA模型与实际拟合相当可靠，不仅促进农副产品的综合利用，还为提取天然DHEA提供理论和实践依据。