本发明涉及的是一种乌参多糖的制备方法，尤其是一种东海乌参来源新颖糖胺聚糖的制备方法，属于海洋生物技术领域。
背景技术：
随着研究的不断深入，新的多糖资源和生物功能被不断发现。从不同海洋生物中获得结构特异和活性丰富的海洋特征多糖，开发海洋糖类资源仍然是海洋糖类研究的重要方向。
对于海洋动物来源的多糖主要集中在虾蟹来源的壳聚糖和海参中的糖胺聚糖。海参糖胺聚糖是海参体壁的一类重要成分，其含量可占干参总有机物的6%以上，是由d-n-乙酰氨基半乳糖、d-葡萄糖醛酸和l-岩藻糖组成的分支杂多糖，是海参的主要活性成分，具有抗凝血，溶栓，神经保护和调节血脂等活性，已经开发成海参多糖口服液等产品，大大提高了海参的产值。对于海参多糖的研究主要集中于刺参，刺参市场认可度高，所以提取制备多糖口服液成本相对较高，而我国有20多种可食用海参，寻找刺参的替代种类用于制备活性丰富的海参多糖，不仅有助于海洋多糖类药物的开发利用，还能实现低值海参种类的高值化利用，促进捕捞和养殖业的发展。
东海乌参(学名:白肛海地瓜acaudinaleucoprocta),属于芋参目(molpiadida)尻参科(caudinidae),是我国20多种可供食用的海参之一,盛产于我国浙江沿海海域,资源丰富,其营养成份和口感与刺参相差不大,蛋白质含量高,氨基酸组成合理,脂肪酸含量低,是一种优质廉价的海参资源,因而常作为刺参的替代品。东海乌参生长于海底游泥上,体表分泌的粘液与含重金属沉积物的海底游泥牢固地结合,形成了致密坚硬的体表污坂层,常规的清洗方法难以去除,而且东海乌参腥味重,难去除,传统的脱腥方法严重影响东海乌参的整体形态,并且腥味去除的效果不好;致密的体表污据影响其蛋白质利用率,影响东海乌参的进一步发利用。
以往由于缺乏精加工等关键技术，大多数情况下，东海乌参捕捞后被作为废弃物丢弃。舟山水产品加工企业通过生物酶解技术脱去海参表皮，快速低温保藏了海参的营养成分，实现了海参加工的产业化，而对其海参多糖的研究将进一步促进东海乌参变废为宝，提高产值，实现高值化利用。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种制备方法简单、可靠，乌参来源广，能够丰富海洋多糖资源，能推进丰富海洋动物资源为基础的海洋多糖生物医药发展的乌参多糖的制备方法。
本发明的目的是通过如下技术方案来完成的，一种乌参多糖的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：
a）剥掉外皮的东海乌参，剪碎后经2倍体积丙酮反复脱脂至少2次，将脱脂完全后的乌参置于干燥箱中40-50℃烘干；
b）取干燥后的鱼鳔经粉碎机粉碎过100目筛后置于烧杯中，并加入20倍体积的1mkoh溶液，碱解1.5-2.5h；
c）然后，先用冰醋酸调节ph至4-5后加入4%胃蛋白酶，35-40℃下提取1.5-2.5h后再用0.1mnaoh调节ph至7.8-8.2后加入4%胰蛋白酶，35-40℃下提取1.5-2.5h，最后用冰醋酸调回至中性，再升温至75-85℃提取，0.5-1.5h将酶灭活；
d）将得到的水提物于7500-8500r/min高速离心机离心15-25min后留上清液；残渣按上述提取方法再重复提取一次；
e）合并两次所得上清液，经45-55℃旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/10，加入4倍体积无水乙醇醇沉过夜,然后醇沉物再经过sevege法反复脱除蛋白，经透析袋流水透析68-75h后，冷冻干燥即得淡黄色粉末状乌参粗多糖。
作为优选：所述的制备方法包括如下步骤：
a）剥掉外皮的东海乌参，剪碎后经2倍体积丙酮反复脱脂3次，将脱脂完全后的乌参置于干燥箱中45℃烘干；
b）取干燥后的鱼鳔30g经粉碎机粉碎过100目筛后置于烧杯中，并加入20倍体积的1mkoh溶液，碱解2h；
c）然后，先用冰醋酸调节ph至4.5后加入4%胃蛋白酶，37℃下提取2h后再用0.1mnaoh调节ph至8后加入4%胰蛋白酶，37℃下提取2h，最后用冰醋酸调回至中性，再升温至80℃提取1h将酶灭活；
d）将得到的水提物于8000r/min高速离心机离心20min后留上清液；残渣按上述提取方法再重复提取一次；
e）合并两次所得上清液，经50℃旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/10，加入4倍体积无水乙醇醇沉过夜,然后醇沉物再经过sevege法反复脱除蛋白，经透析袋截留分子量3500da、流水透析72h后，冷冻干燥即得2.5g淡黄色粉末状乌参粗多糖。
作为优选进一步的制备方法是：所述乌参粗多糖通过使用q-sepharosefastflow阴离子交换色谱柱（2.6×50cm）进行梯度洗脱，确定分段洗脱适宜的nacl浓度分别为0和2mol/l，两个多糖组分分别命名为w0，w2；将所得的各多糖组分透析，浓缩，冻干，w2即为所得组分。
海参来源的多糖具有独特的分子结构和丰富的活性，以乌参为原料采用酶解的方法，结合凝胶纯化的方法得到具有全新结构的糖胺聚糖，丰富了海洋多糖资，并建立以ms为主要手段快速分析该类多糖结构的方法，实现海洋糖胺聚糖的质量控制。
本发明具有制备方法简单、可靠，乌参来源广，能够丰富海洋多糖资源，能推进丰富海洋动物资源为基础的海洋多糖生物医药发展等特点。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明作详细的介绍：本发明所述的一种乌参多糖的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：
a）剥掉外皮的东海乌参，剪碎后经2倍体积丙酮反复脱脂至少2次，将脱脂完全后的乌参置于干燥箱中40-50℃烘干；
b）取干燥后的鱼鳔经粉碎机粉碎过100目筛后置于烧杯中，并加入20倍体积的1mkoh溶液，碱解1.5-2.5h；
c）然后，先用冰醋酸调节ph至4-5后加入4%胃蛋白酶，35-40℃下提取1.5-2.5h后再用0.1mnaoh调节ph至7.8-8.2后加入4%胰蛋白酶，35-40℃下提取1.5-2.5h，最后用冰醋酸调回至中性，再升温至75-85℃提取，0.5-1.5h将酶灭活；
d）将得到的水提物于7500-8500r/min高速离心机离心15-25min后留上清液；残渣按上述提取方法再重复提取一次；
e）合并两次所得上清液，经45-55℃旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/10，加入4倍体积无水乙醇醇沉过夜,然后醇沉物再经过sevege法反复脱除蛋白，经透析袋流水透析68-75h后，冷冻干燥即得淡黄色粉末状乌参粗多糖。
所述乌参粗多糖通过使用q-sepharosefastflow阴离子交换色谱柱（2.6×50cm）进行梯度洗脱，确定分段洗脱适宜的nacl浓度分别为0和2mol/l，两个多糖组分分别命名为w0，w2；将所得的各多糖组分透析，浓缩，冻干，w2即为所得组分。
实施例1：本发明所述的制备方法包括如下步骤：
a）剥掉外皮的东海乌参，剪碎后经2倍体积丙酮反复脱脂3次，将脱脂完全后的乌参置于干燥箱中45℃烘干；
b）取干燥后的鱼鳔30g经粉碎机粉碎过100目筛后置于烧杯中，并加入20倍体积的1mkoh溶液，碱解2h；
c）然后，先用冰醋酸调节ph至4.5后加入4%胃蛋白酶，37℃下提取2h后再用0.1mnaoh调节ph至8后加入4%胰蛋白酶，37℃下提取2h，最后用冰醋酸调回至中性，再升温至80℃提取1h将酶灭活；
d）将得到的水提物于8000r/min高速离心机离心20min后留上清液；残渣按上述提取方法再重复提取一次；
e）合并两次所得上清液，经50℃旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/10，加入4倍体积无水乙醇醇沉过夜,然后醇沉物再经过sevege法反复脱除蛋白，经透析袋截留分子量3500da、流水透析72h后，冷冻干燥即得2.5g淡黄色粉末状乌参粗多糖。
实施例2：本发明所述的一种乌参多糖的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：
a）剥掉外皮的东海乌参，剪碎后经2倍体积丙酮反复脱脂2次，将脱脂完全后的乌参置于干燥箱中40℃烘干；
b）取干燥后的鱼鳔经粉碎机粉碎过100目筛后置于烧杯中，并加入20倍体积的1mkoh溶液，碱解1.5h；
c）然后，先用冰醋酸调节ph至4后加入4%胃蛋白酶，35℃下提取1.5h后再用0.1mnaoh调节ph至7.8后加入4%胰蛋白酶，35℃下提取1.5h，最后用冰醋酸调回至中性，再升温至75℃提取，0.5h将酶灭活；
d）将得到的水提物于7500r/min高速离心机离心15min后留上清液；残渣按上述提取方法再重复提取一次；
e）合并两次所得上清液，经45℃旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/10，加入4倍体积无水乙醇醇沉过夜,然后醇沉物再经过sevege法反复脱除蛋白，经透析袋流水透析68h后，冷冻干燥即得淡黄色粉末状乌参粗多糖。
实施例3：本发明所述的一种乌参多糖的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：
a）剥掉外皮的东海乌参，剪碎后经2倍体积丙酮反复脱脂4次，将脱脂完全后的乌参置于干燥箱中50℃烘干；
b）取干燥后的鱼鳔经粉碎机粉碎过100目筛后置于烧杯中，并加入20倍体积的1mkoh溶液，碱解2.5h；
c）然后，先用冰醋酸调节ph至5后加入4%胃蛋白酶，40℃下提取2.5h后再用0.1mnaoh调节ph至8.2后加入4%胰蛋白酶，40℃下提取2.5h，最后用冰醋酸调回至中性，再升温至85℃提取，1.5h将酶灭活；
d）将得到的水提物于8500r/min高速离心机离心25min后留上清液；残渣按上述提取方法再重复提取一次；
e）合并两次所得上清液，经55℃旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/10，加入4倍体积无水乙醇醇沉过夜,然后醇沉物再经过sevege法反复脱除蛋白，经透析袋流水透析75h后，冷冻干燥即得淡黄色粉末状乌参粗多糖。
本发明采用阴离子交换柱层析（q-sepharosefastflow）和凝胶渗透柱层析的分离纯化方法获得纯度较高的乌参多糖，并对其进行单糖组成，分子量，硫酸基含量，氨基糖含量和糖醛酸含量在内的理化性质测定。