一种辅助发酵剂、其制备方法及其在发酵制品中的应用与流程

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种辅助发酵剂及其在发酵制品中的应用。

背景技术：

目前市面上的发酵制品主要是基于酸奶发酵剂(嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌)发酵而成，因其具有营养丰富、易消化、适口性好和便于保藏等优点，深为广大消费者所喜爱。该类产品中因乳酸菌的生长代谢对乳蛋白成分进行水解加工，使之变成利于人体吸收的蛋白及肽类物质；同时，乳酸菌产生的一些次级代谢产物也被证实对人体发挥着重要的有益功能。但是上述传统发酵剂菌种(嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌)均不是益生菌，难以以高的活菌数和活力到达人体肠道。因此开发含有高活力益生菌的发酵制品，即具有高活菌数、高活性的益生菌和高稳定性能的活性发酵乳已经成为当下发酵制品市场开发的热点。

植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)是一类重要的益生菌，因其降胆固醇、降血糖、抑制病原性细菌以及富集重金属等各种生理功能而成为功能性益生菌开发的热点。然而，植物乳杆菌在乳品领域规模化应用还面临一个主要的技术瓶颈，目前已鉴定的植物乳杆菌菌株均难以在乳介质中生长。已有的研究表明，植物乳杆菌在牛乳中生长及其缓慢，产酸能力弱，其发酵乳无论从生产可行性或产品质构上都难以让生产者和消费者接受。但是，鉴于其优良的益生特性，消费者对于基于植物乳杆菌的、具有益生特性的发酵制品的需求正不断增长。因此，开发一款基于植物乳杆菌的发酵制品已成为乳品工业的亟需达成的技术目标。

植物乳杆菌st-iii是一株性能优异的益生菌，因其广泛的生理活性，目前已经应用到各类产品中。但现有的含有植物乳杆菌st-iii的乳制品所采用的生产工艺均为传统发酵剂(嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌组合)发酵后添加高活菌数的植物乳杆菌st-iii菌粉。

技术实现要素：

本发明的目的是利用制备一种能够明显促进益生菌在食品介质中生长的辅助发酵剂，该辅助发酵剂的制备方法及该辅助发酵剂在发酵制品中的应用。

本发明的为达到上述目的，具体通过以下技术方案得以实现的：

一种辅助发酵剂的制备方法，其包括以下步骤：

(1)将肠膜明串珠菌(leuconostocmesenteroides)接种于mrs培养基中，在温度35-40℃条件下培养18-22h，得到发酵液；

(2)将步骤(1)得到的发酵液通过离心收集菌体，清洗，分装，沉淀，冷冻干燥即得。较佳地培养温度为37℃。

本发明中，步骤(1)中所述的肠膜明串珠菌为保藏号cgmccno.6432的肠膜明串珠菌(leuconostocmesenteroides)bd01710。肠膜明串珠菌(leuconostocmesenteroides)bd01710

本发明中，步骤(1)中所述肠膜明串珠菌的接种量为10⁶-10⁷cfu/ml，所述百分比为体积百分比。

本发明中，步骤(1)中所述mrs培养基包括以下组分：8-12g/l蛋白胨、9-12g/l牛肉膏、3-7g/l酵母浸粉、18-24g/l葡萄糖、1-4g/l磷酸氢二钾、3-7g/l乙酸钠、1-4g/l柠檬酸三钠、1-4g/l吐温80、100-400mg/l硫酸镁、45-60mg/l硫酸锰，以及1000ml的蒸馏水；调节ph至6-7，121℃灭菌15min。优选地mrs培养基包括以下组分：10g/l蛋白胨、10g/l牛肉膏、5g/l酵母浸粉、20g/l葡萄糖、2g/l磷酸氢二钾、5g/l乙酸钠、2g/l柠檬酸三钠、1g/l吐温80、200mg/l硫酸镁、54mg/l硫酸锰与1000ml蒸馏水。

本发明中，步骤(1)中所述培养的ph为6.5；或/和，所述培养的代数为2-3代。

本发明中，步骤(2)中所述离心为本领域常规的离心方式，其离心力为6000g-8000g，时间为5-15min。

本发明中，步骤(2)中所述清洗为本领域常规的蒸馏水清洗。

本发明还提供了一种辅助发酵剂，所述辅助发酵剂由包括以下步骤的方法制备而得：

(1)将肠膜明串珠菌(leuconostocmesenteroides)接种于mrs液体培养基中，在温度35-40℃条件下培养18-22h，得到发酵液；

(2)将步骤(1)得到的发酵液通过离心收集，清洗，分装，冷冻干燥即得。

本发明还提供了一种上述的辅助发酵剂在发酵制品中的应用。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

1、本发明提供的辅助发酵剂，制备过程采用的发酵培养基的来源广泛、成本低廉、天然安全；通过共培养实验发现了肠膜明串珠菌(leuconostocmesenteroides)bd01710对益生菌的生长促进作用，并在此基础上通过制备了本发明的辅助发酵剂，在发酵制品中构建了基于肠膜明串珠菌和益生菌的二元发酵体系，在添加辅助发酵剂后，体系中对益生菌在基质中的生长促进作用明显，该基质尤其指乳介质。

2、实现了益生菌在众多食品介质中的生长；为益生菌在以乳为代表的食品介质中的规模化应用提供了新的技术路径，在未来益生菌发酵乳的开发及益生菌制剂领域将有重要应用价值。

生物材料保藏信息：

本发明提供的肠膜明串珠菌(leuconostocmesenteroides)bd01710菌株，已于2012年08月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。该菌株的保藏编号为：cgmccno.6432。

附图说明

图1为本发明在乳中同时加入植物乳杆菌st-iii和bd01710与未加入bd01710的生长及凝乳对比图；

图2为本发明在乳中加入长双歧杆菌或/和短双歧杆菌及是否加入bd01710的生长及凝乳对比图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步详细说明。

本发明的一种辅助发酵剂的制备方法，其制备方法包括以下步骤：

(1)将肠膜明串珠菌(leuconostocmesenteroides)接种于mrs培养基中，在温度35-40℃条件下培养18-22h，较佳地培养温度为37℃，得到发酵液；

(2)将步骤(1)得到的发酵液通过离心收集菌体，清洗，分装，沉淀，冷冻干燥即得。

本发明利用肠膜明串珠菌(leuconostocmesenteroides)对益生菌的生长促进作用实现益生菌在食品介质中的生长，尤其是乳介质中生长及凝乳，通过肠膜明串珠菌bd01710的促生长作用制得基于益生菌发酵的、高活菌数的益生菌发酵制品。所使用的肠膜明串珠菌bd01710属于公认安全的肠膜明串珠菌肠膜亚种(leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroides)。

上述的益生菌包括植物乳杆菌和双歧杆菌，尤其指植物乳杆菌st-iii、动物双歧杆菌、长双歧杆菌和短双歧杆菌。益生菌的食品发酵介质为乳介质或紫薯汁提取液等。

本发明中，步骤(1)中所述的肠膜明串珠菌为保藏号cgmccno.6432的肠膜明串珠菌(leuconostocmesenteroides)bd01710(该肠膜明串珠菌bd01710的来源请参见公开号为cn103013891b的中国专利)。

本发明中，步骤(1)中所述肠膜明串珠菌的接种量为10⁶-10⁷cfu/ml，所述百分比为体积百分比。

本发明中，步骤(1)中所述mrs培养基包括以下组分：8-12g/l蛋白胨、9-12g/l牛肉膏、3-7g/l酵母浸粉、18-24g/l葡萄糖、1-4g/l磷酸氢二钾、3-7g/l乙酸钠、1-4g/l柠檬酸三钠、1-4g/l吐温80、100-400mg/l硫酸镁、45-60mg/l硫酸锰，以及1000ml的蒸馏水；调节ph至6-7，121℃灭菌15min。优选地mrs培养基包括以下组分：10g/l蛋白胨、10g/l牛肉膏、5g/l酵母浸粉、20g/l葡萄糖、2g/l磷酸氢二钾、5g/l乙酸钠、2g/l柠檬酸三钠、1g/l吐温80、200mg/l硫酸镁、54mg/l硫酸锰与1000ml蒸馏水。本mrs培养基为本领域常规的mrs培养基，或通过购买获得。

本发明中，步骤(1)中所述培养的ph为6.5；或/和，所述培养的代数为2-3代。

本发明中，步骤(2)中所述离心为本领域常规的离心方式，其离心力为6000g-8000g，时间为5-15min。

本发明中，步骤(2)中所述清洗为本领域常规的蒸馏水清洗。

本发明还提供了一种辅助发酵剂，所述辅助发酵剂由包括以下步骤的方法制备而得：

(1)将肠膜明串珠菌(leuconostocmesenteroides)接种于mrs液体培养基中，在温度35-40℃条件下培养18-22h，得到发酵液；

(2)将步骤(1)得到的发酵液通过离心收集，清洗，分装，冷冻干燥即得。

本发明还提供了一种上述的辅助发酵剂在发酵制品中的应用。

本发明的辅助发酵剂制备

实施例1

辅助发酵剂的制备方法包括步骤：(1)将肠膜明串珠菌bd01710接种于mrs培养基中，在温度37℃条件下培养20h，得到发酵液。mrs培养基组成如下为10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、1g吐温80、200mg硫酸镁、54mg硫酸锰以及1000ml蒸馏水，调节ph至6.5，121℃灭菌15min。

(2)将步骤(1)得到的发酵液通过8000g离心10min，收集菌体，清洗三次，分装，沉淀，冷冻干燥即得辅助发酵剂。

实施例2

辅助发酵剂的制备方法包括步骤：(1)将肠膜明串珠菌bd01710接种于mrs培养基中，在温度35℃条件下培养22h，得到发酵液。mrs培养基组成如下为8g蛋白胨、9g牛肉膏、3g酵母浸粉、18g葡萄糖、1g磷酸氢二钾、3g乙酸钠、1g柠檬酸三钠、1g吐温80、100mg硫酸镁、45mg硫酸锰以及1000ml蒸馏水，调节ph至6，121℃灭菌15min。

(2)将步骤(1)得到的发酵液通过6000g离心20min，收集菌体，清洗三次，分装，沉淀，冷冻干燥即得辅助发酵剂。

实施例3

辅助发酵剂的制备方法包括步骤：(1)将肠膜明串珠菌bd01710接种于mrs培养基中，在温度40℃条件下培养18h，得到发酵液。mrs培养基组成如下为12g蛋白胨、12g牛肉膏、7g酵母浸粉、24g葡萄糖、4g磷酸氢二钾、7g乙酸钠、1g柠檬酸三钠、1g吐温80、100mg硫酸镁、45mg硫酸锰以及1000ml蒸馏水，调节ph至6，121℃灭菌15min。

(2)将步骤(1)得到的发酵液通过6000g离心20min，收集菌体，清洗三次，分装，沉淀，冷冻干燥即得辅助发酵剂。

菌种量测定

实施例四以植物乳杆菌st-iii在乳中的生长为例

步骤如下：

(1)将植物乳杆菌st-iii接种于mrs培养基中，在温度37℃下培养18-22h，如此传代培养2-3次得到活化的菌种；所述的mrs液体培养基组成如下：10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、1g吐温80、200mg硫酸镁、54mg硫酸锰以及1000ml蒸馏水，调节ph至6.5，121℃灭菌15min。

(2)对步骤(1)得到的培养物，通过离心收集菌体，经蒸馏水清洗三次后进行分装，分装以后的菌体沉淀经冻干后保存。离心之前取少量样品通过平板倾注的方法进行细胞计数。计数结果用于调整两种发酵菌种的接种数量及比例。其中离心、清洗和分装均为本领域常规操作。

(3)制备乳样品：按全脂乳粉或脱脂乳粉10％、蔗糖5％，用蒸馏水调到100ml配制复原乳，或在鲜牛乳中加入终浓度为5％的蔗糖，充分溶解后于95℃灭菌5-10min，冷却至40-45℃待用。

(4)取步骤(2)中所得的植物乳杆菌st-iii的冻干菌体和本发明的辅助发酵剂，分别以1ml灭菌后的乳样品充分重悬后将植物乳杆菌以10⁷cfu/ml，肠膜明串珠菌以3×10⁶cfu/ml的比例转接到步骤(3)中所得的100ml乳样品中，搅拌均匀后静置37℃下发酵至ph4.8±0.05结束发酵(约需24h)，得到植物乳杆菌st-iii发酵乳样品。

(5)对(4)中的发酵乳样品进行取样作为样本3，经梯度稀释后以平板计数法进行计数。

样本1为步骤(4)的乳样品中仅添加本发明的辅助发酵剂，或接种肠膜明串珠菌bd01710；样本2为步骤(4)的乳样品中仅接种植物乳杆菌st-iii。三分样品经发酵后，分别经梯度稀释后以平板计数法进行计数，测量菌种量。测定结果如表1。对于接种了植物乳杆菌st-iii的发酵乳样品2和样品3，其凝乳效果如图1，可见有明显凝乳。

表1：发酵乳样本的ph值及发酵乳中的活菌数

实施例五以短双歧杆菌在乳中的生长为例

该实施例五与实施例四的不同之处在于将步骤(1)中的植物乳杆菌st-iii替换为短双歧杆菌(bifidobacteriumbreve)和/或长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)的组合，最终制得含有双歧杆菌发酵乳样品。其针对菌种的不同添加组合，不同乳样品经发酵后的凝乳效果如图2，可见添加有本发明的辅助发酵剂的乳样品中凝乳效果明显。

实施例六以植物乳杆菌st-iii在紫薯提取液中的发酵为例

步骤如下：

(1)将植物乳杆菌st-iii接种于mrs培养基中，在温度37℃下培养18-22h，如此传代培养2-3次得到活化的菌种；所述的mrs液体培养基组成如下：10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、1g吐温80、200mg硫酸镁、54mg硫酸锰以及1000ml蒸馏水，调节ph至6.5，121℃灭菌15min。

(2)对步骤(1)得到的培养物，通过离心收集菌体，经蒸馏水清洗三次后进行分装，分装以后的菌体沉淀经冻干后保存。离心之前取少量样品通过平板倾注的方法进行细胞计数。计数结果用于调整两种发酵菌种的接种数量及比例。其中离心、清洗和分装均为本领域常规操作。

(3)紫薯提取液的制备：取新鲜紫薯，洗干净后切成小块，加入纯净水浸泡2小时后以榨汁机压榨，100目纱布过滤取汁，煮沸5min，8000g离心10min取上清，加入终浓度为5％(w/v)的蔗糖，加热溶解后冷却至室温，以食用级碱调节ph至7.0，95℃灭菌10min，冷却至室温，即得无菌的紫薯提取液。

(4)取步骤(2)中所得的植物乳杆菌st-iii的冻干菌体，以1ml蒸馏水充分重悬后将植物乳杆菌以10⁷cfu/ml，肠膜明串珠菌以10⁷cfu/ml的比例转接到步骤(3)中所得的100ml紫薯提取液中，搅拌均匀后静置37℃下发酵24h，即可得到发酵紫薯汁样品。

(5)对步骤(4)中的发酵样品进行取样，经梯度稀释后以平板计数法进行计数。与相同条件下仅接种植物乳杆菌st-iii进行比较，其结果如表2。可见本发明的辅助发酵剂对植物乳杆菌st-iii在紫薯提取液中的发酵过程具有促进作用。

表2

本发明的辅助发酵剂在发酵制品中的应用

在制备发酵乳制品或发酵果蔬汁制品时，将本发明的辅助发酵剂与发酵剂按1:9-9:1比例加入到原料乳中，其余步骤与现有发酵制品制备步骤及条件一致，为本领域常规操作。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落雨本申请所附权利要求书所限定的范围。