控制培养箱适于免疫细胞的诱导扩增的方法与流程

本发明涉及生物领域，具体地，本发明涉及控制培养箱适于免疫细胞的诱导扩增的方法。
背景技术：
：细胞免疫治疗疗法，是采集人体自身免疫细胞，经过体外培养，使其数量成千倍增多，靶向性杀伤功能增强，然后再回输到人体来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力，兼顾治疗和保健的双重功效。然而现有技术中，将获得的人体自身免疫细胞经过体外培养存在扩增效率低、免疫细胞均一性差，回输到患者体内，致瘤几率大的问题。细胞免疫治疗疗法的应用受到限制。因此，如何进一步有效提高免疫细胞的扩增效率、提高扩增后免疫细胞的均一性以及将致瘤风险降到最低，是科研工作者拭待解决的关键问题。技术实现要素：本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种控制培养箱适于免疫细胞的诱导扩增的方法。根据本发明的实施例，所述培养箱包括箱体，所述箱体中限定出培养空间；氧气源，所述氧气源与所述箱体相连用于向所述培养空间中供给氧气；二氧化碳源，所述二氧化碳源与所述箱体相连用于向所述培养空间中供给二氧化碳；氧气浓度传感器，所述氧气浓度传感器设置在所述箱体内壁上用于检测所述培养空间中的氧气浓度；二氧化碳浓度传感器，所述二氧化碳浓度传感器设置在所述箱体内壁上用于检测所述培养空间中的二氧化碳浓度；控制器，所述控制器设置在所述箱体上并且分别与所述氧气源、所述氧气浓度传感器、所述二氧化碳源和所述二氧化碳浓度传感器相连，用于基于所述氧气浓度传感器和所述二氧化碳浓度传感器的数据控制所述氧气源和所述二氧化碳源，所述方法包括：所述控制器启动所述氧气源和所述二氧化碳源向所述培养空间中供给氧气和二氧化碳；所述控制器启动所述氧气浓度传感器和所述二氧化碳浓度传感器，并获取包括所述空间中氧气浓度和二氧化碳浓度的数据；在将单个核细胞接种到生物反应器时，所述控制器启动计时；所述计时在第1天至第9天期间时，当所述氧气浓度超过10％时，所述控制器关闭所述氧气源，当所述氧气浓度低于8％时，所述控制器启动所述氧气源向所述培养空间中供给氧气，当所述二氧化碳浓度超过7％时，所述控制器关闭所述二氧化碳源，当所述二氧化碳浓度低于2％时，所述控制器启动所述二氧化碳源向所述培养空间中供给二氧化碳；所述计时在第10天至第22天期间时，当所述氧气浓度超过18％时，所述控制器关闭所述氧气源，当所述氧气浓度低于12％时，所述控制器启动所述氧气源向所述培养空间中供给氧气，当所述二氧化碳浓度超过7％时，所述控制器关闭所述二氧化碳源，当所述二氧化碳浓度低于2％时，所述控制器启动所述二氧化碳源向所述培养空间中供给二氧化碳。利用根据本发明实施例的上述控制培养箱适于免疫细胞的诱导扩增的方法，所获得的免疫细胞的扩增效率大幅提高，其培养12天后，免疫细胞可扩增120倍以上，培养14天后，免疫细胞可扩增200倍以上；并且所获得免疫细胞中的nk细胞的比例大幅提高，可提高到94％以上，以此同时，t淋巴细胞、辅助性t细胞和细胞毒性t细胞的比例大幅下降，b淋巴细胞基本消失，所获得的免疫细胞的均一性显著提高；并且免疫细胞的致瘤风险为零。根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本发明的实施例，在将单个核细胞接种到生物反应器中，计时培养的第1天，所述单个核细胞处于第一培养基中，所述第一培养基为包含10％自体血浆、1000iu/mlil-2以及0.01ke/ml沙培林的t细胞扩增培养基；计时培养的第2～9天，所述单个核细胞处于第二培养基中，所述第二培养基为包含10％自体血浆以及1000iu/mlil-2的t细胞扩增培养基或包含1000iu/mlil-2的t细胞扩增培养基；计时培养的第10～22天，所述单个核细胞处于第三培养基中，所述第三培养基为包含1000iu/mlil-2的superculturetml500培养基。所获得的免疫细胞的扩增效率进一步提高。根据本发明的实施例，将单个核细胞接种到生物反应器中并计时培养13～15天，以便获得所述免疫细胞。进而所获得的的免疫细胞的活性更高、致瘤风险进一步降到最低。根据本发明的实施例，在计时培养的第15天，将经过14天计时培养的单个核细胞进行回收和重悬处理，以便获得所述免疫细胞，所述重悬处理是在含有5％人血清白蛋白的生理盐水中进行的。进而可将所获得免疫细胞进行病原体检测，病原体检测合格的免疫细胞可进一步回输到患者体内进行免疫治疗，免疫治疗的风险进一步降低。根据本发明的实施例，在将单个核细胞接种到生物反应器中的第1天至第9天，所述控制器将所述培养空间中的co2浓度控制在2～7％，优选5％，所述控制器将所述培养空间中的o2浓度控制在8～10％；通过该阶段培养可大量扩增淋巴样干细胞。在将单个核细胞接种到生物反应器中的第10天至第22天，所述控制器将所述培养空间中的o2浓度控制在12～18％，优选15％，所述控制器将所述培养空间中的co2浓度控制在2～7％，进而通过高氧条件，使前阶段扩增的淋巴样干细胞加速向nk细胞诱导分化。根据本发明的实施例，所述t细胞扩增培养基为optmizertmctstmt-cellexpansionsfm培养基。进而t细胞扩增效率进一步提高。根据本发明的实施例，所述il-2购自peprotech。根据本发明的实施例，所述单个核细胞来源于外周血。外周血单个核细胞取材方便。需要说明的是，外周血单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。根据本发明的实施例，外周血单核细胞是通过如下方式分离获得的：(1-1)将快检合格的外周血进行第一离心处理，所述离心处理是在2500rpm的条件下进行15min；(1-2)将经过第一离心处理获得的上层血浆进行第二离心处理，所述第二离心处理是在3500rpm的条件下进行15min,以便获得上清血浆和血细胞沉淀；(1-3)将所述上清血浆进行灭活和第三离心处理，以便去除补体，所述灭活处理是在温度为56℃的条件下进行30～50min，所述第三离心处理处理是在3500rpm的条件下进行15min；(1-4)将所述血细胞沉淀利用包含体积分数为50％的生理盐水进行重悬处理，并向重悬液中加入总体积1/3量的羟乙基淀粉；(1-5)将步骤(1-4)中所获得重悬液进行静置处理，以便沉降红细胞；(1-6)将步骤(1-5)所获得的上层重悬液进行第四离心处理，以便获得白细胞沉淀，所述第四离心处理是在1800rpm的条件下进行5min；(1-7)将所述白细胞沉淀利用生理盐水进行重悬处理，以便获得重悬液；(1-8)将步骤(1-7)所获得的重悬液等体积加入人外周血淋巴细胞分离液，并将所得混合液在2000rpm的条件下离心25min，以便获得中间云雾层白细胞；(1-9)将中间云雾层白细胞利用生理盐水洗涤2次，经过生理盐水洗涤的中间云雾层白细胞为所述单个核细胞。需要说明的是，一般意义上的白细胞包括粒细胞、单核细胞和淋巴细胞，而经过根据本发明实施例的上述方法分离获得中间云雾层白细胞包括淋巴细胞和单核细胞，即本申请所述的单个核细胞。利用根据本发明实施例的上述培养箱获得单个核细胞的成活率和细胞活性高，进而用于进一步的诱导扩增，免疫细胞的扩增效率、获得的免疫细胞的活性均会得到进一步提高。根据本发明的实施例，所述人外周血淋巴细胞分离液主要包括葡聚糖(右旋糖酐)和泛影酸葡甲胺。根据本发明的实施例，所述生物反应器中预先包被抗人cd61抗体是通过如下方式进行的：将包含2.5μg/ml抗人cd16单克隆抗体的生理盐水加入生物反应器中，并将所述生物反应器在4℃的条件下避光孵育过夜；依次利用生理盐水和所述t细胞扩增培养基将经过孵育处理的生物反应器进行洗涤处理。进而免疫细胞的诱导分化效率进一步提高，细胞的均一性也会进一步提高。在本发明第二方面，本发明提出了一种免疫细胞。根据本发明的实施例，所述免疫细胞是将单个核细胞在培养箱中进行诱导扩增获得的，所述培养箱如前面所限定的，所述培养箱是在前面所述的控制方法中运行的。根据本发明实施例的免疫细胞的活力高、均一性高(其中nk细胞的比例可达94％以上)、无致瘤风险。在本发明第三方面，本发明提出了白酒草皂苷s在免疫细胞诱导扩增中的应用。在本申请人的在先申请中，发现了白酒草皂苷r在免疫细胞冻存中具有有益的效果，本发明团队进一步研究发现，白酒草皂苷r在免疫细胞诱导扩增中，效果不是非常明显，但是和他接近的白酒草皂苷s却被发现有出乎预料的促进增殖，提高nk细胞的比例的技术效果。白酒草皂苷s：白色晶体(甲醇)，mp241～243℃，[α]20d-38.2°(c0.50,meoh)。hr-esi-msm/z:1523.6566(计算值1523.6518，[m+na]+)，相对分子质量较白酒草皂苷r高162，结合13c-nmr和dept谱确定其分子式为c68h108o36。白酒草皂苷s较白酒草皂苷r多了1组β-d-吡喃葡萄糖基的信号，白酒草皂苷s鉴定为3-o-β-d-glucopyranosyl-(1→3)-β-d-glucopyranosylmedicagenicacid28-o-β-d-apiofuranosyl-(1→3)-β-d-xylopyranosyl-(1→4)-[β-d-apiofuranosyl-(1→3)]-α-l-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-l-arabinopyranosylester.。其中，所述r基为glc。附图说明图1是根据本发明实施例的培养箱的结构示意图；图2是根据本发明实施例2的nk细胞培养14天，细胞生长状态的图片，其中a是20倍镜下的照片，b为100倍镜下的照片；图3是根据本发明实施例1的14天不同样本nk细胞扩增结果的统计图；以及图4是根据本发明实施例1的nk细胞培养14天，流式表型分析的结果图。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。为了方便理解，申请人将根据本发明的实施例的培养箱的结构示于图1，所述培养箱包括：箱体100，所述箱体100中限定出培养空间；氧气源200，所述氧气源200与所述箱体100相连用于向所述培养空间中供给氧气；二氧化碳源300，所述二氧化碳源300与所述箱体100相连用于向所述培养空间中供给二氧化碳；氧气浓度传感器400，所述氧气浓度传感器400设置在所述箱体100内壁上用于检测所述培养空间中的氧气浓度；二氧化碳浓度传感器500，所述二氧化碳浓度传感器500设置在所述箱体100内壁上用于检测所述培养空间中的二氧化碳浓度；控制器600，所述控制器600设置在所述箱体100上并且分别与所述氧气源200、所述氧气浓度传感器400、所述二氧化碳源300和所述二氧化碳浓度传感器500相连，用于基于所述氧气浓度传感器400和所述二氧化碳浓度传感器500的数据控制所述氧气源200和所述二氧化碳源300，其中，在将单个核细胞接种到生物反应器中的第1天至第9天，所述控制器将所述培养空间中的co2浓度控制在2～7％，优选5％，所述控制器将所述培养空间中的o2浓度控制在8～10％；在将单个核细胞接种到生物反应器中的第10天至第22天，所述控制器将所述培养空间中的o2浓度控制在12～18％，优选15％，所述控制器将所述培养空间中的co2浓度控制在2～7％。利用根据本发明实施例的上述免疫细胞的诱导扩增的培养箱，所获得的免疫细胞的扩增效率大幅提高，其培养12天后，免疫细胞可扩增120倍以上，培养14天后，免疫细胞可扩增200倍以上；并且所获得免疫细胞中的nk细胞的比例大幅提高，可提高到94％以上，以此同时，t淋巴细胞、辅助性t细胞和细胞毒性t细胞的比例大幅下降，b淋巴细胞基本消失，所获得的免疫细胞的均一性显著提高；并且免疫细胞的致瘤风险为零。实施例1下面将详细介绍利用根据本发发明实施例的培养箱，使得培养箱在根据本发明实施例的控制方法中运行，进行免疫细胞的诱导扩增的方法，该方法包括将分离的单个核细胞诱导扩增为免疫细胞，并检测免疫细胞的活性。一、实验方法1.准备抗人cd16包被的zellwerk生物反应器1.1在生物反应器中加入经医用生理盐水溶解的2.5μg/ml抗人cd16单克隆抗体15ml，轻轻晃动培养瓶使抗体铺满培养面，4℃避光过夜。1.2使用前回收抗体包被液，用15ml生理盐水洗涤生物反应器一次，再用15ml的t细胞扩增培养基(optmizertmctstmt-cellexpansionsfm)洗涤一次。2.采集外周血，分离外周血血浆和单个核细胞2.1用加入抗凝剂的无菌采血袋采集人外周血约100ml，预留1ml外周血做快检和血型鉴定，采血袋立即无菌封装，无菌4℃保存运输，准确记录采集信息。快检筛选合格后将外周血送入gmp实验室，若快检不合格，血样废弃处理。2.2在gmp实验室中取出血袋，酒精消毒采血袋，观察无凝血和溶血后在超净台中打开血袋，将血液转移到至50ml无菌离心管中(≤40ml/管)，2500rpm离心15min。2.3转移上层血浆到另一离无菌离心管中，3500rpm离心15min，收集上清血浆到新的无菌离心管中，用口膜密封离心管口，血细胞用于分离单个核细胞。2.4将血浆放到56℃水浴锅中水浴30-50min灭活补体，3500rpm离心15min去除补体，10ml每支分装到15ml无菌离心管中，-20℃冻存备用；并留取7.5ml血浆进行慢检：病毒五项、支原体、内毒素和微生物，其中病毒由第三方检测为准。2.5将步骤2中的血细胞沉淀用血浆等体积的生理盐水重悬后转移到250ml无菌玻璃瓶中，加入血液总体积1/3量的羟乙基淀粉，轻轻晃动盐水瓶使混合均匀，静置使红细胞沉降。2.6待红细胞层沉降分层后，将上层乳白色悬液轻轻吸取到无菌离心管，1800rpm离心5min，弃去上清，沉淀用10ml生理盐水重悬。2.7取无菌15ml离心管2支，各加入5ml常温人外周血淋巴细胞分离液，分别在上层轻轻加入各5ml细胞悬液。室温2000rpm慢升慢降离心25min。2.8轻轻取出离心管，小心吸取界面中间云雾层白细胞至新的15ml离心管中，补加生理盐水洗涤2次。2.91ml生理盐水重悬细胞，取5μl细胞加入到245μl生理盐水中稀释50倍，计数，并用台盼蓝染色计细胞存活率。实验结束的带血污物均经过配比过得新洁尔灭浸泡过夜才能丢弃。2.10预留4.5x106个细胞进行流式抗体标记检测nk细胞的比例；剩余的单个核细胞细胞接种到加有50ml培养基的生物反应器中，培养基配比为：45mloptmizertmctstmt-cellexpansionsfm培养基+5ml自体血浆(autologousplasma)+终浓度1000iu/mlpeprotechil-2+终浓度0.01ke/ml沙培林(ok432)，37℃，5％co2无菌培养，记为第0天。2.11每日观察细胞，并进行培养基更换，培养基配比为培养基配比为：optmizertmctstmt-cellexpansionsfm培养基+10％自体血浆(autologousplasma)+终浓度1000iu/mlpeprotechil-2。当自体血浆已经用完时，不再补加血浆，即optmizertmctstmt-cellexpansionsfm培养基+终浓度1000iu/mlpeprotechil-2。2.12当培养至第9天时，更换培养体系，即superculturetml500人淋巴细胞无血清培养基+终浓度1000iu/mlil-2，同时将氧气浓度提高到15％，每日观察细胞，并进行适当氧气浓度调整和培养基的更换。待14天时，进行细胞回收，留取10ml培养基上清进行elisa分泌因子检测。2.13将回收的细胞用200ml生理盐水重悬，并加入10ml人血清白蛋白，混匀；并从中取10ml细胞悬液待检，剩余的细胞注入回输袋中准备回输。从回输袋中抽取10ml细胞悬液进行检测：支原体、内毒素、微生物和病毒五项。3.流式细胞仪检测细胞中淋巴细胞谱系将取出的10ml细胞悬液，1800rpm离心回收细胞，进行流式抗体标记。设置同型对照、单标样品和染色管，每管样品细胞数约5×105个，然后加入对应抗体染色。4℃，30min放置，用生理盐水洗涤，然后上机检测分析淋巴细胞群中的nk细胞比例。4.将剩余10ml细胞悬液上清，进行分装，用以检测病毒五项、内毒素、支原体、微生物。5.裸鼠致瘤试验spf级雌性balb/c裸鼠，购于中国医学科学院实验动物研究所，4-6周龄，体重16-20g，于空气层流架中带盖鼠笼内饲养，饮用水、标准饲料及其它与动物接触品均经灭菌处理。取阳性对照ragi细胞和k562细胞及待检测的体外诱导分化的第21天的nk细胞按3×107个/0.2ml接种裸鼠肋部皮下，用苦味酸标记，为期2个月观察成瘤情况。6.将收细胞的培养基上清进行elisa分泌因子检测，即ifn-γ、tnf-α和perforin检测。二、实验结果1培养14天的实验结果1.1培养14天后细胞可扩增200倍所述取外周血淋巴细胞分离液分离后的6×107个外周血单个核细胞接种到20ml培养体系中，细胞很快进入对数生长阶段。培养14d后，培养体系扩大到4l，细胞数扩增到1.2×1010，扩增倍数在最高达200倍，活细胞数在90％以上。1.2扩增后的外周血单个核细胞中的nk细胞比例明显升高外周血单个核细胞经14天扩增后，淋巴细胞中的nk细胞比例(cd3-cd56+)由18.15％上升到95.27％，与此同时t淋巴细胞(cd3+)比例由72.15％下降到4.61％，辅助性t细胞(th,cd3+cd4+)和细胞毒性t细胞(tc,cd3+cd8a+)都有降低，b淋巴细胞(cd3-cd19+)基本消失，细胞均一性显著提高；结合细胞计数计算可知，培养14天后nk细胞扩增920倍，流式表型分析结果如图4所示。1.3培养扩增得到的细胞产品检测未发现病原体感染我们将培养后的细胞和细胞悬液委托检测平台检测了乙肝表面抗原、饼干抗原、人类免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体特异性抗体、巨噬细胞病毒以及支原体、细菌和内毒素，检测结果均呈阴性，说明该批次产品是安全的，培养过程中没有造成污染，结果详见表1。表1：培养14天后的nk细胞临床安全性检测2、培养12天的实验结果2.1培养12天后细胞可扩增120倍取外周血淋巴细胞分离液分离后的9×107个外周血单个核细胞接种到20ml培养体系中，细胞很快进入对数生长阶段。培养12d后，培养体系扩大到4l，细胞数扩增到1.08×1010，扩增倍数在达120倍，活细胞数在90％以上。2.2扩增后的外周血单个核细胞中的nk细胞比例明显升高外周血单个核细胞经12天扩增后，淋巴细胞中的nk细胞比例(cd3-cd56+)从第7天的29.87％上升到第12天的94.19％，与此同时t淋巴细胞(cd3+)比例下降到2.24％，辅助性t细胞(th,cd3+cd4+)和细胞毒性t细胞(tc,cd3+cd8a+)都有降低，b淋巴细胞(cd3-cd19+)基本消失，细胞均一性显著提高。2.3培养扩增得到的细胞产品检测未发现病原体感染我们将培养后的细胞和细胞悬液委托检测平台检测了乙肝表面抗原、饼干抗原、人类免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体特异性抗体、巨噬细胞病毒以及支原体、细菌和内毒素，检测结果均呈阴性，说明该批次产品是安全的，培养过程中没有造成污染，结果详见表2。表2：培养12天后的nk细胞临床安全性检测表3：培养基上清进行elisa检测实验1实验2ifn-γ1.68x105pg/ml1.75x105pg/mltnf-α63.1pg/ml50.75pg/mlperforin21ng/ml19.48ng/ml所培养的细胞均有ifn-γ、tnf-α、perforin的分泌。3.培养扩增后的nk细胞不会在体内形成肿瘤裸鼠致瘤实验，a生理盐水对照组(成瘤小鼠数/组内小鼠数，0/5)，braji细胞对照组(3/5)，ck562细胞对照组(4/5)，dnk细胞组(0/5)，即在2个月观察期内皮下注射0.2ml生理盐水组和3×107个/0.2ml培养21天的nk细胞组小鼠均未见肿瘤形成，注射形同体积的raji细胞和k562细胞的小鼠分别有3/5和4/5只小鼠形成了可见的肿瘤。该结果说明即使培养到21天，nk细胞依然是安全有效的，不会导致肿瘤的形成。实施例2一、实验方法1.准备抗人cd16包被的zellwerk生物反应器1.1在生物反应器中加入经医用生理盐水溶解的2.5μg/ml抗人cd16单克隆抗体15ml，轻轻晃动培养瓶使抗体铺满培养面，4℃避光过夜。1.2使用前回收抗体包被液，用15ml生理盐水洗涤生物反应器一次，再用15ml的t细胞扩增培养基(optmizertmctstmt-cellexpansionsfm)洗涤一次。2.采集外周血，分离外周血血浆和单个核细胞2.1用加入抗凝剂的无菌采血袋采集人外周血约100ml，预留1ml外周血做快检和血型鉴定，采血袋立即无菌封装，无菌4℃保存运输，准确记录采集信息。快检筛选合格后将外周血送入gmp实验室，若快检不合格，血样废弃处理。2.2在gmp实验室中取出血袋，酒精消毒采血袋，观察无凝血和溶血后在超净台中打开血袋，将血液转移到至50ml无菌离心管中(≤40ml/管)，2500rpm离心15min。2.3转移上层血浆到另一离无菌离心管中，3500rpm离心15min，收集上清血浆到新的无菌离心管中，用口膜密封离心管口，血细胞用于分离单个核细胞。2.4将血浆放到56℃水浴锅中水浴30-50min灭活补体，3500rpm离心15min去除补体，10ml每支分装到15ml无菌离心管中，-20℃冻存备用；并留取7.5ml血浆进行慢检：病毒五项、支原体、内毒素和微生物，其中病毒由第三方检测为准。2.5将步骤2中的血细胞沉淀用血浆等体积的生理盐水重悬后转移到250ml无菌玻璃瓶中，加入血液总体积1/3量的羟乙基淀粉，轻轻晃动盐水瓶使混合均匀，静置使红细胞沉降。2.6待红细胞层沉降分层后，将上层乳白色悬液轻轻吸取到无菌离心管，1800rpm离心5min，弃去上清，沉淀用10ml生理盐水重悬。2.7取无菌15ml离心管2支，各加入5ml常温人外周血淋巴细胞分离液，分别在上层轻轻加入各5ml细胞悬液。室温2000rpm慢升慢降离心25min。2.8轻轻取出离心管，小心吸取界面中间云雾层白细胞至新的15ml离心管中，补加生理盐水洗涤2次。2.91ml生理盐水重悬细胞，取5μl细胞加入到245μl生理盐水中稀释50倍，计数，并用台盼蓝染色计细胞存活率。实验结束的带血污物均经过配比过得新洁尔灭浸泡过夜才能丢弃。2.10预留4.5x106个细胞进行流式抗体标记检测nk细胞的比例；剩余的单个核细胞细胞接种到加有50ml培养基的生物反应器中，培养基配比为：45mloptmizertmctstmt-cellexpansionsfm培养基+5ml自体血浆(autologousplasma)+终浓度1000iu/mlpeprotechil-2+终浓度0.01ke/ml沙培林(ok432)，37℃，5％co2无菌培养，记为第0天。2.11每日观察细胞，并进行培养基更换，培养基配比为培养基配比为：optmizertmctstmt-cellexpansionsfm培养基+10％自体血浆(autologousplasma)+终浓度1000iu/mlpeprotechil-2。当自体血浆已经用完时，不再补加血浆，即optmizertmctstmt-cellexpansionsfm培养基+终浓度1000iu/mlpeprotechil-2。2.12当培养至第9天时，更换培养体系，即superculturetml500人淋巴细胞无血清培养基+终浓度1000iu/mlil-2+终浓度1mg/ml白酒草皂苷s，同时将氧气浓度提高到15％，每日观察细胞，并进行适当氧气浓度调整和培养基的更换。待14天时，进行细胞回收，留取10ml培养基上清进行elisa分泌因子检测。2.13将回收的细胞用200ml生理盐水重悬，并加入10ml人血清白蛋白，混匀；并从中取10ml细胞悬液待检，剩余的细胞注入回输袋中准备回输。从回输袋中抽取10ml细胞悬液进行检测：支原体、内毒素、微生物和病毒五项。3.流式细胞仪检测细胞中淋巴细胞谱系将取出的10ml细胞悬液，1800rpm离心回收细胞，进行流式抗体标记。设置同型对照、单标样品和染色管，每管样品细胞数约5×105个，然后加入对应抗体染色。4℃，30min放置，用生理盐水洗涤，然后上机检测分析淋巴细胞群中的nk细胞比例。4.将剩余10ml细胞悬液上清，进行分装，用以检测病毒五项、内毒素、支原体、微生物。5.裸鼠致瘤试验spf级雌性balb/c裸鼠，购于中国医学科学院实验动物研究所，4-6周龄，体重16-20g，于空气层流架中带盖鼠笼内饲养，饮用水、标准饲料及其它与动物接触品均经灭菌处理。取阳性对照ragi细胞和k562细胞及待检测的体外诱导分化的第21天的nk细胞按3×107个/0.2ml接种裸鼠肋部皮下，用苦味酸标记，为期2个月观察成瘤情况。6.将收细胞的培养基上清进行elisa分泌因子检测，即ifn-γ、tnf-α和perforin检测。二、实验结果1培养14天的实验结果1.1培养14天后细胞可扩增350倍所述取外周血淋巴细胞分离液分离后的6×107个外周血单个核细胞接种到20ml培养体系中，细胞很快进入对数生长阶段。培养14d后，培养体系扩大到4l，细胞数扩增到2.1×1010，扩增倍数在最高达350倍，活细胞数在95％以上。1.2扩增后的外周血单个核细胞中的nk细胞比例明显升高外周血单个核细胞经14天扩增后，淋巴细胞中的nk细胞比例(cd3-cd56+)由18.15％上升到98.37％，与此同时t淋巴细胞(cd3+)比例由72.15％下降到1.50％，辅助性t细胞(th,cd3+cd4+)和细胞毒性t细胞(tc,cd3+cd8a+)都有降低，b淋巴细胞(cd3-cd19+)基本消失，细胞均一性显著提高。1.3培养扩增得到的细胞产品检测未发现病原体感染我们将培养后的细胞和细胞悬液委托检测平台检测了乙肝表面抗原、饼干抗原、人类免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体特异性抗体、巨噬细胞病毒以及支原体、细菌和内毒素，检测结果均呈阴性，说明该批次产品是安全的，培养过程中没有造成污染，结果详见表4。表4：培养14天后的nk细胞临床安全性检测我们将培养后的细胞和细胞悬液委托检测平台检测了乙肝表面抗原、饼干抗原、人类免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体特异性抗体、巨噬细胞病毒以及支原体、细菌和内毒素，检测结果均呈阴性，说明该批次产品是安全的，培养过程中没有造成污染，结果详见表2。表5：培养12天后的nk细胞临床安全性检测表6：培养基上清进行elisa检测实验1实验2ifn-γ2.12x105pg/ml2.20x105pg/mltnf-α79.8pg/ml82.1pg/mlperforin32.01ng/ml29.61ng/ml所培养的细胞均有ifn-γ、tnf-α、perforin的分泌。培养扩增后的nk细胞不会在体内形成肿瘤裸鼠致瘤实验，a生理盐水对照组(成瘤小鼠数/组内小鼠数，0/5)，braji细胞对照组(3/5)，ck562细胞对照组(4/5)，dnk细胞组(0/5)，即在2个月观察期内皮下注射0.2ml生理盐水组和3×107个/0.2ml培养21天的nk细胞组小鼠均未见肿瘤形成，注射形同体积的raji细胞和k562细胞的小鼠分别有3/5和4/5只小鼠形成了可见的肿瘤。该结果说明即使培养到21天，nk细胞依然是安全有效的，不会导致肿瘤的形成。对比例：如果把白酒草皂苷s替换为白酒草皂苷r，培养14天后细胞可扩增200-210倍，和不加的时候相比，并没有显著性差异。这提示，glc基团在这个皂甙化合物中可能有比较重要的意义。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。当前第1页12