一种用于体细胞去分化的靶点调控系统、试剂盒及应用的制作方法

本发明涉及细胞生物学，组织工程和再生医学领域，尤其涉及一种用于体细胞去分化的靶点调控系统、试剂盒及应用。

背景技术：

干细胞是人体及其各种组织细胞的来源，在人类疾病的细胞治疗、再生医学、组织工程、药物研发、抗衰老、美容等诸多领域研究中均具有重要意义。但由于胚胎干细胞存在伦理问题与安全隐患；各种类型的成体干细胞数量稀少、来源有限、难以富集、获取过程复杂、受供体健康状态限制、细胞易老化、无法大量传代扩增等局限，因而均未能广泛应用。多种分化的细胞如皮肤成纤维细胞具有来源丰富、易于获取并易于在体外长期大量扩增培养的优点。近年来，利用细胞重编程技术已经可以把分化的细胞如皮肤成纤维细胞直接诱导为成肌细胞、神经元、肝细胞、成骨细胞等多种不同类型的功能细胞，或先诱导为多能干细胞后，再进一步定向诱导为相应的功能细胞。研究表明，采用细胞重编程技术获得的目标细胞不再保持源细胞的基因表达谱等分子特征与细胞功能，而获得了相应目标细胞的稳定典型的分子特征与细胞功能，目前已逐渐应用于疾病模型研究、临床治疗研究与组织工程研究，具有广阔的应用前景。

实现高效、快速、特异性的细胞重编程，需要根据源细胞的分子特征使之同时或分步与一种或几种外源性dna或/和rna或/和转录因子或/和重组蛋白或/和细胞因子或/和胞外基质或/和小分子化合物及其组合接触，以便能按时序激活/抑制能决定细胞表型的关键细胞信号通路/网络，最终实现既定方向的细胞重编程，获得目标细胞。

目前文献已见众多关于不同类型分化的细胞不同重编程方案的报道，具体涉及不同的dna或/和rna或/和转录因子或/和重组蛋白或/和细胞因子或/和胞外基质或/和小分子化合物及其组合类型。其中需要导入外源性基因的细胞重编程方案已相对较为确定，但完全采用小分子化合物诱导的细胞重编程特别是转分化方案却远未成熟稳定。如申请号为201410075246.5的中国专利申请提供了一种把分化的细胞诱导转分化为神经干细胞的方法及其应用。具体地，该申请涉及采用组蛋白去乙酰化酶(hdacs)抑制剂、糖原合成酶激酶(gsk-3)抑制剂和转化生长因子β(tgf-β)信号通路抑制剂的组合，在正常生理低氧环境下诱导成纤维细胞、上皮细胞等分化的细胞转分化为具有良好多能性及传代稳定性的神经干细胞。申请号为201610213644.8的中国专利申请提供了一种诱导成纤维细胞转分化为心肌细胞的诱导培养基、方法及其应用，所述诱导培养基包含基础培养基和诱导小分子组合，所述诱导小分子组合为6tcfow或scfov，其中6为e61541、t为苯环丙胺、c为chir99021、f为毛喉素、o为dorsomorphin、w为iwr-1、s为sb431542、v为丙戊酸。该申请诱导培养基能够将成纤维细胞诱导转分化为心肌细胞。目前，通过采用单纯小分子化合物或其组合诱导人类分化的细胞如皮肤成纤维细胞获得施旺细胞(thomaec，etal，2014)、神经细胞(huw，etal，2015)、胰岛细胞(shengding，etal，2015)的成果已陆续见诸报道，但上述研究仍存在实验不易重复、效率不高、转分化系统成份欠清楚作用欠稳定等问题。由于完全采用小分子诱导体细胞转分化较ips等细胞重编程技术具有更高的安全性、稳定性与临床实用性，因而研发对采用小分子诱导体细胞转分化为功能性目标细胞策略具有明确作用、成份清晰、靶点清楚、高效廉价、成熟稳定、易于质控及规模化生产的基础性诱导系统对科学研究及行业发展均十分重要。

技术实现要素：

本发明提供了一种用于体细胞(分化的细胞)重编程的靶点调控系统、试剂盒及应用。本发明为了提高细胞去分化和/或重编程的效率，提高细胞活力，提高转分化的效率。

本发明提供了一种靶点调控系统，所述靶点调控系统对体细胞进行以下调控：抑制pkc活性，以及抑制dnmt活性和/或抑制hmt活性和/或抑制组蛋白去甲基化酶活性；对应调控的关键靶点包括pkc，以及dnmt和/或hmt和/或组蛋白去甲基化酶；所述的体细胞为分化的细胞。

进一步地，所述靶点调控系统还对体细胞进行以下调控：抑制tgf-β的信号通路，激活wnt/β-catenin信号通路和激活camp信号通路；作为优选，所述tgf-β信号通路为i型tgf-β受体参与的信号通路；所述的camp信号通路为epac/rap1信号通路。

对应调控的关键靶点进一步包括tgf-β受体，wnt/β-catenin和camp。

进一步地，所述靶点调控系统还对体细胞进行以下调控：抑制rock(rho-associatedproteinkinase)的信号通路，和/或抑制jnk的信号通路，和/或抑制dna甲基转移酶(dnamethyltransferas，dnmt)的活性，和/或激活ra(retinoicacidreceptor)信号通路，和/或抑制赖氨酸脱乙酰基酶活性，和/或抑制组蛋白去甲基化酶的活性和/或抑制组蛋白甲基转移酶(hmt)的活性；

对应调控的关键靶点进一步包括rock，和/或jnk，和/或dna甲基转移酶，和/或rar受体，和/或赖氨酸脱乙酰基酶，和/或hmt，和/或组蛋白去甲基化酶。

所述靶点调控系统包括调控所述关键靶点的细胞因子，小分子化合物，转录因子，胞外基质，重组蛋白，dna和rna中的至少一种。

进一步地，所述靶点调控系统包括调控所述关键靶点的小分子化合物组合，所述小分子化合物组合包括pkc抑制剂，以及dnmt抑制剂、hmt抑制剂和组蛋白去甲基化酶抑制剂中的至少一种。

所述小分子化合物组合还包括tgf-β受体抑制剂，wnt/β-catenin激动剂和camp激动剂。

所述小分子化合物组合还包括rock抑制剂，jnk抑制剂，dna甲基转移酶抑制剂，rar受体激动剂，赖氨酸脱乙酰基酶抑制剂，组蛋白去甲基化酶抑制剂，组蛋白甲基转移酶(hmt)抑制剂和ascorbate中的至少一种。

所述赖氨酸脱乙酰基酶抑制剂包括sodiumphenylbutyrate，butyrate，sodiumbutyrate，mc1568，ci994(tacedinaline)，chidamide，cay10683(santacruzamatea)，cudc-907，m344(histonedeacetylaseinhibitoriii)，laq824(nvp-laq824，dacinostat)，pracinostat(sb939)，vpa，scriptaid，apicidin，lbh-589(panobinostat)，ms-275，saha(vorinostat)，trichostatin(tsa)，psammaplina，pci-24781(abexinostat)，rocilinostat(acy-1215)，mocetinostat(mgcd0103)，4-phenylbutyrate(4pb)，splitomicin，srt1720，resveratrol，sirtinol，apha，ci-994，depudecin，fk-228，hc-toxin，itf-2357(givinostat)，chidamide，rgfp966，phob，bg45，nexturastata，tmp269，cay10603，mgcd-0103，niltubacin，pxd-101(belinostat)，pyroxamide，tubacin，ex-527，batcp，cambinol，mocpac，ptach，mc1568，nch51和tc-h106中的至少一种；

所述tgf-β受体抑制剂包括616452，ly2109761，pirfenidone，repsox(e-616452)，sb431542，a77-01，tranilast，galunisertib(ly2157299)，a8301，gw788388，itd-1，sd208，sb525334，ly364947，asp3029，d4476和sb505124中的至少一种；

所述pkc抑制剂包括go6983，ro31-8220mesylate，go6976和bisindolylmaleimidei(gf109203x)中的至少一种；

所述wnt/β-catenin激动剂包括may-262611，chir98014，chir99021，licl，li2co3，td114-2，azd2858，azd1080，bio，kenpaullone，tws119，ly2090314，cbm1078，sb216763和ar-a014418中的至少一种；

所述camp激动剂包括epac/rap1的激动剂，8-bromo-camp，dibutyryl-camp，sp-8-br-camps中的至少一种；

所述epac/rap1激动剂包括forskolin，ibmx，prostaglandine2(pge2)，nkh477，8-pcpt-2′-o-me-camp，gsk256066，apremilast(cc-10004)roflumilast，cilomilast，rolipram和milrinone中的至少一种；

所述rar激动剂包括ttnpb，bexarotene，ch55，tamibarotene，retinol，am580，atra，vitamina、vitamina衍生物和13-cisra中的至少一种；

rock抑制剂包括y-27632，y-276322hcl，thiazovivin，ripasudil(k-115)，fasudil，fasudil(ha-1077)hcl，gsk429286a，rki-1447和pki-1313中的至少一种；

所述jnk抑制剂包括sp600125，jnkinhibitorix，as601245，as602801和jnk-in-8中的至少一种；

所述dnmt抑制剂包括rg108，thioguanine，5-aza-2'-deoxycytidine(decitabine)，sgi-1027，zebularine和5-azacytidine(aza)中的至少一种；

所述hmt抑制剂包括epz004777，epz5676，gsk503，bix01294和sgc0946中的至少一种；

所述组蛋白去甲基化酶的抑制剂包括parnate(tranylcypromine)，tranylcypromine(2-pcpa)hclsp2509，4sc-202，ory-1001(rg-6016)，gskj1和gsk-lsd1中的至少一种。

作为优选，所述赖氨酸脱乙酰基酶抑制剂为sodiumbutyrate和vpa的至少一种；

所述tgf-β受体抑制剂为repsox(e-616452)和sb431542中的至少一种；

所述pkc抑制剂为go6983；

所述wnt/β-catenin激动剂为chir99021和bio中的至少一种；

所述camp激动剂为forskolin和rolipram中的至少一种；

所述rar激动剂为ttnpb和am580中的至少一种；

所述rock抑制剂包括y-27632和thiazovivin中的至少一种；

所述jnk抑制剂为sp600125；

所述dnmt抑制剂为rg108和5-aza-2'-deoxycytidine(decitabine)中的至少一种；

所述hmt抑制剂为epz004777，epz5676和sgc0946中的至少一种；

所述组蛋白去甲基化酶的抑制剂为parnate(tranylcypromine)和tranylcypromine(2-pcpa)hcl的至少一种。

本发明的一些实施方案，具体小分子化合物的有效浓度如下，以下给出的浓度范围只是参考，可在此基础上做适应性修改，如果其他小分子替代以下小分子，浓度也可以做适应性调整。

forskolin浓度为2μm～20μm；repsox浓度为2～15um；chir99021浓度为1μm～10μm；vpa浓度为0.5mm～1.5mm；ttnpb浓度为3μm～8μm；am580浓度为0.03～0.08μm；epz004777浓度为3～8μm；go6983浓度为1～15μm；y-27632浓度为3～15μm，l-ascorbinacid2-phosphate浓度为0.15～0.25mm；sp600125浓度为1～15μm；5-aza-2'-deoxycytidine浓度为0.5～15μm。

本发明提供的小分子化合物组合，可通过调整其组分，浓度，作用时序获得不同的分化细胞或干细胞。

本发明还提供一种包括所述的靶点调控系统的试剂盒。

本发明还提供一种所述的靶点调控系统或权利要求9所述的试剂盒的应用。

本发明还提供一种所述的靶点调控系统或所述的试剂盒在促进体细胞去分化中的应用。

所述靶点调控系统或试剂盒用于在体内动员分化的细胞诱导产生功能性细胞及其产物，或用于在体外促进分化的细胞诱导制备功能性细胞及其产物，所述功能性细胞为另一谱系分化的细胞和/或干细胞。

所述靶点调控系统按时序分阶段诱导体细胞制备功能性细胞。

所述靶点调控系统与功能性细胞已知的定向诱导所需的化合物和/或蛋白和/或培养液共同使用，使分化的细胞诱导为功能性细胞。

所述靶点调控系统与分化的细胞接触提高其活力。

本发明还提供一种细胞产物，所述细胞产物由分化的细胞通过所述的靶点调控系统或所述的试剂盒诱导后获得。

本发明还提供所述的细胞产物及其衍生物的应用，所述细胞产物用于制备或诱导间充质干细胞的化合物组合或以其为基础的再生医学种子细胞、组织工程种子细胞(如肝细胞、成骨细胞、软骨细胞等)及其产物，可用于基础研究、临床治疗及组织工程产品研发与生产。

所述分化的细胞来源于哺乳动物如人，其中所述分化的细胞包括成纤维细胞，上皮细胞，脂肪细胞或血液细胞，优选地所述分化细胞是成纤维细胞；所述另一谱系分化的细胞包括不同胚层的分化的细胞；所述的不同胚层的分化的细胞包括：成骨细胞，软骨细胞，脂肪细胞，神经细胞，肝细胞，胰岛细胞，心肌细胞，血管内皮细胞，平滑肌细胞；所述的干细胞包括间充质干细胞。

所述靶点调控系统对分化的细胞进行定向诱导，最终制备得到血管内皮细胞；所述定向诱导包括抑制赖氨酸脱乙酰基酶(lysinedeacetylasesinhibitors，kdacis)的活性，抑制tgf-β的信号通路，激活wnt/β-catenin的信号通路，激活camp的信号通路，以及抑制dna甲基转移酶(dnmt)的活性和/或抑制组蛋白甲基转移酶的活性。

进一步地，所述定向诱导还进一步包括抑制组蛋白去甲基化酶的活性和/或抑制jnk的信号通路和/或抑制rock的信号通路和/或抑制pkc的活性和/或激活ra(retinoicacid)的信号通路。

所述靶点调控系统利用小分子化合物组合按时序分阶段诱导分化的细胞制备血管平滑肌细胞：第一阶段采用dnmt(dna甲基转移酶)抑制剂和赖氨酸脱乙酰基酶(lysinedeacetylasesinhibitors，kdacis)抑制剂中的至少一种进行诱导分化的细胞；第二阶段采用wnt/β-catenin激动剂，camp激动剂和tgf-beta受体抑制剂进行诱导得到血管平滑肌细胞。

进一步地，第二阶段还采用赖氨酸脱乙酰基酶抑制剂，rar激动剂，dnmt抑制剂，hmt(组蛋白甲基转移酶)抑制剂，pkc抑制剂，ascorbate(抗坏血酸)，jnk抑制剂，rock抑制剂和组蛋白去甲基化酶抑制剂中的至少一种诱导细胞制备得到血管平滑肌细胞。

所述靶点调控系统诱导分化的细胞制备软骨细胞：对分化的细胞进行定向诱导制备得到软骨细胞，所述定向诱导包括抑制赖氨酸脱乙酰基酶(lysinedeacetylasesinhibitors，kdacis)的活性，抑制tgf-β的信号通路，抑制pkc的活性；激活wnt/β-catenin的信号通路，激活camp的信号通路以及激活ra的信号通路制备软骨细胞，在此基础上，所述定向诱导可进一步包括抑制dna甲基转移酶(dnmt)的活性和/或抑制组蛋白甲基转移酶(histonemethyltransferase，hmt)的活性,抑制jnk的信号通路和/或抑制rock的信号通路和/或激活smad4/smad5的信号通路和/或抑制组蛋白去甲基化酶制备得到软骨细胞。

作为优选，所述靶点调控系统按时序分阶段诱导分化的细胞制备软骨细胞，所述定向诱导前进行预处理，所述预处理包括抑制tgf-β的信号通路，激活wnt/β-catenin的信号通路和激活camp的信号通路；或所述预处理包括抑制赖氨酸脱乙酰基酶的活性，抑制tgf-β的信号通路，激活wnt/β-catenin的信号通路和激活camp的信号通路。

所述靶点调控系统的小分子化合物组合按时序分阶段诱导分化的细胞制备成骨细胞：第一阶段采用tgf-β受体抑制剂，wnt/β-catenin激动剂和camp激动剂接触诱导细胞；第二阶段再采用赖氨酸脱乙酰基酶(lysinedeacetylasesinhibitors，kdacis)抑制剂，tgf-β受体抑制剂，pkc抑制剂，wnt/β-catenin激动剂和camp激动剂接触诱导细胞；第二阶段时还可加入rar激动剂，dnmt抑制剂，hmt抑制剂，ascorbate(抗坏血酸)，jnk抑制剂，rock抑制剂和组蛋白去甲基化酶抑制剂中的至少一种进行诱导细胞制备得到成骨细胞。

所述靶点调控系统诱导分化的细胞制备间充质干细胞：靶点调控系统对分化的细胞进行定向诱导，最终制备得到间充质干细胞，所述定向诱导包括抑制tgf-β的信号通路，抑制pkc的活性，激活wnt/β-catenin的信号通路以及激活camp的信号通路；进一步地，所述定向诱导还包括激活ra的信号通路和/或抑制dnmt的活性和/或抑制hmt的活性和/或抑制组蛋白去甲基化酶的活性和/或抑制jnk的信号通路和/或抑制rock的信号通路和/或抑制赖氨酸脱乙酰基酶活性，最终制备得到间充质干细胞。

所述靶点调控系统还可按时序分阶段诱导制备间充质干细胞，在定向诱导前对分化的细胞进行预处理，所述预处理包括抑制tgf-β的信号通路，激活wnt/β-catenin的信号通路和激活camp的信号通路；或所述预处理包括抑制赖氨酸脱乙酰基酶(lysinedeacetylasesinhibitors，kdacis)的活性，抑制tgf-β的信号通路，激活wnt/β-catenin的信号通路和激活camp的信号通路。

本发明的技术效果如下：采用本发明提供的靶点调控系统，可利用小分子诱导体细胞制备不同类型的功能性细胞或提高制备的效率，且作用靶点明确、成份清楚、成熟稳定、易于质控及规模化生产。

附图说明

图1为通过小分子化合物诱导，人源皮肤成纤维细胞向成骨细胞转分化的细胞形态图，其中a图为皮肤成纤维细胞；b为实施例1中的方法转分化获得的成骨细胞，并进行了茜素红的染色；c为实施例2中的方法转分化获得的成骨细胞，并进行了茜素红的染色；d为对转分化的成骨细胞，进行成骨细胞分子标志物的定量鉴定，其中hufib代表未经处理的皮肤成纤维细胞(阴性对照)，hu-ios代表转分化的成骨细胞，hu-os代表由体内msc体外诱导获得的成骨细胞(阳性对照)；

图2为通过小分子化合物诱导，人源皮肤成纤维细胞转分化为软骨细胞，其中a-d为对转分化的软骨细胞，进行软骨细胞分子标志物的定量鉴定，其中hufib代表未经处理的皮肤成纤维细胞(阴性对照)，huich代表转分化的软骨细胞，huch代表由体内msc体外诱导获得的软骨细胞(阳性对照)；经过小分子化合物组合处理后，使用传统的软骨诱导液分化14天，进行鉴定，a图和b图为透明软骨中高表达的软骨标志性基因，c图和d图为肥大软骨中高表达的基因。e图为起始的皮肤成纤维细胞,f为实施例3中的方法转分化获得的软骨细胞，并进行了阿尔辛蓝的染色。

图3为通过小分子化合物诱导人源皮肤成纤维细胞向间充质干细胞转分化的细胞形态图及多能性鉴定，其中a图为皮肤成纤维细胞；b为实施例5中的方法诱导获得的间充质干细胞；c为诱导的细胞的克隆形成率，克隆形成率越高说明细胞增值活力越好，其中hufib代表未经处理的皮肤成纤维细胞，humsc代表体内分离的间充质干细胞，huimsc代表转分化的间充质干细胞；d为对转分化的间充质干细胞分化多能性的检测，使用标准的三系方法对来自于实施例5中的huimsc和作为阴性对照的hufib进行成骨，成软骨和成脂肪的诱导，第21天，进行对应的染色检测，成骨分化使用茜素红染色，成软骨分化使用阿尔辛蓝染色，脂肪分化使用油红o染色；

图4经过对应调控靶点的小分子化合物组合处理后，从人源皮肤成纤维细胞制备的血管内皮细胞。a图是血管内皮细胞发育早期高表达的基因flk1分别在hufib(人源皮肤成纤维细胞，阴性对照)，huec(体内分离的人脐静脉血管内皮细胞，阳性对照)，和iec(实验转分化的血管内皮细胞)中的表达情况，如图可见flk1在转分化的血管内皮细胞中明显高表达；b图是血管内皮细胞发育早期高表达的基因cd31分别在hufib(人源皮肤成纤维细胞，阴性对照)，huec(体内分离的人脐静脉血管内皮细胞，阳性对照)，和iec(实验转分化的血管内皮细胞)中的表达情况，如图可见cd31在转分化的血管内皮细胞中明显高表达；c图是血管内皮细胞发育早期高表达的基因vwf分别在hufib(人源皮肤成纤维细胞，阴性对照)，huec(体内分离的人脐静脉血管内皮细胞，阳性对照)，和iec(实验转分化的血管内皮细胞)中的表达情况，如图可见vwf在转分化的血管内皮细胞中明显高表达；d图是对转分化的血管内皮细胞的vwf免疫荧光染色，结果显示转分化的细胞染色为阳性。e图为对转分化的血管内皮细胞进行ac-ldl摄取的实验。加入标记荧光探针的ac-ldl和iec细胞共培养，5小时后进行荧光检测。iec摄取ac-ldl的检测，结果显示为阳性。

f图为对转分化的血管内皮细胞进行小管生成实验检测其成管状能力；f图是iec细胞15小时检测时的形态。

图5为通过小分子化合物诱导，人源皮肤成纤维细胞向血管平滑肌细胞转分化图，其中a图为皮肤成纤维细胞；b为第一阶段处理后的细胞产物；c为转分化后获得的血管平滑肌细胞(实施例9)，该细胞为转分化后的第1代(p1)；d为实施例6转分化后获得的血管平滑肌细胞，该细胞为转分化后的第1代；e图为血管平滑肌细胞标志性分子actinalpha的染色鉴定；

图6为以靶点调控系统为基础的小分子化合物组合处理，人源皮肤成纤维细胞向神经细胞的转分化图。a图为未经处理的皮肤成纤维细胞；b图为处理后的神经细胞；c图为神经细胞标志性分子tuj1在处理后细胞中的上调表达。

图7为通过基于靶点调控系统的小分子化合物组合处理长期培养的皮肤成纤维细胞后，皮肤细胞的增值能力的鉴定。a图为皮肤成纤维的形态；b图为使用实施例12的方法处理细胞后的形态图；c图为单克隆来源的皮肤成纤维细胞形态；d图为使用实施例13的方法处理细胞后的形态图；d图为使用实施例12的方法，处理后的细胞与未处理的细胞在第14代以后的细胞增值能力的鉴定。

图8为皮肤成纤维细胞通过小分子化合物处理后，成纤维细胞分子标志物fsp-1在不同处理组中的表达。如实施例14中的处理方法，hufibcontrol代表未经处理的皮肤成纤维细胞，hufib-1代表小分子组合1处理的细胞，hufib-2代表小分子组合2处理的细胞。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。

实施例1靶点调控系统用于制备成骨细胞

1、皮肤成纤维细胞的分离

1.1从供者身上获取直径约1cm的皮肤组织块，贴壁法分离皮肤成纤维细胞，分离的细胞培养于基础培养液里，所述基础培养液：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm。

1.2细胞传代大量扩增，细胞代数在第6代和第12代间，用于进行向成骨细胞的转分化诱导。启动分化的前一天(day-1)，接种细胞密度1～2.5×10⁴/cm²培养于37℃，5％co2的培养箱中。

2、皮肤成纤维细胞的重编程:第一阶段

通过上述第1步骤的处理后，完全更换为第一阶段的诱导培养液进行细胞培养，培养时间3～8天，在37℃，5％co2环境下培养细胞。所述诱导培养液成分如下：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm培养基(gibco)+forskolin(2μm～20μm)+repsox(2～15um)+chir99021(1μm～10μm)+vpa(0.5mm～1.5mm)，该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％-20％的浓度替代；100u/ml青霉素(sigma)和100μg/ml链霉素(sigma)可以不使用。

3、皮肤成纤维细胞的重编程:第二阶段

通过上述第2步骤的处理后，完全更换为第二阶段的诱导培养液进行细胞培养，培养时间5～18天，在37℃，5％co2环境下培养细胞。所述第二阶段的诱导培养液成分如下：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm培养基(gibco)+forskolin(2μm～20μm)+repsox(2～15um)+chir99021(1μm～10μm)+vpa(0.5mm～1.5mm)+ttnpb(3μm～8μm)+am580(0.03～0.08μm)+epz004777(3～8μm)+go6983(1～15μm)，该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％-20％的浓度替代；100u/ml青霉素(sigma)和100μg/ml链霉素(sigma)可以不使用。

4、重编程细胞的定向诱导

随后更换为常规的成骨分化培养液或者市售商业化的成骨诱导液(赛业)，培养12～30天后，获得成骨细胞。所述的成骨分化液具体是：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm培养基(gibco)+10mmol/lβ-gly(β-甘氨酸)+100nmdexamethasone(地塞米松)+0.2mmascorbate-2-phosphate(维生素c磷酸酯)。

实施例2靶点调控系统用于制备成骨细胞

1、皮肤成纤维细胞的分离

1.1从供者身上获取直径约1cm的皮肤组织块，贴壁法分离皮肤成纤维细胞，分离的细胞培养于基础培养液里，所述基础培养液：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm。

1.2细胞传代大量扩增，细胞代数在第6代和第12代间，用于进行向成骨细胞的转分化诱导。启动分化的前一天(day-1)，接种细胞密度1～2.5×10⁴/cm²培养于37℃，5％co2的培养箱中。

2、皮肤成纤维细胞的激活

2.1启动转分化时(day0)，完全更换基础培养液为第一阶段培养液，培养细胞4～6天，第一阶段培养液是指：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm培养基(gibco)+forskolin(2μm～25μm)+repsox(2～15um)+chir99021(1μm～10μm)+vpa(0.5mm～1.5mm)，该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20％的浓度替代；100u/ml青霉素(sigma)和100μg/ml链霉素(sigma)可以不使用。在37℃，5％co2环境下培养细胞。

3、皮肤成纤维细胞的重编程

通过上述第2步骤的处理后，完全更换为第二阶段培养液进行细胞培养，培养时间5～18天，在37℃，5％co2环境下培养细胞。所述的第二阶段培养液是：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm培养基(gibco)+forskolin(2μm～20μm)+repsox(2～15um)+chir99021(1μm～10μm)+vpa(0.5mm～1.5mm)+ttnpb(3μm～8μm)+am580(0.03～0.08μm)+epz004777(3～8μm)+go6983(1～15μm)+y-27632(3～15μm)+l-ascorbinacid2-phosphate(0.15～0.25m)+5-aza-2'-deoxycytidine(1μm～15μm)，该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％-20％的浓度替代；100u/ml青霉素(sigma)和100μg/ml链霉素(sigma)可以不使用。

4、重编程细胞的定向诱导

随后更换为常规的成骨分化培养液或者市售商业化的成骨诱导液(赛业)，培养12～30天后，获得成骨细胞。所述的成骨分化液具体是：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm培养基(gibco)+10mmol/lβ-gly(β-甘氨酸)+100nmdexamethasone(地塞米松)+0.2mmascorbate-2-phosphate(维生素c磷酸酯)；

5、诱导的成骨细胞的检测，检测基因runx2alp，bspii，ocn；茜素红染色标记细胞分泌的矿化结节。

实施例3靶点调控系统用于制备软骨细胞

1、皮肤成纤维细胞的分离

1.1从供者身上获取直径约1cm的皮肤组织块，贴壁法分离皮肤成纤维细胞，分离的细胞培养于基础培养液里，所述基础培养液：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm。

1.2细胞传代大量扩增，细胞代数在第6代和第12代间，用于进行向软骨细胞的转分化诱导。启动分化的前一天(day-1)，接种细胞密度1～2.5×10⁴/cm²培养于37℃，5％co2的培养箱中。

2、皮肤成纤维细胞的重编程

通过上述第2步骤的处理后，完全更换为第二阶段培养液进行细胞培养，培养时间6～12天，在37℃，5％co2环境下培养细胞。所述的第二阶段培养液是：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm培养基(gibco)+forskolin(2μm～20μm)+repsox(2～15um)+chir99021(1μm～10μm)+vpa(0.5mm～1.5mm)+ttnpb(3μm～8μm)+am580(0.03～0.08μm)+epz004777(3～8μm)+go6983(1～15μm)+y-27632(3～15μm)+l-ascorbinacid2-phosphate(0.15～0.25mm)，该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％-20％的浓度替代；100u/ml青霉素(sigma)和100μg/ml链霉素(sigma)可以不使用。

3、重编程细胞的定向诱导

随后更换为第三阶段培养液，作用时间3-10天，在37℃，5％co2环境下培养细胞。第三阶段培养液是在第二阶段的培养体系上，联合使用生长因子组合、dnmt抑制剂或者使用生长因子与dnmt抑制剂两种的联合进行培养。

本实施例采用的生长因子组合包括：bmp4(10-20ng/ml)+pdgf-ab(100-250ng/ml)+b-fgf(10-50ng/ml)，所述的dnmt抑制剂具体为5-aza-2'-deoxycytidine(1um～15um)该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20％的浓度替代；100u/ml青霉素(sigma)和100μg/ml链霉素(sigma)可以不使用。

4、细胞的成软骨定向分化

随后更换为常规的成软骨分化培养液或者市售商业化的成软骨诱导液(赛业生物科技有限公司)，培养12～30天后，获得软骨细胞。或者，在对分化的细胞进行进行了第一和第二步的诱导后，直接对细胞进行第四步骤的成软骨分化培养液或者市售商业化的成软骨诱导液(赛业生物科技有限公司)。成软骨分化液具体是：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm培养基(gibco)+1xits+100nmdexamethasone+10ng/mltgf-beta3+0.17mmascorbate-2-phosphate+40μg/mlproline

5、诱导的软骨细胞的检测，检测基因col2a1，aggrecan，sox9，col10x，进行对应的免疫组化染色，阿尔新蓝染色。

实施例4靶点调控系统用于制备软骨细胞

1、皮肤成纤维细胞的分离

1.1从供者身上获取直径约1cm的皮肤组织块，贴壁法分离皮肤成纤维细胞，分离的细胞培养于基础培养液里，所述基础培养液：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm。

1.2细胞传代大量扩增，细胞代数在第6代和第12代间，用于进行向软骨细胞的转分化诱导。启动分化的前一天(day-1)，接种细胞密度1～2.5×10⁴/cm²培养于37℃，5％co2的培养箱中。

2、皮肤成纤维细胞的预处理

2.1启动转分化时(day0)，完全更换基础培养液为第一阶段培养液，培养细胞4～6天，第一阶段培养液是指：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm培养基(gibco)+forskolin(2μm～25μm)+repsox(2～15um)+chir99021(1μm～10μm)+vpa(0.5mm～1.5mm)，该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％——20％的浓度替代；100u/ml青霉素(sigma)和100μg/ml链霉素(sigma)可以不使用。在37℃，5％co2环境下培养细胞。

3、皮肤成纤维细胞的第一阶段诱导

通过上述第2步骤的处理后，完全更换为第二阶段培养液进行细胞培养，培养时间6～10天，在37℃，5％co2环境下培养细胞。所述的第二阶段培养液是：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm培养基(gibco)+forskolin(2μm～20μm)+repsox(2～15um)+chir99021(1μm～10μm)+vpa(0.5mm～1.5mm)+ttnpb(3μm～8μm)+am580(0.03～0.08μm)+epz004777(3～8μm)+go6983(1～15μm)+y-27632(3～15μm)+l-ascorbinacid2-phosphate(0.15～0.25mm)+sp600125(8～12μm)+5-aza-2'-deoxycytidine(1μm～15μm)，该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％-20％的浓度替代；100u/ml青霉素(sigma)和100μg/ml链霉素(sigma)可以不使用。

4、第二阶段诱导

随后更换为第三阶段培养液，作用时间3-10天，在37℃，5％co2环境下培养细胞。

本实施例采用的第三阶段培养液包括:10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm培养基(gibco)+forskolin(2μm～20μm)+repsox(2～15um)+chir99021(1μm～10μm)+vpa(0.5mm～1.5mm)+ttnpb(3μm～8μm)+am580(0.03～0.08μm)+epz004777(3～8μm)+go6983(1～15μm)+y-27632(3～15μm)+l-ascorbinacid2-phosphate(0.15～0.25mm)++5-aza-2'-deoxycytidine(1μm～15μm)，该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％-20％的浓度替代；100u/ml青霉素(sigma)和100μg/ml链霉素(sigma)可以不使用。

5、细胞的成软骨定向分化

随后更换为常规的成软骨分化培养液或者市售商业化的成软骨诱导液(赛业生物科技有限公司)，培养12～30天后，获得软骨细胞。或者，在对分化的细胞进行进行了第一和第二步的诱导后，直接对细胞进行第四步骤的成软骨分化培养液或者市售商业化的成软骨诱导液(赛业生物科技有限公司)。成软骨分化液具体是：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm培养基(gibco)+1xits+100nmdexamethasone+10ng/mltgf-beta3+0.17mmascorbate-2-phosphate+40μg/mlproline

6、诱导的软骨细胞的检测，检测基因col2a1，aggrecan，sox9，col10x，进行对应的免疫组化染色，阿尔新蓝染色。

实施例5靶点调控系统用于制备间充质干细胞

1、皮肤成纤维细胞的分离

1.1从供者身上获取直径约1cm的皮肤组织块，贴壁法分离皮肤成纤维细胞，分离的细胞培养于基础培养液里，所述基础培养液：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm。

1.2细胞传代大量扩增，细胞代数在第6代和第12代间，用于进行向间充质干细胞的转分化诱导。启动分化的前一天(day-1)，接种细胞密度1～2.5x10⁴/cm²培养于37℃，5％co2的培养箱中。

2、皮肤成纤维细胞的活化

2.1启动转分化时(day0)，完全更换基础培养液为第一阶段培养液，培养细胞4-6天，第一阶段培养液是指：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm培养基(gibco)+forskolin(2μm～25μm)+repsox(2～15um)+chir99021(1μm～10μm)+vpa(0.5mm～1.5mm)，该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％-20％的浓度替代；100u/ml青霉素(sigma)和100μg/ml链霉素(sigma)可以不使用。在37℃，5％co2环境下培养细胞。

3、皮肤成纤维细胞的定向诱导

通过上述第2步骤的处理后，完全更换为第二阶段培养液进行细胞培养，培养时间6～10天，在37℃，5％co2环境下培养细胞。所述的第二阶段培养液是：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm培养基(gibco)+forskolin(2μm～20μm)+repsox(2～15um)+chir99021(1μm～10μm)+vpa(0.5mm～1.5mm)+ttnpb(3μm～8μm)+am580(0.03～0.08μm)+epz004777(3～8μm)+go6983(1～15μm)+y27362(3～15μm)+l-ascorbinacid2-phosphate(0.15～0.25mm)，该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20％的浓度替代；100u/ml青霉素(sigma)和100μg/ml链霉素(sigma)可以不使用。

4、第三阶段——提高向间充质干细胞转分化的效率

随后更换为第三阶段培养液，作用时间3-8天，在37℃，5％co2环境下培养细胞。第三阶段培养液是指，bmp4(10～20ng/ml)+pdgf-ab(100～250ng/ml)+b-fgf(10～50ng/ml)+10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm培养基(gibco)，该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％-20％的浓度替代；100u/ml青霉素(sigma)和100μg/ml链霉素(sigma)可以不使用。。

5、诱导的间充质干细胞的维持培养和扩增

随后更换为常规的间充质干细胞培养液或者市售商业化间充质干细胞培养液(赛业)，对诱导的细胞进行维持培养和传代扩增。所述的常规的间充质干细胞培养液是指：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm培养基(gibco)。

实施例6靶点调控系统用于制备间充质细胞

1、皮肤成纤维细胞的分离。

2、皮肤成纤维细胞的活化

2.1启动转分化时(day0)，完全更换基础培养液为第一阶段培养液，培养细胞4-6天，第一阶段培养液是指：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm培养基(gibco)+forskolin(2μm～25μm)+repsox(2～15um)+chir99021(1μm～10μm)+vpa(0.5mm～1.5mm)，该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％-20％的浓度替代；100u/ml青霉素(sigma)和100μg/ml链霉素(sigma)可以不使用。在37℃，5％co2环境下培养细胞。

3、皮肤成纤维细胞的定向诱导

通过上述第2步骤的处理后，完全更换为第二阶段培养液进行细胞培养，培养时间6～10天，在37℃，5％co2环境下培养细胞。所述的第二阶段培养液是：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm培养基(gibco)+forskolin(2μm～20μm)+repsox(2～15um)+chir99021(1μm～10μm)+vpa(0.5mm～1.5mm)+ttnpb(3μm～8μm)+am580(0.03～0.08μm)+epz004777(3～8μm)+go6983(1～15μm)+y-27632(3～15μm)+l-ascorbinacid2-phosphate(0.15～0.25mm)+sp600125(8～12μm)+5-aza-2'-deoxycytidine(1μm～15μm)+parnate((1μm～10μm))，该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20％的浓度替代；100u/ml青霉素(sigma)和100μg/ml链霉素(sigma)可以不使用。

4、第三阶段提高向间充质干细胞转分化的效率

随后更换为第三阶段培养液，作用时间3-8天，在37℃，5％co2环境下培养细胞。第三阶段培养液是指，bmp4(10～20ng/ml)+pdgf-ab(100～250ng/ml)+b-fgf(10～50ng/ml)+10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm培养基(gibco)，该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％-20％的浓度替代；100u/ml青霉素(sigma)和100μg/ml链霉素(sigma)可以不使用。

5，诱导的间充质干细胞的维持培养和扩增

随后更换为常规的间充质干细胞培养液或者市售商业化间充质干细胞培养液(赛业)，对诱导的细胞进行维持培养和传代扩增。所述的常规的间充质干细胞培养液是指：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm培养基(gibco)。

实施例7靶点调控系统用于制备血管内皮细胞

1、皮肤成纤维细胞的分离

1.1从供者身上任意位置获取直径约1cm的皮肤组织块，贴壁法分离皮肤成纤维细胞，分离的细胞培养于基础培养液里，所述基础培养液是指：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm。

1.2细胞传代大量扩增，细胞代数在第3代和第12代间，用于进行向血管内皮细胞的转分化诱导。启动活化的前一天(day-1)，接种细胞密度4～6x10³/cm2培养于37℃，5％co2的培养箱中。

2、皮肤成纤维细胞的向血管内皮细胞的定向诱导

启动转分化时(day0),完全更换基础培养液为诱导培养液，培养细胞10～28天，培养液a是指：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm培养基(gibco)+forskolin(1μm～30μm)+go6983(1～15μm)+repsox(2～15μm)+chir99021(1μm～15μm)+vpa(0.5mm～1.5mm)+1μm～20μm5-aza-2’-deoxycytidine+50nm～1μmtsa，该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20％的浓度替代；100u/ml青霉素(sigma)和100μg/ml链霉素(sigma)可以不使用。在37℃，5％co2环境下培养细胞。

3、诱导性血管内皮细胞的扩增培养

随后，培养液更换为常规的血管内皮细胞培养液或者市售商业化血管内皮细胞培养液(lonza)，在37℃，5％co2环境下培养细胞。所述的常规的血管内皮细胞培养液是：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm培养基(gibco)+fbs(10％fbs)+hydrocortisone(0.2ug/ml)+vegf(0.5ng/ml)+r3-igf-1(20ng/ml)+ascorbicacid(1ug/ml)+hfgf-b(10ng/ml)。该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20％的浓度替代；100u/ml青霉素(sigma)和100μg/ml链霉素(sigma)可以不使用。

4、诱导的血管内皮细胞的检测

4.1通过免疫组化染色和rt-pcr的方法，检测血管内皮细胞的分子标志物，主要的分子标志物如下：cd31；vwf；enos；ve；

4.2体外功能验证:

4.2.1内皮细胞摄取ac-ldl的检测:

(1)细胞准备：将iec和hufib以1×10⁴cells/ml密度于24孔板铺板。

(2)用pbs清洗两次。

(3)用1:100稀释的ac-ldl-594，iec和hufib分别以4lac-ldl+396lebmmdedium和4lac-ldl+396ldmemmdedium上样。

(4)37℃培养箱中孵育细胞5h。

(5)在显微镜下观察并拍照记录。

4.2.2血管管状物形成

(1)实验前先将matrigel至于4℃冰箱24-48h使其融化为液体，枪头放入冰箱预冷，操作在冰上进行。

(2)matrigel50ul/孔(96孔板)铺板，室温或者37℃30-60min，将iec和hufib以细胞密度为2*10^4/孔种下，iec加ebmmedium和ebmmedium，hufib加入dmemmdedium。

(3)37℃培养0h，6h，10h，15h,24h分别观察拍照记录。

实施例8靶点调控系统用于制备血管内皮细胞

1、皮肤成纤维细胞的分离

1.1从供者身上任意位置获取直径约1cm的皮肤组织块，贴壁法分离皮肤成纤维细胞，分离的细胞培养于基础培养液里，所述基础培养液是指：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm。

1.2细胞传代大量扩增，细胞代数在第3代和第12代间，用于进行向血管内皮细胞的转分化诱导。启动活化的前一天(day-1)，接种细胞密度4～6x10³/cm2培养于37℃，5％co2的培养箱中。

2、皮肤成纤维细胞的向血管内皮细胞的定向诱导

启动转分化时(day0),完全更换基础培养液为诱导培养液，培养细胞10～28天，培养液a是指：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm培养基(gibco)+forskolin(2μm～20μm)+repsox(2～15um)+chir99021(1μm～10μm)+vpa(0.5mm～1.5mm)+ttnpb(3μm～8μm)+am580(0.03～0.08μm)+epz004777(3～8μm)+go6983(1～15μm)+y-27632(3～15μm)+l-ascorbinacid2-phosphate(0.15～0.25mm)，该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20％的浓度替代；100u/ml青霉素(sigma)和100μg/ml链霉素(sigma)可以不使用。在37℃，5％co2环境下培养细胞。

3、诱导性血管内皮细胞的扩增培养

随后，培养液更换为常规的血管内皮细胞培养液或者市售商业化血管内皮细胞培养液(lonza)，在37℃，5％co2环境下培养细胞。所述的常规的血管内皮细胞培养液是：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm培养基(gibco)+fbs(10％fbs)+hydrocortisone(0.2ug/ml)+vegf(0.5ng/ml)+r3-igf-1(20ng/ml)+ascorbicacid(1ug/ml)+hfgf-b(10ng/ml)。该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20％的浓度替代；100u/ml青霉素(sigma)和100μg/ml链霉素(sigma)可以不使用。

4、诱导的血管内皮细胞的检测。

实施例9靶点调控系统用于制备血管平滑肌细胞

1.皮肤成纤维细胞的分离

1.1，从供者身上任意位置获取直径约1cm的皮肤组织块，贴壁法分离皮肤成纤维细胞，分离的细胞培养于基础培养液里，所述基础培养液是指：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm。

1.2，细胞传代大量扩增，细胞代数在第6代和第12代间，用于进行向血管平滑肌细胞的转分化诱导。启动活化的前一天(day-1)，接种细胞密度4～6x10³/cm²培养于37℃，5％co2的培养箱中。

2.皮肤成纤维细胞的活化

2.1，启动转活化时(day0)，完全更换基础培养液为第一阶段培养液a，培养细胞2～10天，第一阶段培养液a是指：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm培养基(gibco)+1μm～20μm5-aza-2’-deoxycytidine，该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20％的浓度替代；100u/ml青霉素(sigma)和100μg/ml链霉素(sigma)可以不使用。在37℃，5％co2环境下培养细胞。

2.2，通过2.1步骤处理细胞4～8天后，更换第一阶段培养液b，培养细胞2～5天，第一阶段培养液b是指：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm培养基(gibco)+50nm～1μmtsa，该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％——20％的浓度替代；100u/ml青霉素(sigma)和100μg/ml链霉素(sigma)可以不使用。在37℃，5％co2环境下培养细胞。步骤2.2和步骤2.1可以进行合并，直接使用含有aza和tsa的培养液培养即可。

3、皮肤成纤维细胞的定向诱导(向血管平滑肌细胞的定向诱导)

细胞通过上述活化处理后，完全更换为第二阶段培养液进行细胞培养，培养时间10～15天，在37℃，5％co2环境下培养细胞。所述的第二阶段培养液是：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm培养基(gibco)+go6983(1～15μm)+forskolin(1μm～30μm)+repsox(2～15μm)+chir99021(1μm～15μm)+vpa(0.5mm～1.5mm)+epz004777(3～8μm)。该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20％的浓度替代；100u/ml青霉素(sigma)和100μg/ml链霉素(sigma)可以不使用。

4、诱导的血管平滑肌细胞的维持与扩增

随后更换为常规的血管平滑肌培养液或者市售商业化血管平滑肌培养液(lonza)，对诱导的细胞进行维持培养和传代扩增。所述的常规的血管平滑肌培养液是指：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm培养基(gibco)+2mml-glutamine+40mmbicarbonate，其中100u/ml青霉素(sigma)和100μg/ml链霉素(sigma)可以不使用。

5、诱导的血管平滑肌细胞的检测

通过免疫组化染色和rt-pcr的方法，检测血管平滑肌细胞的分子标志物，主要的分子标志物如下：smoothmusclemyosinheavychain；actinalpha2；myocardin。

实施例10调控靶点系统用于制备血管平滑肌细胞

1、皮肤成纤维细胞的分离

1.1从供者身上任意位置获取直径约1cm的皮肤组织块，贴壁法分离皮肤成纤维细胞，分离的细胞培养于基础培养液里，所述基础培养液是指：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm。

1.2细胞传代大量扩增，细胞代数在第6代和第12代间，用于进行向血管平滑肌细胞的转分化诱导。启动活化的前一天(day-1)，接种细胞密度4～6×10³/cm²培养于37℃，5％co2的培养箱中。

2、皮肤成纤维细胞的活化

2.1启动转活化时(day0)，完全更换基础培养液为第一阶段培养液，培养细胞2～10天，第一阶段培养液a是指：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm培养基(gibco)+1μm～20μm5-aza-2’-deoxycytidine，该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20％的浓度替代；100u/ml青霉素(sigma)和100μg/ml链霉素(sigma)可以不使用。在37℃，5％co2环境下培养细胞。

3、皮肤成纤维细胞的定向诱导(向血管平滑肌细胞的定向诱导)

细胞通过上述活化处理后，完全更换为第二阶段培养液进行细胞培养，培养时间10～15天，在37℃，5％co2环境下培养细胞。所述的第二阶段培养液是：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm培养基(gibco)+forskolin(2μm～20μm)+repsox(2～15um)+chir99021(1μm～10μm)+vpa(0.5mm～1.5mm)+ttnpb(3μm～8μm)+am580(0.03～0.08μm)+epz004777(3～8μm)+go6983(1～15μm)。该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20％的浓度替代；100u/ml青霉素(sigma)和100μg/ml链霉素(sigma)可以不使用。

4、诱导的血管平滑肌细胞的维持与扩增

随后更换为常规的血管平滑肌培养液或者市售商业化血管平滑肌培养液(lonza)，对诱导的细胞进行维持培养和传代扩增。所述的常规的血管平滑肌培养液是指：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm培养基(gibco)+2mml-glutamine+40mmbicarbonate，其中100u/ml青霉素(sigma)和100μg/ml链霉素(sigma)可以不使用。

5、诱导的血管平滑肌细胞的检测

通过免疫组化染色和rt-pcr的方法，检测血管平滑肌细胞的分子标志物，主要的分子标志物如下：smoothmusclemyosinheavychain；actinalpha2；myocardin。

实施例11调控靶点系统用于制备神经细胞

1、皮肤成纤维细胞的分离

1.1从供者身上任意位置获取直径约1cm的皮肤组织块，贴壁法分离皮肤成纤维细胞，分离的细胞培养于基础培养液里，所述基础培养液是指：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm。

1.2细胞传代大量扩增，细胞代数在第6代和第12代间，用于进行向血管平滑肌细胞的转分化诱导。启动活化的前一天(day-1)，接种细胞密度4～6×10³/cm²培养于37℃，5％co2的培养箱中。

2、皮肤成纤维细胞的小分子化合物组合处理

皮肤成纤维细胞完全更换为神经诱导培养液进行细胞培养，培养时间10～15天，在37℃，5％co2环境下培养细胞。所述的神经诱导培养液是：10％胎牛血清(hyclone)+100u/ml青霉素(sigma)+100μg/ml链霉素(sigma)+高糖dmdm培养基(gibco)+forskolin(2μm～20μm)+repsox(2～15um)+chir99021(1μm～10μm)+vpa(0.5mm～1.5mm)+ttnpb(3μm～8μm)+am580(0.03～0.08μm)+epz004777(3～8μm)+go6983(1～15μm)+bdnf+gdnf+nt3(20ng/ml)+camp(100μm)。该培养系统中10％胎牛血清也可以被血清替代品(invitrogen)以10％～20％的浓度替代；100u/ml青霉素(sigma)和100μg/ml链霉素(sigma)可以不使用。

处理15天以后，进行神经细胞标志性分子的检测。

实施例12调控靶点系统用于提高细胞活力

皮肤成纤维细胞接触下列小分子化合物组合，培养时间5～15天，在37℃，5％co2环境下培养细胞。所述的小分子化合物组合是：forskolin(2μm～20μm)+repsox(2～15um)+chir99021(1μm～10μm)+vpa(0.5mm～1.5mm)+epz004777(3～8μm)+go6983(1～15μm)。培养时间5～15天，在37℃，5％co2环境下培养细胞。其后，进行细胞增值能力的检测。

实施例13调控靶点系统用于提高细胞活力

皮肤成纤维细胞接触下列小分子化合物组合。所述的小分子化合物组合是：forskolin(2μm～20μm)+repsox(2～15um)+chir99021(1μm～10μm)+epz004777(3～8μm)+go6983(1～15μm)。培养时间5～15天，在37℃，5％co2环境下培养细胞。其后，进行细胞增值能力的检测。

实施例14调控靶点系统用于体细胞的去分化

皮肤成纤维细胞分别接触下列小分子化合物组合。小分子化合物组合1是：forskolin(2μm～20μm)+repsox(2～15um)+chir99021(1μm～10μm)+epz004777(3～8μm)+go6983(1～15μm)+vpa(0.5mm～1.5mm)；小分子组合2是：forskolin(2μm～20μm)+repsox(2～15um)+chir99021(1μm～10μm)+vpa(0.5mm～1.5mm)。处理5天后，检测成纤维细胞标志分子fsp-1。