人肺炎支原体分离培养基及培养方法与流程

本发明涉及支原体分离培养领域，具体涉及一种人肺炎支原体分离培养基slb，以及这种培养基的培养方法。

背景技术：

人肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae，mp)是儿童常见的社区获得性肺炎(communityacquiredpneumoniacap)的主要病原体之一，它不仅可以通过侵犯呼吸道引起喉炎、咽炎、支气管炎和非典型肺炎，也可以诱发和加重儿童喘息。人肺炎支原体感染后亦可通过复杂免疫反应机制形成肺外并发症。临床研究证实耐大环内酯类人肺炎支原体感染可形成致死性肺炎(fatalpneumoniafp)，具有临床症状持续时间长，临床症状重及肺外并发症多等特点。

人肺炎支原体营养要求较高，曾称为″难养菌″。人肺炎支原体为二元分裂，倍增时间超过6小时，如此之长的倍增时间使人肺炎支原体培养成为一个漫长的过程，远远大于细菌。此外，人肺炎支原体基因组较小，其本身未发现氨基酸合成的基因，同时也缺乏合成复杂细胞壁结构的大量基因。涉及dna修复、dna重组、细胞分裂及蛋白分泌的基因数量也比普通细菌少。较小的基因组以及有限的生物合成能力限制了人肺炎支原体生物合成和代谢能力，导致需要非常复杂的培养基添加成分才能在体外进行分离培养。

人肺炎支原体的分离培养难度较大，分离培养基的制备尤为重要。目前，人肺炎支原体基础培养基主要有两种：pplo及sp-4基础培养基，但一般认为sp-4培养基用于分离mp时效果更好，血清提供重要的营养物质，其中使用最多的为小牛血清及马血清，马血清由于其胆固醇含量较高而成为优选，但本实验室曾用gibco的马血清进行培养，发现效果不佳，变黄样本少且培养时间较长。

对于临床样本的人肺炎支原体分离培养，一定还要加入适量的抗生素抑制杂菌的生长，通常添加的是青霉素g及醋酸铊。此外，在液体培养基中加入酚红作为指示剂，支原体代谢葡萄糖产酸，当培养基颜色由红变黄时，即可判定mp的生长。但实际上支原体的分离培养困难，培养周期长。当液体培养基变黄明显后，涂皿可见″油煎蛋″状支原体典型菌落。

目前国内有关mp的分离培养基大多存在特异性差、易污染杂菌、假阳性率高等问题，大多数临床样本经培养后浑浊有沉淀，因而不能判断是否感染人肺炎支原体，国内各实验室大多使用进口的支原体分离培养基，价格昂贵。因此发明一种人肺炎支原体生长更迅速和特异性更高的临床用人肺炎支原体分离培养基，对于人肺炎支原体的研究和诊断具有重要应用价值。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种特异性强、生长速度快、分离率高的人肺炎支原体分离培养基。

本发明的另一目的是提供这种培养基的培养方法。

本发明所述的人肺炎支原体分离培养基命名为人肺炎支原体分离培养基slb，包括基础培养基、马血清、抗生素及其它添加成分，其组分分别为：

一、基础培养基560ml：支原体肉汤培养基2.5-5g，细菌蛋白胨4.5-6g；细菌用胰蛋白胨8-12g，酵母提取物4-6g，0.2％酚红10ml，加入纯水定容至560ml，用1mnaoh调节ph值至7.5-7.7后115℃高压灭菌30分钟；

二、马血清：50-200ml，56℃灭活30min；

三、抗生素4ml：加入1ml青霉素g使其终浓度为250-600units/ml，1ml醋酸铊使其终浓度为0.1mg/ml，1ml多粘菌素b使其终浓度为2-3.5units/ml，1ml两性霉素使其终浓度为2-3.5μg/ml；

四、其它添加成分386-236ml：含谷氨酰胺的cmrl1066组织培养补充成分3～5.5g，葡萄糖1～20g，酵母冷浸粉1.1～2.5g，加入纯水定容为386-236ml，用0.22μm孔径滤膜过滤除菌；加入的马血清及其它添加成分总体积为436ml；

五、用1mnaoh调节最终ph值为7.4-7.6。

所述的马血清可以为现有马血清，也可以是自制马血清。

所述的自制马血清制备方法如下：

一、健康马匹的选择：选择5-8岁龄、无外伤、未注射过抗生素的健康雄性马匹；

二、采血：按顺序进行马匹颈部表面消毒→剃毛→再次消毒→剥离静脉血管→消毒进针→无菌操作，将采血管沿瓶壁接血至500ml采血瓶中，每瓶装400ml；

三、血清分离：将采血瓶放入37℃恒温箱1.5-2.5h→4℃放置2-4h→3000rpm40min离心一次→4℃过夜→无菌操作吸取上清黄色液体→-20℃冻存；

四、血清的过滤除菌：解冻血清→0.45μm孔径滤柱过滤→0.22μm孔径滤柱过滤→0.1μm孔径滤柱过滤→-20℃冻存。

本发明所述的人肺炎支原体分离培养基slb的分离培养方法包括下列步骤：

一、将临床样本接种于所述的液体培养基中培养，培养条件为37℃，5％co2培养箱；

二、培养6-24h后对步骤一样本继续按体积百分比10％比例盲传至该培养基；

三、对步骤二样本培养3-10天后观察，若有沉淀则用0.45μm孔径滤膜过滤后继续按体积百分比10％比例盲传至该培养基并勤观察其颜色变化；若无沉淀则观察培养基颜色；得初步判定人肺炎支原体临床分离株结果；

四、对步骤三初步分离株样本进行继续盲传、接种固体培养基培养3-7天，观察培养基颜色变化、菌落形态及pcr鉴定3种处理，得最终判定分离结果。

所述的初步判定人肺炎支原体临床分离株结果的标准为：若液体培养基明显由红变黄且清澈透明无沉淀及漂浮物，可以初步判断分离到人肺炎支原体临床分离株；所述的最终判定分离结果的标准为：若盲传后液体培养基再次明显由红变黄且清澈透明无沉淀及漂浮物，固体培养基上有″油煎蛋″样菌落生长且pcr为阳性者，最终判定为成功分离到人肺炎支原体临床分离株。

与现有国内人肺炎支原体分离培养基相比，本发明具有以下优点及有益效果：

本发明的培养基使用自制马血清，主要提供支原体不能自身合成的胆固醇和长链脂肪酸及血清蛋白，其营养成分比商用马血清更丰富，用于培养人肺炎支原体，生长速度明显加快，有利于人肺炎支原体的分离培养。本发明的培养基使用的自制马血清，其胆固醇含量较一般小牛血清高，能有效促进支原体细胞生长繁殖及细胞膜的合成。

本发明的培养基添加葡萄糖，能有效促进支原体细胞生长繁殖，尤其是当葡萄糖含量达到1％时，支原体生长速度明显加快，变黄时间缩短。

本发明的培养基添加4种抗生素，能有效抑制其它杂菌的生长且对人肺炎支原体生长影响较小。为了避免分离物中细菌污染，培养基中添加青霉素g和醋酸铊，前者抑制革兰氏阳性菌，后者抑制革兰氏阴性菌。此外添加多粘菌素b及两性霉素能有效抑制革兰氏阴性菌和真菌生长，使得污染率明显降低，从而有效降低假阳性率，特异性高。

本发明的培养基选择性好，特异性强，生长速度快，分离率高。对培养后液体培养基明显由红变黄且清澈透明无沉淀的样本，涂皿于固体培养基上基本可见″油煎蛋″样菌落生长，pcr结果为阳性。

本发明所述的slb培养基配方，适用于人肺炎支原体临床株的分离培养，分离到的菌株可稳定传代。

附图说明

图1为人肺炎支原体标准菌株atcc29342菌落的显微镜图(×100)。

图2人肺炎支原体临床分离株菌落的显微镜图(×100)。

图3人肺炎支原体临床分离株pcr电泳图。

附图说明：图3中是对12株分离样本采用人肺炎支原体常规引物进行pcr，结果得到144bp大小的条带，分离得到的12株样本pcr鉴定结果为人肺炎支原体。图中1-12：人肺炎支原体临床分离菌株；13：atcc15531；14：atcc29342；15：阴性对照、m：dnamarkerdl5000。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1：

人肺炎支原体分离培养基slb的配制：

基础培养基：支原体肉汤培养基3.5g，细菌蛋白胨5.3g；细菌用胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5g，0.2％酚红10ml，加入纯水定容至560ml，混匀后调节ph到7.6，115℃灭菌30min，待冷却后备用。

马血清：解冻200ml马血清，56℃灭活30min。

马血清的制备方法如下：

①健康马匹的选择：选择5-8岁龄、无外伤、未注射过抗生素的健康雄性马匹。

②采血：按顺序进行马匹颈部表面消毒→剃毛→再次消毒→剥离静脉血管→消毒进针→无菌操作将采血管沿瓶壁接血至500ml采血瓶中，400ml/瓶。注：采血瓶先用少量生理盐水润湿，采血过程不能冲击起气泡，轻拿轻放，否则红细胞破碎产生溶血影响血清的质量。

③血清分离：将采血瓶放入37℃恒温箱2h→4℃放置2-4h→3000rpm40min离心一次→4℃过夜→无菌操作吸取上清黄色液体→-20℃冻存。

④血清的过滤除菌：解冻血清→0.45μm孔径滤柱过滤→0.22μm孔径滤柱过滤→0.1μm孔径滤柱过滤→-20℃分装冻存。

抗生素：预先配制500000units/ml青霉素g，10％醋酸铊，2500units/ml多粘菌素b，2.5mg/ml两性霉素4种抗生素，每种抗生素配好后分别用0.22μm孔径滤膜过滤除菌后分装保存待用；使用时在1l培养基中分别添加上述1ml青霉素g，1ml醋酸铊，1ml多粘菌素b，1ml两性霉素。

其它添加成分：合谷氨酰胺的cmrl1066组织培养补充成分5g，葡萄糖10g，酵母冷浸粉2g，加入纯水定容至236ml，混匀后用0.22μm孔径滤膜过滤除菌，现配现用。

用1mnaoh调节最终ph值为7.5。

将上述成分混匀后，按2ml/管分装至无菌西林瓶待用。

使用本实施例所配制的人肺炎支原体分离培养基slb，分离培养云南省玉溪市儿童医院及昆明市中医医院住院患儿的咽拭子样本，具体培养方法如下：

一、将咽拭子接种于本实施例所配制的人肺炎支原体分离培养基slb中培养，培养条件为37℃，5％co2培养箱。

二、培养6-24h后对步骤一样本继续按体积百分比10％比例盲传至本实施例所配制的人肺炎支原体分离培养基slb。

三、对步骤二样本培养3-10天后观察，若有沉淀则用0.45μm孔径滤膜过滤后继续按体积百分比10％比例盲传至本实施案例所配制的人肺炎支原体分离培养基slb并勤观察其颜色变化；若无沉淀则观察培养基颜色，得初步判定人肺炎支原体临床分离株结果。

四、对步骤三初步判定为人肺炎支原体阳性分离株样本进行继续盲传、接种固体培养基培养3-7天，观察培养基颜色变化、菌落形态及pcr鉴定3种处理，得最终判定分离结果。

五、所述的初步判定人肺炎支原体临床分离株结果的标准为：若液体培养基明显由红变黄且清澈透明无沉淀及漂浮物，可以初步判断分离到人肺炎支原体临床分离株；所述的最终判定分离结果的标准为：若盲传后液体培养基再次明显由红变黄且清澈透明无沉淀及漂浮物，固体培养基上有″油煎蛋″样菌落生长且pcr为阳性者，最终判定为成功分离到人人肺炎支原体临床分离株。其中pcr采用人肺炎支原体常规引物：

前引物5'-gaagcttatggtacaggttgg-3’；

后引物5'-attaccatccttgttgtaagg-3’；

扩增片段大小为144bp。所述的实验结果见表1，图2，图3。

表1人肺炎支原体临床分离菌株——咽拭子样本结果

结果表明：使用实施例1所配制的人肺炎支原体分离培养基slb分离培养2017年9月云南省玉溪市儿童医院及昆明市中医医院住院患儿的196份咽拭子标本，培养6-24h后大部分变黄，疑是杂菌生长，继续盲传培养3-10天后得到4株液体培养基明显由红变黄且清澈透明无沉淀样本，将这些样本涂皿于固体培养基培养3天后，可见有″油煎蛋″样菌落生长，pcr结果显示全部为阳性，测序结果表明分离株全部为人肺炎支原体菌株。表明该人肺炎支原体分离培养基slb抑制杂菌效果好，特异性强，分离率高。但人肺炎支原体临床分离株菌落形态明显比标准株小，可能是由于从人体分离并转移到一个新的培养基中，还未完全适应新的生长环境。

使用本实施例所配制的人肺炎支原体分离培养基slb，分离培养云南省玉溪市儿童医院及昆明市中医医院住院患儿的痰样本，具体培养方法如下：

一、将痰样本用痰稀释液稀释后取0.5ml接种于本实施案例所配制的人肺炎支原体分离培养基slb中培养，培养条件为37℃，5％co2培养箱。

二、培养18-24h后对步骤一样本继续按10％比例盲传至本实施案例所配制的人肺炎支原体分离培养基slb，所述的百分比为体积百分比。

三、对步骤二样本培养3-10天后观察，若有沉淀则用0.45μm孔径滤膜过滤后继续按10％比例盲传至本实施案例所配制的人肺炎支原体分离培养基slb并勤观察其颜色变化，所述的百分比为体积百分比；若无沉淀则观察培养基颜色，得初步判定人肺炎支原体临床分离株结果。

四、对步骤三初步判定为人肺炎支原体阳性分离株样本进行继续盲传、接种固体培养基培养3-7天，观察培养基颜色变化、菌落形态及pcr鉴定3种处理，得最终判定分离结果。

五、所述的初步判定人肺炎支原体临床分离株结果的标准为：若液体培养基明显由红变黄且清澈透明无沉淀及漂浮物，可以初步判断分离到人肺炎支原体临床分离株；所述的最终判定分离结果的标准为：若盲传后液体培养基再次明显由红变黄且清澈透明无沉淀及漂浮物，固体培养基上有″油煎蛋″样菌落生长且pcr为阳性者，最终判定为成功分离到人肺炎支原体临床分离株。其中pcr采用人肺炎支原体常规引物：

前引物5'-gaagcttatggtacaggttgg-3’；

后引物5'-attaccatccttgttgtaagg-3’；

扩增片段大小为144bp。所述的实验结果见表2，图2，图3。

表2人肺炎支原体临床分离菌株——痰样本结果

结果表明：使用实施例1所配制的人肺炎支原体分离培养基slb分离培养2017年9月云南省玉溪市儿童医院及昆明市中医医院住院患儿的233份痰样本，培养3-10天后得到8株液体培养基明显由红变黄且清澈透明无沉淀样本，将这些样本涂皿于固体培养基培养3-7天，可见有″油煎蛋″样菌落生长，pcr结果显示全部为阳性，测序结果表明分离株全部为人肺炎支原体菌株。表明该人肺炎支原体分离培养基slb抑制杂菌效果好，特异性强，分离率高。同时发现痰样本分离率较高，可能是痰样中人肺炎支原体含量较咽拭子高或取样量较大，但人肺炎支原体临床分离株菌落形态明显比标准株小，可能是由于从人体分离并转移到一个新的培养基中，还未完全适应新的生长环境。

对分离样本涂皿固体培养基培养72h观察到″油煎蛋″样菌落，结果如图1、图2所示。