本发明涉及生物技术领域，特别是一种产低温脂肪酶菌株xlb016及其应用。
背景技术：
脂肪酶(triacylglycerolacylhydrolase，ec3.1.1.3)是一类能催化天然油脂底物水解，产生甘油二酯、甘油单酯、脂肪酸和甘油的水解酶。脂肪酶广泛存在于各种动物、植物和微生物中。作为重要的工业用酶，脂肪酶被广泛应用于食品加工及食品风味改良、油脂工业、洗涤工业、饲料工业及生物能源等方面。此外，脂肪酶还能催化酯类化合物的合成、酯交换和转脂等反应，因此，脂肪酶是在有机合成中应用最广泛的酶类。近年来，在医药工业中，脂肪酶因能被用于手性制备光学纯的药物而倍加瞩目。
与中温、高温型脂肪酶相比，低温脂肪酶在低温下能保持高酶活力及高催化效率，可大大缩短处理过程的时间并省却昂贵的加热或冷却费用，在节能方面有相当大的优势。利用微生物发酵生产的低温脂肪酶，用于食品洗涤剂、食品乳化剂、化妆品、药品等领域可以显著的提高生产效率，降低生产成本，改善并提高产品质量，可以从根本上摆脱中温、高温酶的加热、冷却设备和工艺。低温脂肪酶将为人类摆脱生存和发展中所面临的诸如资源、能源危机以及环境污染等困境提供现实的机遇。低温脂肪酶具有非常广阔的开发潜力和应用前景。到目前为止，已经报道了很多能产低温脂肪酶的微生物菌株，例如：candidaantarctica,
aeromonassp.,pseudoalteromonassp.,pseudomonassp.,和psychrobactersp.等，但与巨大的对低温脂肪酶的市场需求相比，这还远远不够，为了得到活力更高，性能更加优越的低温脂肪酶，还需要不断地分离新的产低温脂肪酶的菌株。
喜冷杆菌属(cryobacterium)是日本科学家suzuki于1997年从南极土壤中分离并命名的一个新的嗜冷性的细菌属，这个属的细菌的种的生长温度极低，为了适应极低的生长环境，菌种在生长代谢过程中一定会合成一些低温酶以利于其生长。然而，到目前为止，还没有这个属的菌株能够产胞外酶的相关报道。
技术实现要素：
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明的目的就是提供一种产低温脂肪酶菌株xlb016及其应用，可有效解决低温脂肪酶的生产制备问题。
本发明解决的技术方案是，一种产低温脂肪酶菌株xlb016，分类命名为喜冷杆菌(cryobacteriumsp.)，于2017年12月12日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.15049。
所述的产低温脂肪酶菌株xlb016用于制备低温脂肪酶的方法，包括以下步骤：
(1)制备lb斜面培养基：将蛋白胨10g、酵母粉5g、nacl10g加300ml水溶解，调ph至6-9，加琼脂粉20g，加水定容至1000ml，加热将琼脂溶解，装于容器中，密封，于121℃下灭菌20min，摆斜面，得lb斜面培养基；
(2)制备发酵培养基：将蔗糖5g，蛋白胨3g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.3g，橄榄油乳化液20ml，加300ml水溶解，调ph至6-8，加水定容至1000ml，混匀，于115℃下灭菌20min，得发酵培养基；
(3)制备斜面菌种：用接种环将喜冷杆菌xlb016菌株接种于步骤(1)制备的斜面培养基上，20-30℃恒温培养，直到斜面上长满菌苔，得斜面菌种；
(4)发酵：用接种环将步骤(3)制备的斜面菌种接种发酵培养基中，摇床发酵，发酵温度为20-30℃，转速为120-200转/分钟，发酵时间为48-72h；
(5)酶液的制备：发酵完成后，将发酵液在4℃、8000-12000转/分钟的条件下离心10-15min，弃去沉淀，上清液即为低温脂肪酶液。
本发明制备工艺简单、高效，节能环保，制备出的脂肪酶酶活性高，具有良好的低温活性，在20-30℃下，ph6.0-9.0之间能保持高的酶活，在洗涤剂、皮革、食品、饲料等方向拥有巨大的市场前景，经济和社会效益显著。
附图说明
图1为本发明菌株产低温脂肪酶在不同反应温度下的酶活性测定。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，是由以下实施例实现。
一种产低温脂肪酶菌株xlb016，分类命名为喜冷杆菌(cryobacteriumsp.)，于2017年12月12日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.15049。
实施例1
本发明所述的产低温脂肪酶菌株xlb016用于制备低温脂肪酶的方法，包括以下步骤：
(1)制备lb斜面培养基：将蛋白胨10g、酵母粉5g、nacl10g加300ml水溶解，调ph至6，加琼脂粉20g，加水定容至1000ml，加热将琼脂溶解，装于容器中，密封，于121℃下灭菌20min，摆斜面，得lb斜面培养基；
(2)制备发酵培养基：将蔗糖5g，蛋白胨3g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.3g，橄榄油乳化液20ml，加300ml水溶解，调ph至6，加水定容至1000ml，混匀，于115℃下灭菌20min，得发酵培养基；
(3)制备斜面菌种：用接种环将喜冷杆菌xlb016菌株接种于步骤(1)制备的斜面培养基上，20-30℃恒温培养，直到斜面上长满菌苔，得斜面菌种；
(4)发酵：用接种环将步骤(3)制备的斜面菌种接种发酵培养基中，摇床发酵，发酵温度为20℃，转速为200转/分钟，发酵时间为72h；
(5)酶液的制备：发酵完成后，将发酵液在4℃、8000转/分钟的条件下离心15min，弃去沉淀，上清液即为低温脂肪酶液。
实施例2
本发明所述的产低温脂肪酶菌株xlb016用于制备低温脂肪酶的方法，包括以下步骤：
(1)制备lb斜面培养基：将蛋白胨10g、酵母粉5g、nacl10g加300ml水溶解，调ph至7.2，加琼脂粉20g，加水定容至1000ml，加热将琼脂溶解，装于容器中，密封，于121℃下灭菌20min，摆斜面，得lb斜面培养基；
(2)制备发酵培养基：将蔗糖5g，蛋白胨3g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.3g，橄榄油乳化液20ml，加300ml水溶解，调ph至7，加水定容至1000ml，混匀，于115℃下灭菌20min，得发酵培养基；
(3)制备斜面菌种：用接种环将喜冷杆菌xlb016菌株接种于步骤(1)制备的斜面培养基上，25℃恒温培养，直到斜面上长满菌苔，得斜面菌种；
(4)发酵：用接种环将步骤(3)制备的斜面菌种接种发酵培养基中，摇床发酵，发酵温度为25℃，转速为160转/分钟，发酵时间为56h；
(5)酶液的制备：发酵完成后，将发酵液在4℃、10000转/分钟的条件下离心12min，弃去沉淀，上清液即为低温脂肪酶液。
实施例3
本发明所述的产低温脂肪酶菌株xlb016用于制备低温脂肪酶的方法，包括以下步骤：
(1)制备lb斜面培养基：将蛋白胨10g、酵母粉5g、nacl10g加300ml水溶解，调ph至9，加琼脂粉20g，加水定容至1000ml，加热将琼脂溶解，装于容器中，密封，于121℃下灭菌20min，摆斜面，得lb斜面培养基；
(2)制备发酵培养基：将蔗糖5g，蛋白胨3g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.3g，橄榄油乳化液20ml，加300ml水溶解，调ph至8，加水定容至1000ml，混匀，于115℃下灭菌20min，得发酵培养基；
(3)制备斜面菌种：用接种环将喜冷杆菌xlb016菌株接种于步骤(1)制备的斜面培养基上，30℃恒温培养，直到斜面上长满菌苔，得斜面菌种；
(4)发酵：用接种环将步骤(3)制备的斜面菌种接种发酵培养基中，摇床发酵，发酵温度为30℃，转速为120转/分钟，发酵时间为48h；
(5)酶液的制备：发酵完成后，将发酵液在4℃、12000转/分钟的条件下离心10min，弃去沉淀，上清液即为低温脂肪酶液。
所述的低温脂肪酶，其酶学特征为：
最适反应温度为30℃，当温度为20℃时，脂肪酶的活力有最高时的95.7％。酶的最适反应ph值为ph7.0，ph6.0-9.0时酶活力能达到最高酶活的86％以上。mg2+和ca2+对该酶有较强的激活作用，zn2+、cu2+、hg2+、pmsf和sds对该酶具有较强的抑制作用，其中在hg2+离子的作用下，脂肪酶完全失去了活性。
本发明经多次反复实验，均取得了一致的结果，相关实验资料如下：
实验1：菌株的筛选及鉴定
从云南磷矿中分离细菌菌株，并将得到的单菌落点种于脂肪酶筛选平板上，观察菌株产透明圈情况，进行菌种的初筛；然后将产透明圈的菌株接种于液体发酵培养基上，于20℃摇瓶培养3d，在4℃，10000r/min条件下离心15min，取上清液，测定其脂肪酶活力，筛选出产脂肪酶最高的菌株。最终，筛选到编号为xlb016的高活力脂肪酶生产菌株。
参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》，依据其生理生化特征对xlb016菌株进行分类鉴定。
对xlb016菌株进行生理生化鉴定试验，结果如表1所示，参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》，鉴定结果显示：xlb016菌株为革兰氏阳性菌，能水解明胶、酪蛋白，不能水解淀粉，不能使硝酸盐还原。
表1生理生化鉴定结果
注：“+”表示反应为阳性，“-”表示反应为阴性。
对xlb016菌株进行16srrna基因序列分析，具体步骤如下：
(1)基因组的dna提取
用细菌基因组dna提取试剂盒，按说明书所说步骤提取制备基因组dna。
(2)引物序列：
27f5’-gagtttgatcctggctcag-3’
1492r5’-tacggttaccttgttacgactt-3’
(3)pcr反应体系建立(50μl)：
(4)pcr程序设定
预变性94℃4min；循环94℃30s，59℃30s，72℃1min，30个循环；修复延伸72℃10min；
(5)dna测序
将pcr出来的基因送交华大基因测序公司进行测序。
测序出的xlb016菌株的16srrna基因序列见序列表。
(6)16srrna基因分析
将测序出来xlb016菌株的16srrna基因在ncbi的基因数据库中进行blast比对(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast)，寻找与xlb016菌株的16srrna基因相关的序列，用相关性最高的菌株和xlb016菌株的16srrna基因构建系统进化树，进行同源性比较，确定xlb016菌株的分类地位。结果显示，xlb016菌株和喜冷杆菌属(cryobacterium)形成一个分枝，因此确定xlb016菌株属于喜冷杆菌属菌株。
根据生理生化和分子生物学特征，xlb016菌株与喜冷杆菌属中cryobacteriumarcticumsk-1菌株在系统进化树上处于同一个分枝，说明二者亲缘关系最近，但两者在生理生化特征上有一些差别，比如cryobacteriumarcticumsk-1菌株能产生h2s、能发酵葡萄糖产酸，而xlb016菌株不能，因此，二者不属于同一种细菌菌种，我们将xlb016菌株命名为cryobacteriumsp.xlb016。
实验2脂肪酶活力的测定方法
脂肪酶的测定方法：取两个100ml三角瓶，分别于空白瓶(a)和样品瓶(b)中加入4ml橄榄油乳化液和5mlph7.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液，再于a瓶中加入15ml95％的乙醇，振荡混匀。将三角瓶置于30℃水浴锅内保温5min，然后在a、b瓶中各加入1ml适当稀释的待测酶液，混匀，30℃水浴锅内反应15min，在b瓶中立即补加15ml95％的乙醇终止反应，取出a、b瓶，在两瓶中分别滴加2滴1％酚酞溶液，用50mmol/lnaoh溶液进行滴定。当滴定至溶液为微红色且静置30sec后不褪色时达到滴定终点。记录消耗naoh溶液的体积。脂肪酶水解活力单位(u)定义为在30℃、ph7.5的条件下，每分钟水解橄榄油产生1μmol游离脂肪酸所需的酶量。酶活力计算公式如下：
其中v1：样品组滴定至终点时所消耗naoh的体积(ml)
v0：对照组滴定至终点时所消耗naoh的体积(ml)
c：naoh的摩尔浓度(mol/l)
n：待测样品稀释的倍数
实验3菌株的发酵条件优化
1、碳源对cryobacteriumsp.xlb016菌株产酶的影响
在除了碳源之外的液体培养基(蛋白胨0.3％，kh2po40.05％，mgso40.03％，橄榄油乳化液2ml/100ml，ph7.0)中液体培养基中分别加入0.5％的待测碳源(葡萄糖，蔗糖，可溶性淀粉，果糖，麦芽糖)为唯一碳源，25℃、150r/min培养48h后测定脂肪酶活。结果表明，蔗糖作为碳源时，xlb016菌株的酶活最高，达82.7u/ml，用果糖作碳源时酶活力最低。所以，用蔗糖作为xlb016菌株产低温脂肪酶的最佳碳源。
2、氮源对cryobacteriumsp.xlb016菌株产酶的影响
以液体培养基(蔗糖0.5％，kh2po40.05％，mgso40.03％，橄榄油乳化液2ml/100ml，ph7.0)为基础培养基，在其中加入0.3％不同的氮源(干酪素、酵母粉、硝酸钠、硫酸铵、牛肉膏、蛋白胨)，25℃、150r/min摇床培养48h后测定脂肪酶活。结果表明，不同的氮源对菌株产酶的活性影响很大，蛋白胨作为氮源的时候，cryobacteriumsp.xlb016菌株所产脂肪酶酶活最高，达到106.3u/ml，而干酪素、酵母粉和牛肉膏相对较低，而用无机氮硝酸钠和硫酸铵作氮源时，菌株产脂肪酶的活力非常低。所以，用蛋白胨作为xlb016菌株产低温脂肪酶的最佳氮源。
3、培养温度对cryobacteriumsp.xlb016菌株产酶影响
将cryobacteriumsp.xlb016菌株接种到发酵培养基中(蔗糖0.5％，蛋白胨0.3％，kh2po40.05％，mgso40.03％，橄榄油乳化液2ml/100ml，ph7.0)，将发酵温度分别设置为5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃和35℃，150r/min摇床培养48h后测定脂肪酶活，研究不同培养温度对发酵产脂肪酶的影响。结果表明，温度对菌的产酶量有明显的影响，不同温度下培养，菌株脂肪酶活力差别很大，其中温度为30℃时产酶量最大，达114.8u/ml。所以，在发酵培养时，我们将培养温度控制在30℃。
4、时间对cryobacteriumsp.xlb016菌株产酶影响
将活化好的菌悬液接入装有100ml发酵培养基的摇瓶(250ml)中，30℃、150rpm发酵4d，间隔12h取一次样，离心，测上清液中脂肪酶的活力，研究不同发酵时间对cryobacteriumsp.xlb016菌株产脂肪酶的影响。结果表明，发酵时间对菌种产酶量的大小较显著的影响，随着发酵时间的变化，产酶量呈现先增后减的趋势。发酵60h时，菌株产酶量达到最高水平，达126.7u/ml。然后随着培养时间的延长，脂肪酶活力逐渐下降。所以，最终确定发酵时间为60h。
实验4菌株制备的低温脂肪酶酶液的性质研究
1、酶的最适反应温度的确定
取两个100ml三角瓶，分别于空白瓶(a)和样品瓶(b)中加入4ml橄榄油乳化液和5mlph7.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液，再于a瓶中加入15ml95％的乙醇，振荡混匀。将三角瓶置于0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃水浴锅内保温5min，然后在a、b瓶中各加入1ml适当稀释的待测酶液，混匀，将三角瓶置于相应的温度的水浴锅内反应15min，在b瓶中立即补加15ml95％的乙醇终止反应，取出a、b瓶，在两瓶中分别滴加2滴1％酚酞溶液，用50mmol/lnaoh溶液进行滴定。测定脂肪酶的酶活，确定酶的最适反应温度。结果如图1所示，xlb016菌株脂肪酶的最适反应温度为30℃，当温度为20℃时，脂肪酶的活力有最高时的95.7％。根据低温酶的概念(最适反应温度为30℃以下时的酶为低温酶)，xlb016菌株所产的脂肪酶为低温脂肪酶。
2、酶的最适反应ph的确定
用不同ph的缓冲液稀释酶液[甘氨酸-盐酸缓冲液(ph2.0，ph3.0)，乙酸-乙酸钠缓冲液(ph4.0，ph5.0)，磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(ph6.0，ph7.0，ph8.0)，甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(ph9.0，ph10.0)]，在测定酶活时，将反应体系中的5mlph7.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液换成相应ph值的缓冲溶液，30℃水浴锅内反应15min。测定脂肪酶的酶活，确定酶的最适反应ph值。结果表明，酶的最适反应ph值为ph7.0，ph6.0-9.0时酶活力能达到最高酶活的86％以上。
3、金属离子和化合物对脂肪酶活力的影响：
为了检验不同的金属离子和化合物对xlb016菌株脂肪酶活力的影响，在脂肪酶的粗酶液中分别加入表2中不同的金属离子和化合物，使终浓度达到表2的浓度，然后将酶液在4℃条件下保温30min，然后按常规方法测脂肪酶的活力。结果如表2所示，mg2+和ca2+对该酶有较强的激活作用，zn2+，cu2+，hg2+、pmsf和sds对该酶具有较强的抑制作用，其中在hg2+离子的作用下，脂肪酶完全失去了活性。
表2金属离子和化合物对xlb016脂肪酶活力的影响
本发明筛选的一株产低温脂肪酶的喜冷杆菌(cryobacteriumsp.)xlb016菌株，关于这个属的菌种产低温脂肪酶的这个性能到目前为止没有文献报道和专利申请，因此，本发明丰富了产低温脂肪酶的微生物的范围。本发明所用到的发酵培养基(蔗糖0.5％，蛋白胨0.3％，kh2po40.05％，mgso40.03％，橄榄油乳化液2ml/100ml，ph7.0)成分和发酵条件简单，易于操作，另外菌株性状稳定、产低温脂肪酶活力高，发酵周期短，因此成本低廉，便于大规模发酵生产。在本发明中，生产菌株所生产的低温脂肪酶的性状优良，具体表现在，当温度在20-30℃时，酶的活性最高，因此是真正的低温脂肪酶；酶的ph适应性很广，ph6.0-9.0时酶活力能达到最高酶活的86％以上，因此可以应用于很多领域，比如在洗衣液、洗涤剂和食品等工业应用中具有极高的应用潜力。
序列表
<110>河南省科学院生物研究所有限责任公司
<120>一种产低温脂肪酶菌株xlb016及其应用
<130>2018
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1423
<212>dna
<213>喜冷杆菌(cryobacteriumsp.)
<400>1
tggcgtgagccgcttaccatgcagtcgaacggtgaagaggagcttgcttcttggatcagt60
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