一种用于稻瘟病菌培养、产孢的培养基及其制备方法与流程

本发明涉及微生物培养技术领域，具体涉及一种用于稻瘟病菌培养、产孢的培养基及其制备方法。

背景技术：

稻瘟病是水稻的首要病害，其病原微生物是灰梨孢(phyriculariagrisea)，属于半知菌，丝孢纲；其有性世代称灰色大口球菌(magnaporthegrisea)。在水稻品种抗病性研究、稻瘟病菌生理小种鉴定等试验工作中，菌种培养和分生孢子的获得是必要的技术环节，因而稻瘟病菌的培养效果、产孢效率对实验工作具有直接影响。

现有技术中，用于稻瘟病菌培养和产孢的培养基普遍以高粱、稻秸、大麦、小麦等成分直接混配得到，此类培养基不仅配制繁琐，而且病菌生长较慢、产孢效果不理想，同时存在着易受杂菌污染的问题。尽管也有部分研究者采用燕麦片培养基、米糠培养基、粗面粉培养基、玉米粉培养基、酵母淀粉培养基等用于产孢实验，但普遍上仍存在着产孢效果不理想或材料不易获得等技术问题。

技术实现要素：

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种用于稻瘟病菌培养、产孢的培养基及其制备方法，以解决现有技术中常规培养基对稻瘟病菌的培养效果不佳、产孢效率较低的技术问题。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案

一种用于稻瘟病菌培养、产孢的培养基，是由等体积的稻秸浸出液与pda培养基混合而成的；其中所述稻秸浸出液是稻秸与水按3:100(g:ml)的比例混合后，浸泡16～24h所得的浸泡液；所述pda培养基包括以下重量份的成分：马铃薯200份，葡萄糖20份，水1000份。

作为优选，述pda培养基还包括18重量份的琼脂。

作为优选，所述稻瘟病菌是中国稻瘟病菌小种zb13。

同时，本发明提供了上述用于稻瘟病菌培养、产孢的培养基的制备方法，包括以下步骤：

1)取稻秸与水按3:100(g:ml)的比例将二者混合，浸泡16～24h，得到稻秸浸出液；

2)将200重量份的马铃薯、20重量份的葡萄糖、1000重量份的水混合后煮沸15分钟，用纱布过滤，取滤液；

3)将步骤1)所得的稻秸浸出液与步骤2)所得的滤液按1:1体积比混合，向该混合物中加入步骤2)中所用水重量18‰的琼脂，加热溶解。

在以上技术方案中，所述稻瘟病菌是指灰梨孢(phyriculariagrisea)或灰色大口球菌(magnaporthegrisea)。

在此基础上，本发明给出了该培养基用于稻瘟病菌产孢的应用，包括以下步骤：挑取稻瘟病菌菌株接种到培养基平板上，于28℃恒温培养，待平板上菌丝长满后(约7d)，移置于室内组织培养架上黑光灯光照培养3d，室温25～28℃；待充分产孢后，每皿用15ml蒸馏水洗下孢子，100倍显微镜下计算孢子数量。

本发明提供了一种用于稻瘟病菌培养、产孢的培养基及其制备方法。该技术方案通过实验方法对培养基成分进行了创新性设计，以生长速率、产孢量等为依据考察了多种复配成分对稻瘟病菌生长的影响。实验结果表明，由稻秸浸出液与pda培养基按等体积混合所得的培养基对稻瘟病菌具有显著的促生长作用，同时产孢量也处于较高水平；对比发现，利用单成分的稻秸浸出液或pda培养基培养稻瘟病菌时产孢量均处于较低水平，而将二者以特定比例混合所得的本发明培养基，稻瘟病菌产孢量得到了显著提升，由此可见，本发明的特定复配方式对促进稻瘟病菌产孢产生了确切的增效作用。本发明培养基对稻瘟病菌的培养效果良好、产孢量突出，同时材料易得、配制简便，具有良好的使用效果。

附图说明

图1是本发明具体实施方式中同一稻瘟病菌株在不同培养基上生长速度的比较图。

图2是本发明具体实施方式中同一稻瘟病菌株在不同培养基上产孢量的比较图。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

1、材料与方法

1.1菌株

稻瘟病菌1-10(zb13)，江西省农科院有害生物控制重点实验室保存。

1.2供试培养基

稻秸浸出液：30g稻秸剪碎用1000ml清水浸泡16-24h；

土豆浸出液：200g土豆去皮切碎用1000ml清水浸泡2h；

稻秸玉米粉培养基：稻秸30g，玉米粉20g，琼脂18g，清水1000ml；

pda培养基：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂18g，清水1000ml；

燕麦片培养基:燕麦片50g，蔗糖20g，琼脂16g，水1000ml；

配组1：稻秸浸出液+土豆浸出(1:1)(每1000ml加琼脂18g)；

配组2：稻秸浸出液+pda培养基(1:1)；

配组3：稻秸玉米粉培养基+土豆浸出液(1:1)；

配组4：稻秸玉米粉培养基+pda培养基(1:1)；

配组5：稻秸玉米粉培养基；

配组6：pda培养基；

配组7：稻秸浸出液培养基(每1000ml加琼脂18g)；

配组8：燕麦片培养基。

1.3产孢方法

将已纯培养的供试菌株挑取相同大小的菌块接种到供试8种配方培养基的培养皿(9cm)上，放置在28℃恒温箱中培养。待平板上菌丝长满后(约7d)，移置于室内组织培养架上黑光灯光照培养3d，室温25～28℃。等到充分产孢后，每皿用15ml蒸馏水洗下孢子，100倍显微镜下计算孢子数量。

1.4同一菌株在不同配方培养基上产孢量的比较

供试菌株1-10(由本实验室保存)在pda培养基上活化后，用打孔器获得直径5mm成熟度一致的菌碟，接种于不同配方培养基中央，28℃培养7d，再置于黑光灯下照射3d，用15ml灭菌水洗下表面菌丝，尼绒纱布过滤，即获得稻瘟菌分生孢子悬浮液，用100倍显微镜观察，计算一个视野下孢子的数量，重复3次，取平均值进行比较。

1.5同一菌株在不同产孢培养基上生长速度的比较

供试菌株1-10在不同配方培养基上培养恒温培养箱28℃培养7d后，量取菌落直径，计算稻瘟菌生长速度，重复3次，取平均值进行比较。

1.6菌落生长速度的计算

菌落直径(cm)＝菌落直径总长度(cm)—接种菌碟直径(5mm)

2结果与分析

2.1同一菌株在不同配方培养基上生长速率的比较

将供试菌株1-10在pda培养基上活化后，用打孔器获得直径5mm成熟度一致的菌碟，接种于不同配组成分的培养基中央，28℃恒温培养7d后测定菌落直径结果，比较相同菌株在不同配组成分培养基上的生长情况，实验结果见表1、图1。

由表1，图1显示，8种不同配组的培养基对稻瘟病菌的培养速度有显著差异。供试菌株1-10在培养基配组1、配组2、配组3、配组4、配组5、配组6、配组7、配组8上28℃恒温培养7d的平均菌落直径大小分别为7.66cm、7.62cm、7.38cm、7.51cm、6.45cm、7.39cm、5.27cm、7.36cm，配组1、配组2与配组4菌株生长最好，三者之间无显著差异，配组3、配组6与配组8培养菌株速度次之，再其次为配组5，配组7最差。

表1同一菌株在不同配组培养基上的生长速度比较结果

注：表中小写字母表示在5％概率下的差异显著性分析结果

2.2同一菌株在不同配方培养基上产孢量的比较

将供试菌株1-10在pda培养基上活化后，用打孔器获得直径5mm成熟度一致的菌碟，接种于不同配方培养基中央，28℃培养7d，再置于黑光灯下照射3d，用15ml灭菌水洗下一个培养皿中表面菌丝，尼绒纱布过滤，即获得稻瘟菌分生孢子悬浮液，用100倍显微镜观察，计算一个视野下孢子的数量，重复3次，取平均值进行比较。

实验结果由表2、图2可知，供试菌株1-10在8种不同配组的培养基上产孢量相差比较大，差异性显著。利用培养基配组1、配组2、配组3、配组4、配组5、配组6产孢在一个显微视野下的平均孢子数分别为35.3个、50.3个43.3个35.6个、44.6个、19.3个、22.6个、37.3个。配组2产孢最好，其次为配组3和配组5，再其次为配组1、配组4与配组8，配组6与配组7产孢最差。

表2同一菌株在不同配组培养基上的产孢量比较结果

注：表中小写字母表示在5％概率下的差异显著性分析结果

2.3配组2与燕麦片培养基、大麦粒培养基培养、产孢的优势比较

燕麦片培养基、大麦粒培养基培养是当前最常用的稻瘟病菌产孢培养基，利用配组2、燕麦片培养基、大麦粒培养基各培养供试菌株1-10并产孢，比较整个产孢周期长度，产孢量，经济成本。配组2、其中产孢量的比较利用燕麦片培养基各1l培养基制成50个培养平板培养稻瘟病菌并产孢，并用1000ml无菌水洗下所有平板上的菌丝、孢子，用双层纱布过滤获得孢子悬液，100倍显微镜下镜检孢子数，记录一个视野下的孢子数量，重复3次，取平均值。用容器量取1l的大麦粒做成大麦粒培养基，接种供试稻瘟病菌产孢，产孢后用1000ml洗下大麦粒上的稻瘟病菌孢子，双层纱布过滤，100倍显微镜下镜检孢子数，记录一个视野下的孢子数量，重复3次，取平均值。

表3三种不同培养基培养稻瘟病菌产孢比较

注：“+”表示成本的高低以及来源的难易程度，“+”越多表示成本越高，原料来源越难易获得。

从表3可知，三种培养基配组2、燕麦片培养基、大麦粒培养基整个产孢周期所需要的天数分别为10天、12天、15天，平均产孢量每个显微视野下分别为42个、32个、35个。可见配组2在产孢量与产孢周期上都要优于燕麦片培养基、大麦粒培养基，综合培养基原料的经济成本与获得难易程度，我们认为配组2比当前常用的培养基在稻瘟病菌培养产孢上更具优势。

3、结论

在本实验配制的8种稻瘟病菌培养、产孢培养基中，配组2具有稻瘟病菌生长快，产孢量大的特点，各项指标优于其它配制培养基。

配组2主要配方是配组6与配组7的复合物，配组2对稻瘟病菌的培养速度与配组6相当，远快于配组7；稻瘟病菌在配组2产孢量比在配组6、配组7上分别提高了160.62％、122.57％，可见配组2的组合比原配组培养基在产孢能力上具有巨大的增效作用。

本实验中配组2的成分及制作方法如下：稻秸浸出液：

(1)30g稻秸剪碎用1000ml清水浸泡16-24h；

(2)pda培养基：土豆200g,葡萄糖20g,琼脂18g,清水1000ml；先将土豆200g,葡萄糖20g，清水1000ml煮沸15分钟纱布过滤配制成营养液；

(3)将稻秸浸出液与(2)配制的营养液按1:1配成混合营养液，再按每1000ml营养液加入琼脂18g加热溶解、灭菌后倒平板，最终完成培养基平板的制作。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。