羊水细胞培养基、羊水细胞培养方法及培养基的应用与流程

本发明涉及细胞培养技术，特别涉及一种羊水细胞培养基、羊水细胞培养方法及培养基的应用。

背景技术：

中国是世界上的人口大国，也是出生缺陷和残疾高发国家。出生缺陷不仅是一个严重的公共卫生问题，而且已成为影响经济发展和人们正常生活的社会问题。出生缺陷和残疾不仅日益成为影响人口素质的重要问题，也给家庭和社会造成沉重的经济负担。出生前/产前诊断染色体核型分析是有效降低出生缺陷的最佳方法，目前国内各大医院已经开展羊水和绒毛的染色体核型分析技术。而羊水培养基的质量是决定培养成果的关键。目前临床应用的羊水细胞培养基几乎均为国外进口，中国目前尚缺乏质量上与其相当的培养基生产技术和能力。这不仅让人感到遗憾，也使相关医疗费用始终保持在较高的水平，成本较高，在一定程度上限制了产前诊断在出生缺陷防治中的应用。因而开发自主知识产权的绒毛、羊水培养基对于降低产前诊断成本，提高产前诊断率以及优生优育水平具有积极意义。

由于羊水中活细胞少，培养周期长，无菌要求高，稍不注意即致使培养失败。即使培养成功，因分裂相少，形态不佳，达不到分析要求，也无法进行进一步研究。因此，成功的羊水细胞培养，除需严格的实验操作技术和经验外，培养基的质量也是非常关键的。为了缩短羊水细胞培养周期，提高成功率，已有了一些改良型的培养基的研究报道。目前国内的多家产前诊断机构都使用进口德国amniopan羊水培养基和美国gibico羊水培养基，国内的湖南湘雅医基因技术有限公司、重庆和广州也有几家公司进行该项技术研究，但是技术还不够成熟，产品没有广泛应用到临床。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是：提供一种培养质量好的羊水细胞培养基、羊水细胞培养方法及培养基的应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

本发明提供了一种羊水细胞培养基，包括基础培养基，还包括以下组分：转铁蛋白、亚硒酸钠、胰岛素、三碘甲状腺氨酸、胰高血糖素、孕酮、氢化可的松、睾酮、雌二醇、碱性成纤维细胞生长因子、维生素e、维生素c、抗生素和胎牛血清。

本发明还提供了上述的羊水细胞培养基在产前诊断羊水细胞生长中的应用。

另外，本发明还提供了一种羊水细胞的培养方法，将0.5-lml的18-22周龄的原代羊水细胞样本接种于5±1ml的上述的羊水细胞培养基上，进行细胞培养，收获获得所述羊水细胞。

本发明的有益效果在于：

通过改变羊水细胞培养基中有效成分，配置出上述组分的羊水培养基，可以提高羊水细胞培养的成功率，加快培养速度，提高用于染色体制的细胞分裂相的比例，使本发明的羊水细胞培养基在技术、质量上达到优异水平，其在技术、质量上可达到甚至超过进口的培养基(例如进口德国amniopan羊水细胞培养基和美国gibico羊水细胞培养基)。

附图说明

图1为试验例1培养获得的羊水细胞在4х10光学显微镜下细胞结晶紫染色图片；

图2为对比例1培养获得的羊水细胞在4х10光学显微镜下细胞结晶紫染色图片；

图3为对比例2培养获得的羊水细胞在4х10光学显微镜下细胞结晶紫染色图片；

图4为对比例3培养获得的羊水细胞在4х10光学显微镜下细胞结晶紫染色图片；

图5为试验例1和对比例1-3的p-erk1/2的表达量；

图6为试验例1和对比例1-3的t-erk1/2的表达量；

图7为试验例1和对比例1-3的akt的表达量；

图8为试验例1和对比例1-3的p-akt的表达量；

图9为试验例1和对比例1-3的actin的表达量。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。

本发明最关键的构思在于：设计上述羊水细胞培养基的基本成份，以提高羊水细胞培养的成功率。

请参照图1-9，本发明提供了一种羊水细胞培养基，包括基础培养基，还包括以下组分：转铁蛋白、亚硒酸钠、胰岛素、三碘甲状腺氨酸、胰高血糖素、孕酮、氢化可的松、睾酮、雌二醇、碱性成纤维细胞生长因子、维生素e、维生素c、抗生素和胎牛血清。

本发明还提供了上述的羊水细胞培养基在产前诊断羊水细胞生长中的应用。

另外，本发明还提供了一种羊水细胞的培养方法，将0.5-lml的18-22周龄的原代羊水细胞样本接种于5±1ml的上述的羊水细胞培养基上，进行细胞培养，收获获得所述羊水细胞。

从上述描述可知，本发明的有益效果在于：

通过改变羊水细胞培养基中有效成分，配置出上述组分的羊水培养基，可以提高羊水细胞培养的成功率，加快培养速度，提高用于染色体制的细胞分裂相的比例，使本发明的羊水细胞培养基在技术、质量上达到甚至超过进口的培养基(例如进口德国amniopan羊水细胞培养基和美国gibico羊水细胞培养基)。

请参照图1-9，本发明的实施例一为：

1、培养基成份的配制

羊水细胞培养基的基本成份是：基础培养液、牛血清、细胞生长因子、双抗等，但羊水中本身细胞量少，且大多是老化细胞，因此，相对外周血来说，羊水细胞培养难度要大很多，其中培养基的配制是羊水细胞培养成败与否的关键所在。配制过程必须确保所用原料的品质，各成份的具体配方也需通过实验进行验证，并保证在配制、使用过程中各生物成份的活性，还有最重要的一点是要确保配制、使用过程无菌，一旦受到污染，整个实验过程就将完全失败。羊水细胞培养基配制完成后，必须对它的培养有效性和无菌性进行质检确认。

本发明通过改变羊水细胞培养基中有效成分，配置不同成分比例的羊水培养基，准确加入适当浓度的细胞生长因子，控制适当浓度和比例的碱性成纤维细胞与表皮生长因子，共同促进细胞的分裂增殖，观察孕周羊水细胞的培养效果。本项目通过改良羊水细胞培养基成份，提高羊水细胞培养的成功率，加快培养速度，提高用于染色体制的细胞分裂相的比例，使国产羊水培养基在技术、质量上达到甚至超过进口的培养基。

基于上述，按照下述表1所示的组分及浓度配制获得本发明的羊水细胞培养基。

表1

2、羊水细胞的培养条件优化

羊水细胞培养的目的是使羊水细胞充分增长，获得大量分裂中期的染色体样品，羊水细胞培养的质量直接关系到中期染色体的数量和质量。因羊水细胞数量少，且成份包括上皮细胞(培养期3-4天、羊水细胞(培养期约7天)和成纤维细胞(生长期最长)等，为获得羊水细胞的优势生长，必须控制培养的条件。

基于上述，本发明的羊水细胞的培养条件具体为：取18周龄的原代羊水细胞样本0.5ml，接种于5ml优化的不同培养基进行对比培养，培不同胎牛血清比例的培养基中培养，6d后换液，10d后观察羊水细胞长势并收获细胞。在终止培养前1.5小时加入秋水仙素，使尽可能多的羊水细胞停止于细胞分裂中期。

羊水细胞的培养必须严格进行中间过程控制，在培养换液前，观察培养瓶瓶底面有较多克隆的细胞生长，但细胞较稀薄，估计在培养后其生长会更旺盛，便可换液。培养完成后，见瓶底面有大量羊水细胞生长，大而亮圆的分裂期细胞多，每个圆形细胞饱满，边缘清晰，胞核清楚，内含丝状物，细胞肿胀似阿米巴原虫伸出的伪足，像要破裂似的，有的圆形细胞透亮成双成对，则此时羊水细胞可以收获。

本发明的实施例二为：

本实施例的羊水细胞培养基，仅“胎牛血清的体积分数为4-15％”与实施例一不同，其他均与实施例一相同；

本实施例的羊水细胞的培养条件为：取22周龄的原代羊水细胞样本lml，接种于5ml优化的不同培养基进行对比培养，培不同胎牛血清比例的培养基中培养，7d后换液，11d后观察羊水细胞长势并收获细胞。在终止培养前1.5小时加入秋水仙素，使尽可能多的羊水细胞停止于细胞分裂中期。

本发明的实施例三为：

本实施例的羊水细胞培养基，仅“胎牛血清的体积分数为4-15％”与实施例一不同，其他均与实施例一相同；

本实施例的羊水细胞的培养条件为：取20周龄的原代羊水细胞样本0.7ml，接种于5ml优化的不同培养基进行对比培养，培不同胎牛血清比例的培养基中培养，6.5d后换液，10.5d后观察羊水细胞长势并收获细胞。在终止培养前1.5小时加入秋水仙素，使尽可能多的羊水细胞停止于细胞分裂中期。

试验测试

将实施例一至三配制获得的羊水细胞培养基作为试验例，其中以实施例1的数据作为代表示例，实施例一即为试验例1；同时将美国gibico羊水细胞培养基作为对比例1，将德国amniopan羊水细胞培养基作为对比例2，将广州达辉生物技术有限公司生产的羊水细胞培养基作为对比例3；然后进行下述步骤：

1、采用结晶紫法检测羊水细胞数量

羊水离心浓缩，无菌接种于6孔板中，每孔5*105个细胞，用以上试验例1、对比例1-3共四组培养基进行细胞培养，培养10-11天待细胞贴壁后，吸出各孔液体，pbs轻洗去残留液体，每孔加人4％多聚甲醛溶液固定30min后，pbs轻洗3遍，加入0.5％结晶紫溶液染色10min，pbs轻洗3遍，观察拍照。

2、westernblotting检测pi3k/akt和mapk/erk信号转导通路

羊水离心浓缩，无菌接种于6孔板中，每孔5*105个细胞，用以上试验例1、对比例1-3共四组培养基进行细胞培养，培养10-11天待细胞贴壁后，取出六孔板置于冰上，吸弃培养液，冰pbs处理2次，加入细胞裂解液，在冰上裂解30min后，收集蛋白于ep管后，利用考马斯亮蓝法(波长595nm)测定蛋白浓度，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶电泳后，进行免疫印迹，将蛋白转移醋酸纤维膜(nc)上，浸没于5％牛血清白蛋白液封闭1h，然后用一抗，4℃孵育过夜。一抗孵育完成后，tbst洗膜4次，每次10min；二抗室温下孵育1h，孵育完后用pbst洗膜4次，每次10min。然后用ecl发光液显色曝光，β-actin作为内参蛋白。

显微镜下观察细胞培养效果评价：

选取100例18-22周龄的原代羊水细胞样本0.5-lml，接种于5mlabcd四组培养基同时培养，羊水细胞贴壁好，分为三组进行评价。

评价标准参照下述：

优：生长旺盛(在同一视野中见到10-15个球形发亮的分裂相细胞)，制片效果好。

良：羊水细胞贴壁可，生长中等(在同一视野中见到5-10个球形发亮的分裂相细胞)，制片效果可。

差：羊水细胞生长慢(在同一视野中球形发亮的分裂相细胞少于3个，甚至没有细胞生长)，不贴壁。

实验结果如下：

1、结晶紫法检测羊水细胞数量情况

试验例1、对比例1-3的培养基培养羊水细胞所得细胞结晶紫染色结果如图1-4所示。其中，图1为试验例1培养获得的羊水细胞在4х10光学显微镜下细胞结晶紫染色图片，图2为对比例1培养获得的羊水细胞在4х10光学显微镜下细胞结晶紫染色图片，图3为对比例2培养获得的羊水细胞在4х10光学显微镜下细胞结晶紫染色图片，图4为对比例3培养获得的羊水细胞在4х10光学显微镜下细胞结晶紫染色图片。4х10光学显微镜下观察发现，经结晶紫染色后，试验例1、对比例1-2的细胞数量明显增多，优于国产的对比例3的培养基。

2、westernblotting检测pi3k/akt和mapk/erk信号转导通路结果

不同羊水细胞培养基作用羊水细胞后，影响pi3k/akt和mapk/erk信号转导通路如图5-9所示。(图5-9中从左至右均依次对应试验例1、对比例1、对比例2和对比例3)。其中，图5为p-erk1/2的表达量，图6为t-erk1/2的表达量，图7为akt的表达量，图8为p-akt的表达量，图9为actin的表达量。结果显示对照组、phospho-akt与phospho-erk1/2表达量变化。与之相比，试验例1的表达与对比例1-2的表达相当，证明本发明配制的培养基达到国际水平。

3、显微镜下观察细胞培养效果评价结果：

将试验例1、对比例1-3的培养基进行羊水细胞培养效果比较。

试验例1的羊水细胞培养基中，细胞培养优89例(占89％)，良8例(占8％)，差3例(占3％)；

对比例1中，细胞培养优87例(占87％)，良ll例(占11例)，差2例(占2％)；

对比例2中，细胞培养优91例(占91％)，良8例(占8例)，差1例(占1％)；

对比例3中，细胞培养优79例(占79％)，良11例(占11％)，差10例(占10％)。

请参见下述表2，表2为试验例1和对比例1-3的羊水细胞培养基的培养效果评价表。

表2

经过统计学分析试验例1、对比例1-2的培养基无差异，均明显优于对比例3的培养基。

综上所述，本发明提供的羊水细胞培养基通过调节pi3k/akt和mapk/erk信号转导通路促进羊水细胞的增殖，羊水细胞培养基的质量可达到国际水平，具有羊水细胞培养基的质量优异的优点。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。