海洋迪茨氏菌W02-3a及其在脱氮中的应用的制作方法

本发明属微生物及其应用技术领域，更具体地说，本发明涉及海洋迪茨氏菌dietziamarisw02-3a及其在脱氮中的应用。

背景技术：

随着工农业的快速发展和人类活动的加剧，固定氮素被大量释放到环境中，成为重要污染物，严重危害生态系统安全、环境安全和人类健康。因此，脱氮技术和产品研发具有重要的现实意义。

微生物脱氮技术是目前应用最为广泛的脱氮技术，具有低成本、高效率、易操作、无二次污染、副产物无毒、选择性强等特点，极具发展潜力，受到国内外的广泛关注和认可。但是，目前的微生物脱氮工艺，例如缺氧-好氧(anoxic-oxic)脱氮工艺、厌氧-缺氧-好氧

(anaerobic-anoxic-oxic)脱氮工艺、间歇式(sequencingbatchreactor)脱氮工艺、曝气生物滤池(biologicalaerationfilter)脱氮工艺等，将硝化(需氧)和反硝化(厌氧)两个过程分开进行，限制了脱氮效率，增加了运行成本。

近来发现，自然界存在一类异养硝化-好氧反硝化细菌，在有氧条件下，一方面能够将氨氮氧化为硝态氮、亚硝态氮、氮气或氮氧化物气体，另一方面又能够进行反硝化过程，将硝态氮和亚硝态氮还原为氮气或者氮氧化物气体，从而将固定氮素转化成气体排到大气中。

基于异养硝化-好氧反硝化细菌的同步硝化反硝化技术具有在硝化过程中无需加碱中和、对氨态氮的耐受力强、脱氮处理效率高等优点，能同时去除富营养化水体或污水中的碳和氮两种污染物，还可以实现在同一个生态系统或反应器中同步完成硝化-反硝化过程，将氨氮和氮氧化物等污染物直接转化为气态氮素排出系统，从而克服传统脱氮技术和工艺在处理效率和经济成本等方面的缺点。这些优越性决定了好氧反硝化细菌在相关工程应用领域具有巨大的潜力。

但是，目前同步硝化反硝化技术仅处于研究阶段，尚未大规模推广使用，重要原因在于缺乏高效的异养硝化-好氧反硝化菌株。据文献报道，异养硝化-好氧反硝化细菌主要分布于pseudomonas、alcaligenes、paracoccus、bacillus、citrobacter、hyphomicrobium、klebsiella、mesorhizobium、rhodococcus、thiobacillus、zoogloea、comamonas、enterobacter、magnetospirillum、microvirgula、nitrosomonas、ochrobactrum、psychrobacter、rhodospirillum、sphingomonas、thauera等属。

技术实现要素：

本发明的目的在于：克服现有技术中缺乏性能优良的脱氮菌株的不足，提供一种从自然界分离的、性能全面高效的好氧脱氮细菌海洋迪茨氏菌dietziamarisw02-3a及其在脱氮中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了一种从深海沉积物中经过二次驯化富集分离得到的脱氮细菌，其分类学命名为海洋迪茨氏菌dietziamarisw02-3a，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno.60311，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2018年1月2日。经鉴定，该海洋迪茨氏菌dietziamarisw02-3a与dietziamarisatcc35013^t具有最高的16srrna基因相似性(99.9％)。

本发明海洋迪茨氏菌dietziamarisw02-3a的生物学特征为：菌落为桔红色或粉红色，圆形，边缘规则，表面湿润光滑；细胞呈杆状或短杆状；能利用硝态氮、亚硝态氮或者氨氮作为唯一氮源生长；具有好氧反硝化能力；在以140mg/l的硝态氮、亚硝态氮、氨氮为唯一氮源的培养基中，培养24h后，脱除率分别为63.2％、60.7％、99.8％。

因此，本发明海洋迪茨氏菌dietziamarisw02-3a可用于脱氮。

相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：

本发明发现了一种全面、高效的脱氮菌株——海洋迪茨氏菌dietziamarisw02-3a，它能够在好氧条件下脱除硝态氮、亚硝态氮和氨氮，脱氮效率高，且不积累有害中间产物，不产生二次污染，在氮素脱除、处理氮氧化物、污染治理方面具有很好的应用前景。

菌种保藏信息：

海洋迪茨氏菌dietziamarisw02-3a，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno.60311，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2018年1月2日。

附图说明

图1为本发明海洋迪茨氏菌dietziamarisw02-3a在固体平板上的菌落形态。

图2为本发明海洋迪茨氏菌dietziamarisw02-3a在光学显微镜下(100×)的照片。

图3为本发明海洋迪茨氏菌dietziamarisw02-3a生长趋势与脱除硝态氮能力示意图。

图4为本发明海洋迪茨氏菌dietziamarisw02-3a生长趋势与脱除亚硝态氮能力示意图。

图5为本发明海洋迪茨氏菌dietziamarisw02-3a生长趋势与脱除氨氮能力示意图。

图6为本发明海洋迪茨氏菌dietziamarisw02-3a脱除养殖水体中氮素能力示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。实施例中除特殊说明外，均为本领域常规试剂和方法步骤。

实施例1海洋迪茨氏菌dietziamarisw02-3a的分离

1.富集培养：

配制富集所用培养基，配方如下：丁二酸钠2.5g，二水合柠檬酸钠2.5g，nano21g，k2hpo41g，kh2po41g，mgso4·7h2o0.2g，l-天冬酰胺1g，ph7.4，定容至1000ml，分装至250ml三角瓶中，每瓶100ml。121℃，20min，高温高压灭菌。添加无菌过滤后的复合碳源1％，复合维生素0.2％，复合微量元素0.2％。

其中，复合碳源：d-葡萄糖6.9g，d-果糖6.9g，d-乳糖6.9，醋酸钠9.5g，90％乳酸6.4ml，甘露醇7g，无水乙醇7ml，甘油6.3ml，苯甲酸钠4.8g，水杨酸4.6g，溶于500ml水中，ph7.4，0.22μm滤膜过滤除菌。

复合维生素：生物素/vh10mg，叶酸/vb9100mg，吡哆醇/vb6100mg，硫胺素/vb1200mg，烟酸200mg，泛酸钙100mg，vb122mg，核黄素/vb220mg，硫辛酸20mg，edta-na400mg，调ph至7.5，0.22μm滤膜过滤除菌。

复合微量元素：znso4·7h2o0.1g，mncl2·4h2o0.4g，h3bo31.24g，cocl2·2h2o0.5g，cucl2·2h2o0.5g，niso4·6h2o0.02g，namoo4·2h2o0.4g，ki0.2g，cacl25g，feso4·7h2o1.1g，edta-na10g，溶于1000mlh2o，ph7.4，0.22μm滤膜过滤。

我国大洋科考32航次第2航段期间(2014年9月)，从东太平洋(e162°12.9'，n15°34.7')采集表层沉积物样品。取沉积物2g，放入装有上述培养基的锥形瓶中，28℃，180rpm，培养7d，进行脱氮细菌的富集。对以上孵育一周以后的培养物，转接5ml至新的装有培养基的锥形瓶中，28℃，180rpm，培养7d，进行二次富集。

2.分离纯化

对于上述二次富集培养物，采用稀释涂布法涂布固体平板(所用固体培养基是在富集培养基配方的基础上添加1.7％的琼脂)；使用划线反复转接的方式进行纯化；挑取已纯化的菌落至5ml含杜氏管的液体培养基(富集培养基，但分别只含有140mg/l-n的kno3、nano2和(nh4)2so4作为唯一氮源)，28℃孵育观察产气情况，发现菌株能将硝酸盐转化为气体产物。对纯化后的菌株，扩大培养并保种甘油管和冻干管。

实施例2海洋迪茨氏菌dietziamarisw02-3a的鉴定

1.形态学鉴定

在平板上划线培养海洋迪茨氏菌dietziamarisw02-3a，观察其菌落形态。如图1所示，菌落为桔红色，圆形，边缘规则，表面湿润光滑。在光学纤维镜下(100×)观察细胞形态。如图2所示，细胞呈杆状或短杆状。

2.16srrna基因鉴定

提取菌株的基因组dna，用细菌16srrna基因扩增通用引物27f/1492r扩增得到pcr产物，并送至上海美吉生物医药科技有限公司(广州分公司)进行序列测序，测序结果与ezbiocloud网站数据库中的16srrna基因序列进行相似性比对分析，结果分析表明其与菌株dietziamarisatcc35013^t的16srrna基因序列相似性最高(99.9％)。基于以上结果分析，初步鉴定本发明菌株为dietziamaris，分类学命名为：海洋迪茨氏菌dietziamarisw02-3a。

实施例3海洋迪茨氏菌dietziamarisw02-3a脱氮性能测定

接种海洋迪茨氏菌dietziamarisw02-3a至液体培养基中(富集培养基，但分别只含有140mg/l-n的kno3、nano2和(nh4)2so4作为唯一氮源)，28℃，180rpm摇床培养，分别在培养0、12、18、24、36、42、48、60h后，取样，定量检测上清中n浓度。

如图3所示，海洋迪茨氏菌dietziamarisw02-3a对no3^--n有很好的降解效果，培养24h后，脱除率为63.2％；培养60h后，脱出率为70.5％；且脱除硝态氮过程中不积累亚硝态氮和氨氮，无二次污染。

如图4所示，海洋迪茨氏菌dietziamarisw02-3a对no2^--n有很好的脱除效果，培养24h后，脱除率为60.7％；培养60h后，脱出率为70.7％；且脱除亚硝态氮过程中不积累硝态氮和氨氮，无二次污染。

如图5所示，海洋迪茨氏菌dietziamarisw02-3a对nh4⁺-n有很好的脱除效果，培养24h后，脱除率为99.8％；培养60h后，脱出率为99.9％；且脱除亚硝态氮过程中不积累硝态氮和亚硝态氮，无二次污染。

实施例4海洋迪茨氏菌dietziamarisw02-3a对养殖水体脱氮效果研究

从佛山市三水区大塘镇江边村一鱼塘(冲洗并接收塘边养猪场粪尿)中采集水样，测定其中有机碳浓度为25.4mg/l，总氮浓度为29.2mg/l。将100ml养殖水装入500ml三角瓶中，加入琥珀酸钠调节c/n比至20，接入10％(v/v)的海洋迪茨氏菌dietziamarisw02-3a菌液，28℃，180rpm振荡培养，分别于0、6、12、24、36、48h后取样，分别测定水样硝态氮、亚硝态氮和氨氮含量。如图6所示，海洋迪茨氏菌dietziamarisw02-3a能脱除养殖水体中的硝态氮、亚硝态氮和氨氮。

根据上述说明书的揭示和指导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。