抗因子XI的活性位点的单克隆抗体及其用途的制作方法

本发明一般涉及医药和药学领域，尤其涉及用于血液病学-凝血的生物药物领域。更特别地，本发明涉及抗因子xi的活性位点的抗体，其通过激活的因子xi抑制因子ix的活化。抗因子xi活性位点的抗体可用于预防和治疗其中涉及病理性血栓形成或者血栓栓塞的状况。发明背景凝血由体液应答和细胞应答组成，是止血的重要组成部分，止血是阻止血液由伤口或损伤处流失的过程。病理性凝血或血栓形成是指不是正常止血过程的一部分且可能导致疾病症状的血凝块形成。深静脉血栓形成、血管移植物血栓形成、冠状动脉粥样硬化斑块血栓形成、微血管血栓形成和败血症弥漫性血管内凝血是病理性凝血的实例。此外，部分病理性血栓可以释出并由血流带走，堵塞机体其它部位如肺或脑的血管，这一过程称为栓塞。有栓塞或无栓塞的血栓形成发生作用的疾病称为血栓栓塞性疾病。血栓栓塞性疾病的主要治疗包括施用抗凝药物，该药物可抑制凝血系统。凝血系统是一组血浆蛋白，其作为无活性酶和辅因子循环及可以以级联式方式彼此激活。这个级联中的关键酶是凝血酶，其将可溶性纤维蛋白原转化为不溶性纤维蛋白，及将许多其它凝血因子包括fxi、fviii和fv激活为活性物质，从而提供激活的放大(凝血因子被称为fxi、fix等；激活的凝血因子称作fxia、fixa等)。通过循环中的抑制剂如抗凝血酶防止凝血的过度激活。凝血级联的简化方案在图10中示出。凝血通过主要或基本途径及两个放大环而发生。目前的抗凝血药物抑制凝血的共同途径：肝素(通过抗凝血酶)针对凝血酶、fxa和fixa，香豆素抑制凝血酶原、因子vii、ix和x的合成，而低分子量肝素主要抑制fxa。这些药物的治疗窗口狭窄，并且使用其可导致每年1-2％的患者出现严重出血不良事件，而轻度出血事件更频繁发生。例如，因静脉血栓形成而接受抗凝治疗的患者每100人每年有7.2次大出血的风险，致命性出血的风险为每100人每年1.31次，由于大出血所致病死率为13.4％(linkinsla,anninternmed2003；139:893–900)。因此，在日常实践中使用抗凝血剂具有出血副作用的高风险并且要求仔细监测患者。目前，尚未批准靶向fxi的抗凝血剂。这反映出长期以来fxi被认为在血栓栓塞过程中发挥(如果有的话)微小作用，因为fxi在止血中的作用被认为是有限的。事实上，fxi缺乏不会导致具有在关节和软组织的自发性出血事件的严重出血倾向，如血友病a和b，但与损伤相关的出血性失调相关(dugas,etal.,seminthrombhemost2013；39:621-31；fpeyvandietal.,haematologica2002；87:512-514)。许多fxi缺乏的人从未经历过严重出血事件(castamangetal.,haemophilia2014；20:106–13)。然而，一些研究表明，在体内抑制fxi的功能可以预防病理性血栓形成而不影响出血时间(minnemaetal.,1998,jclininvest.101:10-14；gruberandhanson,2003,blood102:953-955；tuckeretal.,2009,blood,113:936-44；chengetal.,2010,blood116:3981-9；takahashietal.,2010,thrombres,125:464-70；vanmontfoortetal.,2013,thrombhaemost110:1065-73)，支持了fxi在病理性血栓形成中的重要作用。据推测，fxi在正常止血与病理性血栓形成中的这种不同用途反映了正常止血主要由高浓度组织因子(tf)引发，因此独立于fxi放大环(见图10)，而病理性血栓形成始于低浓度tf。这种在正常止血与血栓栓塞过程中的不同作用使得fxi成为抗凝策略的感兴趣的靶(lowenbergec等，jthrombhaemost2010；8：2349-57)。靶向fxi的一种方法是基于反义寡核苷酸的疗法，其旨在减少肝脏中fxi的合成。这种方法在动物模型中(zhanghetal.,blood.2010；116:4684-4692；younishsetal.,blood2012；119:2401-08)以及在人体中(bullerhetal.,nengljmed2015；372:232-40)示出有希望的结果。然而，降低fxi合成的反义寡核苷酸不能用于急性血栓栓塞状况，因为其需要至少1-2周才能充分降低fxi水平(younishsetal.,blood2012；119:2401-08)。此外，长期毒性尚不清楚。因此，需要靶向fxi作为抗凝策略的不同方法。一种替代方法是应用阻断fxi功能活性的单克隆抗体(mab)。本发明揭示了靶向fxi及具有较低的(如果有的话)出血风险的新型抗凝血药物。因此，这些新型抗凝剂的临床使用不需要监测患者。阻断fxi/fxia活性位点的抑制剂将是靶向fxi的优选方法。然而，fxi是丝氨酸蛋白酶，其活性位点与许多其它丝氨酸蛋白酶、特别是丝氨酸蛋白酶的胰蛋白酶家族的那些酶的活性位点同源。其它凝血因子纤维蛋白溶解性和补体蛋白酶属于同一家族，均具有同源活性位点。因此，fxia的小分子抑制剂由于与其它丝氨酸蛋白酶的交叉反应而具有固有的毒性风险。与fxi/fxia的活性位点结合并通过fxia阻断蛋白质和肽底物转化的mab将是治疗应用的优选选项。然而，迄今为止尚未描述这种针对fxia活性位点的抑制性mab。sinha等(jbiolchem1985；260:10714-9)揭示了5f4mab，其呈现出针对fxia的轻链，及揭示了哪种抗体抑制100％的fxia活性。然后，akiyama等(j.clin.invest.1986；78:1631-1637)随后报道了5f4mab不抑制fxia的生色活性，因此不结合fxia的活性位点。推测5f4mab针对fxia轻链上的外部位点(exosite)(sinhaetal.,biochemistry2007；46:9830-9)。因此，本发明的一个目的是提供抗体，其结合因子xi(a)的丝氨酸蛋白酶结构域、抑制因子xia的小生色底物的转化以及因子ix通过因子xia向ixa的转化。本发明还提供了这种单克隆抗体(mab)的人源化形式，以及所述抗体治疗或预防血栓栓塞性疾病的应用。发明概述第一方面，本发明涉及结合因子xi(因子xi)的轻链的抗体。所述抗体优选降低激活的因子xi(因子xia)的生色活性，其中优选生色底物是l-焦谷氨酰-l-脯氨酰-l-精氨酸-对硝基苯胺。所述抗体进一步优选与重链可变结构域包含seqidno:1及轻链可变结构域包含seqidno:2的抗体交叉竞争结合因子xi。本发明的优选抗体包含至少一个选自如下的高变区(hvr)：包含seqidno:3序列的hvr-h1，包含seqidno:4序列的hvr-h2，包含seqidno:5序列的hvr-h3，包含seqidno:6序列的hvr-l1，包含seqidno:7序列的hvr-l2和包含seqidno:8序列的hvr-l3。更优选地，所述抗体包含选自以下的2、3、4、5或6个高变区(hvr)：包含seqidno:3序列的hvr-h1，包含seqidno:4序列的hvr-h2，包含seqidno:5序列hvr-h3，包含seqidno:6序列的hvr-l1，包含seqidno:7序列的hvr-l2和包含seqidno:8序列的hvr-l3。根据本发明的抗体优选是小鼠抗体、嵌合抗体或人源化抗体。或者，抗体可以是抗体片段，选自fv、单链fv(scfv)、fab、fab'、(fab')2和纳米抗体。本发明的抗体或抗体片段优选包含抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含与seqidno:13-16的至少一个具有至少95％序列相同性的氨基酸序列，所述轻链可变结构域包含与seqidno:17-20的至少一个具有至少95％序列相同性的氨基酸序列。更优选地，在所述抗体或抗体片段中，抗体的重链可变结构域包含seqidno:16的氨基酸序列，以及抗体的轻链可变结构域包含seqidno:20的氨基酸序列。本发明的抗体优选地包含在铰链区中的突变，相对链内二硫键形成，所述突变有利于重链的链间二硫键形成。更优选地，所述突变是s241p。在本发明的优选抗体中，所述抗体包含是igg4区、更优选人igg4区的重链恒定区。进一步优选的是本发明的抗体结合人fxia的轻链。第二方面，本发明涉及药物组合物，其包含本发明的抗体或抗体片段及任选包含药学上可接受的载体。第三方面，本发明涉及用作药物的本发明的抗体、抗体片段或药物组合物。第四方面，本发明涉及用于预防或治疗以下至少一种的本发明的抗体、抗体片段或药物组合物：i)由fxi活化介导的疾病、失调或状况；和ii)其中抑制fxi具有有益效果的疾病、失调或状况。优选地，所述疾病、失调或状况是涉及凝血的疾病、失调或状况。更优选地，所述疾病是血栓栓塞性疾病或者炎性疾病伴随通过fxi的凝血激活。或者，所述抗体、抗体片段或药物组合物用于根据本发明的用途，其中所述用途是预防或治疗病理性血栓形成或者在由于医疗程序导致发生血栓形成的危险增加的对象中预防血栓形成。因此本发明的用途可用于预防或治疗选自如下的至少一种疾病、失调或状况：心肌梗塞，缺血性中风，房颤所致心脏栓塞，血管通路血栓形成，深静脉血栓形成，动脉血栓形成，冠状动脉血栓形成，动脉粥样硬化，关节炎，血管炎，呼吸窘迫综合征，缺血性心脏病，缺血性脑病，肺栓塞，手术或卧床(immobilization)所致静脉血栓栓塞，合成移植物、支架或av-瘘、人工心脏瓣膜的血栓形成和闭塞，弥漫性血管内凝血(dic)，血液透析，房颤，败血症，感染性休克，器官衰竭，肾衰竭，体内施用治疗性蛋白质引起的毒性，多发性创伤，缺血再灌注损伤，局部不希望的纤维蛋白沉积和成人呼吸窘迫期间肺泡中纤维蛋白沉积。优选地，所述抗体、抗体片段或药物组合物用于本发明的用途，其中所述抗体通过静脉内、动脉内、肌肉内或皮下施用。静脉内施用优选推注输注或者在小于2小时至24小时时间内连续输注。优选地，当所述抗体、抗体片段或药物组合物用于预防、减少或治疗经历常规透析的肾病患者中的合成移植物、支架或av-瘘所致血栓形成(和闭塞)时，其中所述抗体、抗体片段或组合物是在回输给患者的透析体液中施用给患者。或者，所述抗体、抗体片段或药物组合物用于本发明的用途，用于预防或治疗患有房颤、不稳定型心绞痛、静脉血栓栓塞、人工心脏瓣膜、缺血性心脏病、缺血性脑病、血管移植物、弥漫性血管内凝血、败血症的患者或者正在经历前列腺或矫形外科手术的患者中的血栓形成，其中施用所述结合分子不超过(通常)每2周一次。第五方面，本发明涉及核酸分子，其包含编码本发明抗体或抗体片段的核苷酸序列。优选地，所述核酸分子包含编码抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域至少之一的核苷酸序列。更优选地，在所述核酸分子中，编码核苷酸序列与调节序列可操纵地连接以在宿主细胞中表达所述编码核苷酸序列。第六方面，本发明涉及包含根据第五方面的核酸分子的宿主细胞。发明描述定义术语“抗体”以最广含义使用，特别涵盖例如抗体或其片段、单抗体(unibody)、双抗体、三抗体、四价或其它多价抗体，其特异性结合fxi/fxia并抑制fxi/fxia的功能活性。术语“抗体”是指多克隆抗体，具有多表位特异性的抗fxi/fxia抗体组合物，单克隆抗体(mab)，包括衍生自噬菌体文库的全长或完整单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，合成抗体，嵌合抗体，单结构域抗原结合蛋白和抗fxi/fxia抗体片段(见下文)，包括fab、fab'、f(ab')2和fv片段，双抗体，单结构域抗体(sdab)，单链fv's。在其它动物物种中制备的抗体例如骆驼科动物抗体或其片段(“纳米抗体”)也属于本申请的范围。此外，具有抗体样结合特性的分子如设计的重复蛋白如darpins(设计的锚蛋白重复蛋白(designedankyrinrepeatproteins))也在本申请的范围内。所有这些抗体形式都在本发明的范围内，只要它们表现出所需的生物学和/或免疫学活性。术语“免疫球蛋白”(ig)在本文可以与抗体互换使用。抗体可以是人抗体和/或人源化抗体。术语“抗fxi/fxia抗体”或者“结合fxi/fxia的抗体”是指能以足够亲和性结合fxi/fxia的抗体，由此该抗体在靶向和抑制fxi/fxia中可用作诊断剂和/或治疗剂。与天然fxi的结合亲和性可以和与fxia的相似，或者对于fxia可以比对天然fxi的高，或者与fxia相比，对于fxi的更高。在本文中，抗体在其它地方表示为抗fxia抗体或抗fxi抗体，但所有三种类型的抗fximab均被认为是在本发明的范围内。优选地，抗fxi/fxia抗体与不相关的非fxi蛋白的结合程度小于所述抗体与fxi/fxia结合程度的大约10％，例如通过放射免疫测定法(ria)或elisa测量。在某些实施方案中，结合fxi/fxia的抗体的解离常数(kd)≤1mm、≤100nm、≤50nm、≤10nm、≤5nm、≤1nm或≤0.1nm。在某些实施方案中，抗fxia抗体结合在不同物种的fxia中是保守的fxia的表位。“分离的抗体”是已经鉴别且从其天然环境的组分中分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染组分是干扰抗体治疗作用的材料，可包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在优选的实施方案中，抗体被纯化为(1)通过lowry方法测定大于抗体的95重量％，最优选大于99重量％，(2)通过使用转杯测序仪足以获得至少n-末端或内部氨基酸序列残基的程度，或(3)通过sds-page在还原或非还原条件下使用coomassie蓝或者优选银染纯化为均质程度。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境的至少一种成分将不存在。然而通常通过至少一个纯化步骤制备分离的抗体。基本的4-链抗体单位是由两条相同的轻(l)链和两条相同的重(h)链组成的异四聚体糖蛋白(igm抗体由5个基本的异四聚体单位和另外一个称为j链的多肽组成，因此含有10个抗原结合位点，而分泌的iga抗体可以聚合形成包含2-5个基本的4-链单位和j链的多价组合)。在igg的情况中，4-链单位通常为约150,000道尔顿。每个l链通过一个共价二硫键与h链连接，而两个h链根据h链同种型通过一或多个二硫键相互连接。igg4亚类由可以非共价方式连接的2个h链组成。每个h和l链还具有规则间隔的链内二硫键。每个h链在n-末端具有可变结构域(vh)，随后是每个α和γ链的三个恒定结构域(ch)以及μ和ε同种型的四个ch结构域。每个l链在n末端具有可变结构域(vl)，在其另一端具有恒定结构域(cl)。vl与vh对齐，cl与重链的第一个恒定结构域(ch1)对齐。特定的氨基酸残基被认为在轻链和重链可变结构域之间形成界面。vh和vl配对一起形成单个抗原结合位点。关于不同类别抗体的结构和性质，见例如basicandclinicalimmunology,8thedition,danielp.stites,abbai.terrandtristramg.parslow(eds.),appleton&lange,norwalk,ct,1994,page71andchapter6。来自任何脊椎动物物种的l链基于其恒定结构域的氨基酸序列可归属于称为κ和λ的两种明显不同类型之一。取决于其重链(ch)恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可归属于不同的类别或同种型。现有五类免疫球蛋白：iga，igd，ige，igg和igm，分别具有称为α、δ、ε、γ和μ的重链。基于ch序列和功能的相对较小差异，将γ和α类别进一步分为亚类，例如人表达以下亚类：igg1，igg2，igg3，igg4，iga1和iga2。抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。重链的可变结构域可称为“vh”。轻链的可变结构域可称为“vl”。这些结构域通常是抗体中最可变的部分及含有抗原结合位点。术语“可变”是指可变结构域的某些节段在抗体之间的序列差异很大的事实。v结构域介导抗原结合并定义特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性在可变结构域的110个氨基酸跨度上不是均匀分布。相反，v区由称作框架区(fr)的长度为15-30个氨基酸的相对不变的序列节段组成，以称作“互补决定区”(cdr)或“高变区”(hvr)的每个9-12个氨基酸长的较短极可变区间隔。天然重链和轻链的可变结构域均包含四个fr，主要采用β-折叠构型，由三个高变区连接，形成连接β-折叠结构的环，及在一些情况中形成β-折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过fr紧密靠近在一起，来自另一条链的高变区有助于形成抗体的抗原结合位点(见kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但呈现出各种效应子功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(adcc)。“完整”抗体是包含抗原结合位点以及cl和至少重链恒定结构域ch1、ch2和ch3的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。优选地，完整抗体具有一或多种效应子功能。用于本发明目的的“裸抗体”是未与细胞毒性部分或放射性标记缀合的抗体。“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段例如包括fab、fab'、f(ab')2和fv片段；双抗体；线性抗体(见美国专利号5,641,870实施例2；zapataetal.,proteineng.8(10):1057-1062[1995])；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点，及因此保留结合抗原的能力。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“fab”片段，及残留的“fc”片段，这一名称反映了容易结晶的能力。fab片段由整个l链以及h链的可变区结构域(vh)和一条重链的第一恒定结构域(ch1)组成。每个fab片段就抗原结合而言是单价的，即其具有单个抗原结合位点。胃蛋白酶处理抗体产生单个较大f(ab')2片段，其大致对应于具有二价抗原结合活性及仍能够交联抗原的两个二硫键连接的fab片段。fab'片段与fab片段的不同之处在于在ch1结构域的羧基端具有额外的几个残基，包括来自抗体铰链区的一或多个半胱氨酸。fab'-sh本文表示fab'，其中恒定结构域的一或多个半胱氨酸残基带有游离巯基。f(ab')2抗体片段最初是作为成对的fab'片段产生的，其之间具有铰链半胱氨酸。本领域也已知抗体片段的其它化学偶联。fc片段包含通过二硫键保持在一起的两条h链的羧基末端部分。抗体的效应子功能由fc区中的序列决定，这个区域也是在某些类型细胞上发现的fc受体(fcr)识别的部分。“fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。这个片段由紧密非共价结合的一个重链和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。在单链fv(scfv)物种中，一个重链和一个轻链可变结构域可以通过柔性肽接头共价连接，由此轻链和重链可以以与双链fv物种中相似的“二聚体”结构结合。这两个结构域的折叠中产生六个高变环(各来自h和l链的3个环)，提供用于抗原结合的氨基酸残基及赋予抗体的抗原结合特异性。然而，单个可变结构域(或仅包含三个抗原特异性cdr的fv的一半)尽管其亲和性低于整个结合位点，但是也具有识别和结合抗原的能力。“单链fv”也缩写为“sfv”或“scfv”，是包含连接成单一多肽链的vh和vl抗体结构域的抗体片段。优选地，sfv多肽进一步包含vh和vl结构域之间的多肽接头，其使sfv能够形成用于抗原结合的所需结构。关于sfv的综述，参见pluckthuninthepharmacologyofmonoclonalantibodies,vol.113,rosenburgandmooreeds.,springer-verlag,newyork,pp.269-315(1994)。如本文所用术语“单克隆抗体”是指得自一群基本上同种的抗体的抗体，即除了可能存在少量可能天然发生的突变之外，构成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体的优点还在于其可以未污染其它抗体而合成。修饰语“单克隆”不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，可用于本发明中的单克隆抗体可以通过kohleretal.,nature,256:495(1975)首次描述的杂交瘤方法制备，或者可以使用重组dna方法在细菌、真核动物或植物细胞中制备(见例如美国专利号4,816,567)。“单克隆抗体”也可以分离自噬菌体抗体文库，使用例如在clacksonetal.,nature,352:624-628(1991)和marksetal.,j.mol.biol.,222:581-597(1991)中描述的技术进行。本文所述单克隆抗体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而所述链的剩余与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及这些抗体的片段，只要其表现出所需的生物活性(见美国专利号4,816,567；morrisonetal.,proc.natl.acad.sci.usa,81:6851-6855(1984))。本发明感兴趣的嵌合抗体包括“灵长类化”抗体，其包含衍生自非人灵长类动物(例如旧大陆猴，猿猴等)的可变结构域抗原结合序列及人恒定区序列。“人源化”形式的非人(例如啮齿动物)抗体是嵌合抗体，其含有源自非人抗体的最小序列。对于大部分，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体高变区的残基由来自非人物种(供体抗体)的高变区的残基替换，所述非人物种如小鼠、大鼠、兔或者具有所需抗体特异性、亲和性和性能的非人灵长类动物。在一些情况中，人免疫球蛋白的框架区(fr)残基被相应的非人残基取代。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。通常，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的那些结构，及所有或基本上所有fr是人免疫球蛋白序列的那些结构。人源化抗体任选还包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。进一步的细节见jonesetal.,nature321:522-525(1986)；riechmannetal.,nature332:323-329(1988)；及presta,curr.op.struct.biol.2:593-596(1992)。也见于如下综述文章及其中列举的参考文献：vaswaniandhamilton,ann.allergy,asthmaandimmunol.,1:105-115(1998)；harris,biochem.soc.transactions,23:1035-1038(1995)；hurleandgross,curr.op.biotech.,5:428-433(1994)。当在本文中使用时，术语“高变区”、“hvr”是指抗体可变结构域的区域，其在序列中是高变的和/或形成负责抗原结合的结构限定的环。通常，抗体包含六个高变区：三个在vh中(h1，h2，h3)及三个在vl中(l1，l2，l3)。许多高变区域划分均在使用且包含在本文中。高变区通常包含来自“互补决定区”或“cdr”的氨基酸残基(例如根据kabat编号系统编号时，vl中大约约残基24-34(l1)、50-56(l2)和89-97(l3)，及vh中大约约31-35(h1)、50-65(h2)和95-102(h3)；kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991))；和/或来自“高可变环”的那些残基(例如根据chothia编号系统编号时，vl中的残基24-34(l1)、50-56(l2)和89-97(l3)，及vh中的26-32(h1)、52-56(h2)和95-101(h3)；chothiaandlesk,j.mol.biol.196:901-917(1987))；和/或来自“高可变环”/cdr的那些残基(例如根据imgt编号系统编号时，vl中的残基27-38(l1)、56-65(l2)和105-120(l3)，及vh中的27-38(h1)、56-65(h2)和105-120(h3)；lefranc,m.p.etal.nucl.acidsres.27:209-212(1999),ruiz,m.etal.nucl.acidsres.28:219-221(2000))。任选地，当根据honneger,a.andplunkthun,a.j.(mol.biol.309:657-670(2001))编号时，抗体在vl中如下点28、36(l1)、63、74-75(l2)和123(l3)及在vh中如下点28、36(h1)、63、74-75(h2)和123(h3)的一或多个处具有均匀插入。本发明抗体的高变区/cdr优选根据kabat编号系统定义和编号。“框架”或“fr”残基是除本文定义的高变区残基之外的那些可变结构域残基。“阻断”抗体或“拮抗剂”抗体是抑制或降低其结合的抗原的生物活性的抗体。优选的阻断抗体或拮抗剂抗体基本上或完全抑制所述抗原的生物活性。如本文所用，“激动剂抗体”是模拟感兴趣的多肽的至少一种功能活性的抗体。“物种依赖性抗体”，例如哺乳动物抗人ige抗体，是对来自第一哺乳动物物种的抗原比对来自第二哺乳动物物种的抗原的同源物具有更强的结合亲和性的抗体。通常，物种依赖性抗体与人抗原“特异性结合”(即结合亲和性(kd)值不超过大约1×10-7m，优选不超过大约1×10-8m，最优选不超过大约1×10-9m)，但对来自第二非人哺乳动物物种的抗原同源物的结合亲和性较其对于人抗原的结合亲和性弱至少大约50倍、或者至少大约500倍或者至少大约1000倍。物种依赖性抗体可以是如上定义的任何多种类型的抗体，但优选是人源化抗体或人抗体。“结合亲和性”通常是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和强度。除非另有说明，否则如本文所用“结合亲和性”是指内在结合亲和性，其反映一对结合对(例如抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子x与其配偶体y的亲和性通常可由亲和常数(kd)表示。亲和性可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些方法。低亲和性抗体通常缓慢结合抗原且易于倾向解离，而高亲和性抗体通常更快地结合抗原且倾向于保持更长时间结合。本领域已知测量结合亲和性的各种方法，其中任何方法均可用于本发明的目的。特别示例的实施方案在下文描述。“kd”或“kd值”可以根据表面等离子共振测定使用biacoretm-2000或biacoretm-3000(biacore，inc.，piscataway，nj)在25℃使用固定的抗原cm5芯片在～10-50响应单位(ru)测量。简言之，根据供应商的指导，羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(cm5，biacoreinc.)用n-乙基-n'-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)活化。将抗原用10mm乙酸钠(ph4.8)稀释至5μg/ml(～0.2μm)，然后以5μl/分钟的流速注射以获得约10个响应单位(ru)的偶联蛋白。在注射抗原后，注射1m乙醇胺以阻断未反应的基团。对于动力学测量，将在具有0.05％tween20的pbs(pbst)中两倍系列稀释的抗体或fab(0.78nm至500nm)在25℃以大约25μl/分钟的流速注射。通过同时拟合结合和解离传感图，使用简单的一对一langmuir结合模型(biacoreevaluationsoftwareversion3.2)计算结合速率(kon或ka)和解离速率(koff或kd)。平衡解离常数(kd)以koff/kon比率计算。见例如chen,y.,etal.,(1999)j.molbiol293:865-881。如果通过上述表面等离子共振测定的结合速率超过106m-1s-1，则可以通过使用荧光猝灭技术确定结合速率，该技术是在光度计中测量在ph7.2的pbs中存在增加浓度的抗原条件下20nm抗-抗原抗体(fab形式)在25℃的荧光发射强度的增加或减少(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)，所述光度计如装备截流的分光光度计(avivinstruments)或者带有红色搅拌槽的8000系列slm-aminco分光光度计(thermospectronic)。根据本发明的“结合速率(on-rate)”、“结合的速率”或“结合速率(associationrate)”或“kon”也可以使用biacoretm-2000或biacoretm-3000(biacore,inc.,piscataway,nj)根据如上述相同的表面等离子共振技术确定。“结合”感兴趣的抗原即fxi的活性中心的抗体是以足够亲和性结合所述抗原的抗体，由此所述抗体可用作抑制fxi功能活性的治疗剂，且与其它蛋白质无明显交叉反应。在这种实施方案中，通过荧光激活细胞分选(facs)分析或者放射免疫沉淀测定(ria)，确定抗体与“非靶”蛋白质的结合程度小于所述抗体与其特定靶蛋白结合程度的大约10％。关于抗体与靶分子的结合，术语“特异性结合”或“特异性结合于”或“特异于”特定多肽或特定多肽靶上的表位，是指可以测量到与非特异性相互作用不同的结合。特异性结合可以例如通过与对照分子的结合对比确定分子的结合而测量，对照分子通常是不具有结合活性的相似结构的分子。例如，特异性结合可以通过与靶相似的对照分子例如过量的未标记靶的竞争而确定。在这种情况中，如果标记的靶与探针的结合被过量的未标记的靶竞争性地抑制，则表明特异性结合。如本文所用，术语“特异性结合”或“特异性结合于”或“特异于”特定多肽或特定多肽靶上的表位可以例如通过对于靶具有如下kd(可以如上述确定)的分子呈现：至少大约10-4m、或者至少大约10-5m、或者至少大约10-6m、或者至少大约10-7m、或者至少大约10-8m、或者至少大约10-9m、或者至少大约10-10m、或者至少大约10-11m、或者至少大约10-12m或者更高。在一个实施方案中，术语“特异性结合”是指分子结合特定多肽或者特定多肽上的表位而基本上不结合任何其它多肽或多肽表位的结合。术语“表位”是分子中由抗原结合蛋白如抗体结合的部分。该术语包括能特异性结合抗原结合蛋白如抗体或者结合t细胞受体的任何决定簇。表位可以是连续的或非连续的(例如在多肽中，在多肽序列中彼此不连续但在分子中由抗原结合蛋白结合的氨基酸残基)。在某些实施方案中，表位可以是模拟物，因为其包含与用于产生抗原结合蛋白的表位类似的三维结构，但是不包含或仅包含在用于产生抗原结合蛋白的表位中发现的一些氨基酸残基。大多数情况中，表位存在于蛋白质上，但在某些情况中可存在于其它种类的分子例如核酸上。表位决定簇可以包括分子的化学活性表面基团，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基、磺酰基或硫酸基团，且可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。通常，特异于特定靶抗原的抗体在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中将优先识别靶抗原上的表位。“序列相同性”和“序列相似性”可以通过根据两个序列的长度而使用整体或局部比对算法比对两个氨基酸序列或两个核苷酸序列而确定。相似长度的序列优选使用整体比对算法比对(例如needlemanwunsch)，这是在整个长度上最佳地比对序列，而基本上不同长度的序列优选使用局部比对算法(例如smithwaterman)比对。当序列(当通过例如使用默认参数的程序gap或bestfit最佳比对时)共有至少某个最小百分比的序列相同性(如下定义)时，所述序列可以被称为“基本相同”或“基本相似”。gap使用needleman和wunsch整体比对算法在整个长度(全长)上比对两个序列，最大化匹配数及最小化缺口数。当两个序列具有相似长度时，整体比对适用于确定序列相同性。通常使用gap默认参数，缺口产生罚分＝50(核苷酸)/8(蛋白质)，缺口延伸罚分＝3(核苷酸)/2(蛋白质)。对于核苷酸，使用的默认评分矩阵是nwsgapdna，对于蛋白质，默认评分矩阵是blosum62(henikoff&henikoff,1992,pnas89,915-919)。序列比对和百分比序列相同性的评分可以使用计算机程序确定，例如gcgwisconsinpackage，version10.3，得自accelrysinc.，9685scrantonroad，sandiego，ca92121-3752usa，或者使用开源软件，例如embosswinversion2.10.0中的程序“needle”(使用整体needlemanwunsch算法)或者“water”(使用局部smithwaterman算法)，使用与上述gap相同的参数，或者使用默认设置(对于“needle”和“water”比对及对于蛋白质和dna比对，默认的缺口开放罚分为10.0，默认缺口延伸罚分为0.5，默认评分矩阵对于蛋白质是blossum62及对于dna是dnafull)。当序列具有显著不同的总长度时，优选局部比对，例如使用smithwaterman算法的。或者，百分比相似性或相同性可以通过使用如fasta、blast等算法搜索公共数据库而确定。一旦使用任何上述比对程序比对两个氨基酸序列，指定氨基酸序列a的氨基酸序列与指定氨基酸序列b的％氨基酸序列相同性(其可以措辞为指定氨基酸序列a与指定氨基酸序列b具有或包含一定％氨基酸序列相同性)如下计算：100×x/y，其中x是在a与b的程序比对中通过序列比对程序评分为相同匹配的氨基酸残基数目，y是b中氨基酸残基总数。应意识到在氨基酸序列a的长度与氨基酸序列b的长度不相等时，a与b的％氨基酸序列相同性与b与a的％氨基酸序列相同性不相等。“核酸构建体”或“核酸载体”在本文中应理解为是指得自使用重组dna技术产生的人工核酸分子。因此，尽管核酸构建体可包含(部分)天然存在的核酸分子，但是术语“核酸构建体”不包括天然存在的核酸分子。术语“表达载体”或“表达构建体”是指在与这些序列相容的宿主细胞或宿主生物体中能实现基因表达的核苷酸序列。这些表达载体通常包括至少合适的转录调节序列和任选包括3'转录终止信号。也可以存在实现表达必需的或者有帮助的其它因子，例如表达增强子元件。表达载体将被导入合适的宿主细胞中且能在宿主细胞的体外细胞培养物中实现编码序列的表达。表达载体适于在本发明的宿主细胞或生物体中复制。如本文所用，术语“启动子”或“转录调节序列”是指这样的核酸片段，其用于控制一或多个编码序列的转录，且位于编码序列的转录起始位点的转录方向的上游，以及通过存在dna依赖性rna聚合酶、转录起始位点和任何其它dna序列而被结构鉴别，所述其它dna序列包括但不限于转录因子结合位点、阻遏蛋白和激活蛋白结合位点以及本领域技术人员已知直接或间接地起作用以调节从启动子的转录量的任何其它核苷酸序列。“组成型”启动子是在大多数生理和发育条件下在大多数组织中有活性的启动子。“诱导型”启动子是例如通过应用化学诱导剂被生理学或发育调节的启动子。如本文所用，术语“可操纵地连接”是指多核苷酸元件以功能关系连接。当核酸与另一核酸序列处于功能关系时，其是“可操纵地连接的”。例如，如果转录调节序列影响编码序列的转录，则其与所述编码序列可操纵地连接。可操纵地连接是指连接的dna序列典型是连续的，在连接两个蛋白质编码区域时必需是连续的并且符合读框。发明详述本发明的抗fxi抗体本发明涉及靶向fxi的抗凝血治疗的方式和方法。fxi抑制剂具有较低的出血副作用风险，因为fxi在正常止血中起着次要作用。实际上，动物的fxi缺乏或fxi抑制对出血时间没有影响，与显著延长出血时间及在临床实践中与严重的出血副作用相关的高剂量肝素相反。因此，由于其在病理性血栓形成中的积极作用以及在正常止血中的次要作用(如果有的话)，fxi是抗凝血疗法的引人注目的靶。本发明人开发了独特的抗体以抑制人体中的fxi活性。第一方面，本发明涉及单克隆抗体(mab)，其特异性结合fxi或fxia的活性中心并抑制fxia的功能活性。fxi在本文中被理解为是哺乳动物血浆凝血因子xi。优选地，本发明的抗体特异性结合人因子xi的丝氨酸蛋白酶结构域并通过fxia抑制底物的转化。本发明的抗体抑制fxia的催化中心，如通过在生色测定中确定的其对于fxia生色活性的(部分)抑制作用而鉴别。生色底物由与对硝基苯胺(pna)偶联的小肽组成。底物的水解释放pna，其可用分光光度计测量。底物对于某些蛋白酶的特异性取决于与pna连接的肽的精确序列。在fxia的情况中，底物s2366(l-焦谷氨酰-l-脯氨酰-l-精氨酸-对硝基苯胺；chromogenix，molndal，sweden)是合适的。可以使用minnemamcetal.(blood1998；92:3294-3301)所述方法用这个底物测量fxia活性。本发明的抗体优选结合fxi和fxia中的至少一种并抑制fxia的酶活性。fxia的这些抑制的活性优选包括fix向fixa的转化、fxi向fxia的转化(在fxi的自活化期间)和生色底物的转化的一或多种。更优选地，本发明的抗体不依赖于fxi如何被激活而抑制fxi/fxia的活性。优选地，抗体通过结合或接近位于分子的丝氨酸蛋白酶结构域中的活性位点、更优选通过结合或接近参与与其底物fix相互作用的丝氨酸蛋白酶结构域中的位点而抑制fxi/fxia的活性。所述抗体优选结合天然形式的fxi以及活化形式fxia，并通过结合或接近参与与其底物fix相互作用的位点而抑制fxia的活性。因此，本发明的抗体的特征在于其结合fxi/fxia的活性位点结构域、抑制fxia的酶活性及抑制fix活化的能力。所述抗体可以通过评估其在本文实施例描述的测定中的作用加以选择。特别地，抗fxi抗体可以通过评估其对于凝血系统的凝血活性的影响加以选择，如通过在人血浆中的激活部分促凝血酶原激酶时间(aptt)确定。本发明的fxi-抗体的功能性质可以通过将其加入新鲜人血浆中，然后在常规凝学测定中测量aptt而检测。在抗体抑制fxi/fxia活性的情况中，观察到aptt延长。作为对照，检测正常血浆(正常aptt)和fxi缺陷血浆(延长的aptt)。这些凝血测定为本领域熟知(也参见本文的实施例)。本发明优选的抗体是这样的抗体：a)结合活化因子xi的轻链，b)降低因子xia对l-焦谷氨酰-l-脯氨酰-l-精氨酸-对硝基苯胺的生色活性，和c)与重链可变结构域包含seqidno:1及轻链可变结构域包含seqidno:2的抗体交叉竞争结合因子xi。本发明的抗体优选特异性结合如上文所定义的活化因子xi的轻链。因此，抗体优选以足够的亲和性结合fxi的活性中心，由此所述抗体在如上述生色测定中可用作抑制fxi的功能活性的治疗剂。优选地，所述抗体与其它蛋白质不显著交叉反应。优选地，本发明的抗体与fxi结合的亲和性小于100、50、10或5nm，更优选小于1nm。抗体对于fxi的特异性可以以本领域已知的任何合适方式确定，包括等离子表面共振和/或结合测定如酶免疫测定。本发明的抗体优选降低因子xia对于作为生色底物的l-焦谷氨酰-l-脯氨酰-l-精氨酸-对硝基苯胺(s2366)的生色活性。优选地，所述抗体将因子xia对于s2366底物的生色活性降低至少2％、5％、10％、20％或50％。本发明的抗体优选与重链可变结构域包含seqidno:1及轻链可变结构域包含seqidno:2的抗体交叉竞争结合因子xia。当本文中用于两或更多种抗体时，术语“与...竞争”或“与...交叉竞争”表示所述两或更多种抗体竞争结合fxi，例如在本文实施例1.4中描述的elisa中竞争fxi结合。对于一些抗体对，实施例1.4的测定中的竞争仅在将一种抗体包被在平板上而另一种抗体用于竞争时观测到，反之亦然。当在本文中使用时，术语“与...竞争”也旨在涵盖这种组合抗体。与由seqidno:1和2的可变结构域定义的抗体交叉竞争结合因子xia的本发明抗体优选在elisa中将如此定义的抗体与fxia的结合降低至少2％、5％、10％、20％或50％。在一个实施方案中，本发明的抗体抑制fxi/fxia的功能活性，优选是在aptt测定中在大约25-100nm的浓度下产生至少10％、20％、50％或90％fxi活性抑制的分子。更优选地，在aptt测定中在大约25-100nm的浓度，所述分子产生至少95％fxi活性抑制。优选地，本发明的抗体包含至少一个选自以下的高变区(hvr)：包含seqidno:3序列的hvr-h1，包含seqidno:4序列的hvr-h2，包含seqidno:5序列的hvr-h3，包含seqidno:6序列的hvr-l1，包含seqidno:7序列的hvr-l2和包含seqidno:8序列的hvr-l3。更优选地，所述抗体包含选自以下的2、3、4、5或6个高变区(hvr)：包含seqidno:3序列的hvr-h1，包含seqidno:4序列的hvr-h2，包含seqidno:5序列hvr-h3，包含seqidno:6序列的hvr-l1，包含seqidno:7序列的hvr-l1和包含seqidno:8序列的hvr-l3。优选地，本发明的抗体是小鼠抗体、嵌合抗体或人源化抗体，或者抗体是选自fv、单链fv(scfv)、fab、fab'、(fab')2和纳米抗体的抗体片段。本发明的优选抗体或抗体片段包含与seqidno:13-16的至少一个具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列，及其中所述抗体的轻链可变结构域包含与seqidno:17-20的至少一个具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。更优选地，所述抗体的重链可变结构域包含seqidno:16的氨基酸序列以及所述抗体的轻链可变结构域包含seqidno:20的氨基酸序列。本发明还提供了包含示例抗体的重链可变结构域、轻链可变结构域或者一或多个hvr的功能变体的抗体。在抗fxi抗体上下文中使用的重链可变结构域、轻链可变结构域或一或多个hvr的功能变体仍使得所述抗体保留至少大部分(至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高)亲本抗体的亲和性/亲合力和/或特异性/选择性，且在某些情况中，这种抗fxi抗体可能具有比亲本抗体更高的亲和性、选择性和/或特异性。这种功能变体通常与亲本抗体保持显著的氨基酸序列相同性，如可以如上文所述测定。hvr变体的序列与亲本抗体序列的hvr序列的不同可以是在大多数保守取代；例如变体中至少约35％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的取代是保守氨基酸残基置换。hvr变体的序列与亲本抗体序列的hvr序列的不同可以是在大多数保守取代；例如变体中至少10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代是保守氨基酸残基置换。在本发明文中，保守取代可以通过以下三个表中的一或多个表中呈现的氨基酸类别内的取代而定义：保守取代的氨基酸残基类别酸性残基asp(d)及glu(e)碱性残基lys(k),arg(r),及his(h)亲水性不带电荷的残基ser(s),thr(t),asn(n),及gin(q)脂肪族不带电荷的残基gly(g),ala(a),val(v),leu(l),及ile(i)非极性不带电荷的残基cys(c),met(m),及pro(p)芳香残基phe(f),tyr(y),及trp(w)备选保守氨基酸残基取代类别1ast2de3nq4rk5ilm6fyw备选氨基酸残基的物理和功能分类更保守的取代分组包括：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸，和天冬酰胺-谷氨酰胺。使用例如creighton(1984)proteins:structureandmolecularproperties(2ded.1993),w.h.freemanandcompany描述的原则也可以形成另外的氨基酸组。在本发明的一个实施方案中，与示例抗体的hvr相比，变体hvr中疏水性/亲水性性质和残基重量/大小方面的保守性也基本上保留(例如序列的重量等级，亲水性评分，或二者至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％被保留)。例如，保守残基取代也可以或者基于本领域已知的基于强或弱基于重量的保守基团的置换。相似残基的保留也可以或者通过相似性得分进行测量，如使用blast程序确定(例如可通过ncbi获得的blast2.2.8，使用标准设置blosum62，opengap＝11和extendedgap＝1)。合适的变体通常表现出与亲本肽至少大约45％、55％、65％、75％、85％、90％、95％或99％的相似性。在本发明的一个实施方案中，所述抗体包含铰链区中的突变，相对链内二硫键形成，所述突变有利于重链的链间二硫键形成。优选地，所述突变是s241p，如angeletal.(1993,molimmunol30:105-8)所述。在本发明的另一个实施方案中，所述抗体包含重链恒定区，其是igg4区，优选人或人源化igg4区，鼠igg1区，igg1区，优选人或人源化igg1区，更优选恒定区中突变的igg1，以降低或阻止补体激活或者fc受体相互作用。或者，所述抗体是单体igm抗体亚基或者单体iga抗体亚基，优选单体人(源化)igm抗体亚基或单体人(源化)iga抗体亚基。产生本发明的抗体本发明的mab可以通过从用人fxi/fxia或这些分子的一部分免疫的动物中分离免疫细胞并使这些细胞永生化以产生抗体分泌细胞系如杂交瘤而获得。根据各种纯化方法分离的人fxi、fxia、其片段如分离的fxi的丝氨酸-蛋白酶结构域和/或包含fxi氨基酸序列的合成肽可用于免疫合适的宿主动物。产生所需抗体的细胞系可以通过筛选培养上清中抗体活性的存在以及通过确定选择的抗体对fxi功能活性的影响而鉴定。mab可以用本领域技术人员熟知的各种技术产生。落入本发明范围的是任何抗体或其片段，不论其如何制成或产生，其通过结合fxi/fxia的丝氨酸蛋白酶结构域中的活性位点以及阻断fxia对底物的转化而阻断人fxi/fxia的活性。活性位点中mab的表位的位置通过证实mab(部分)抑制fxia的生色活性而证实。可以使用在各种动物体内以及在体外用人或鼠或其它动物的淋巴细胞的各种免疫方案，这些免疫方案为本领域技术人员熟知。来自具有抗人fxi抗体的患者的人淋巴细胞也可以用于产生mab，例如来自已经产生针对施用的外源性fxi的抗体应答的fxi缺陷的人(salomono等，blood2003；101：4783-8)或者具有其它原因的获得性fxi缺陷。优选通过酶联免疫吸附测定(elisa)进行杂交瘤培养上清的初始筛选步骤，所述杂交瘤是通过用fxi、fxia、其部分或用fxi肽免疫的小鼠的淋巴细胞与合适的融合配偶体融合而获得。这个测定法为本领域技术人员已知。随后，检测所述抗体对fxi(a)活性的影响。一种方便的测定是检测其对于激活部分促凝血酶原激酶时间(aptt)的影响。阻断fxi/fxia活性的抗体当加入人血浆时会延长aptt。mab或其片段的表位的位置可以通过评估mab对fxia的生色活性的影响而检测。包含本发明抗体的组合物第二方面，本发明涉及包含如上文定义的抗体或抗体片段的药物组合物。所述药物组合物进一步优选包含至少一种药学可接受的载体。所述药学可接受的载体如佐剂或载体是为了将抗体或抗体片段施用给对象。所述药物组合物可用于下文所述治疗方法，给需要的对象施用有效量的所述组合物。如本文所用，术语“对象”是指归类为哺乳动物的所有动物，包括但不限于灵长类动物和人类。所述对象优选是任何年龄或种族的男人或女人。如本文所用，术语“药学可接受的载体”是指包括与药物管理相容的任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等(见例如“handbookofpharmaceuticalexcipients”,roweetaleds.7thedition,2012,www.pharmpress.com)。这种介质和制剂用于药物活性物质为本领域熟知。除非任何常规介质或制剂与活性化合物不相容，否则考虑在组合物中使用其。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对接受者无毒，及包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵，氯己双铵，苯扎氯铵，苄索氯铵，苯酚，丁醇或苄醇，烷基对羟基苯甲酸酯如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如edta；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子如钠；金属复合物(例如锌-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如tweentm、pluronicstm或聚乙二醇(peg)。本发明的抗体可以在同一配制物或者在不同配制物中施用。施用可以是同时或相继施用，且以任一顺序均可有效。在另一个实施方案中，对本发明的抗体加以修饰以达到希望的体内血清半衰期。为此目的，可以将聚亚烷基二醇基团(例如聚乙二醇(peg)基团，聚丙二醇，聚丁二醇)或血清蛋白质如血清白蛋白或转铁蛋白与所述抗体连接或缀合和/或所述抗体的氨基酸序列可被修饰。特别地，可以修饰作为抗体的抗体恒定结构域的氨基酸序列(例如导入氨基酸取代、缺失和/或插入)。任何这些修饰因此可用于将抗体的体内血清半衰期增加至超过1、2、5、10或20天。如本领域技术人员所理解的，对本发明抗体的增加其半衰期的修饰使得所述抗体在重复施用的情况中可以以较低剂量和/或以降低的频率施用。所述药物组合物可以通过任何合适的途径和模式施用，包括静脉内或皮下注射或输注。如本领域技术人员所理解的，施用途径和/或模式将根据希望的结果而变化。对于肠胃外施用，mab可以配制为与药学可接受的肠胃外载体组合的可注射形式。这些载体为本领域熟知，例如包括盐水、葡萄糖溶液、ringer’s溶液和含有少量人血清白蛋白的溶液。通常，mab或其片段在这种载体中配制，浓度为大约20mg至大约100mg每ml。在本发明的一个实施方案中，通过静脉内注射施用所述抗体。本发明抗体的应用第三方面，本发明涉及用作药物的如上文定义的抗体或抗体片段，或者包含所述抗体或抗体片段的药物组合物。第四方面，本发明涉及预防或治疗由fxi活化介导的和/或其中fxi的抑制具有有益效果的疾病、失调和/或状况的方法。所述方法优选包括给对象以有效治疗或预防所述疾病、失调和/或状况的量施用如上文揭示的抗体或抗体片段的步骤。因此，在这方面，本发明涉及如上文定义的抗体或抗体片段或包含所述抗体或抗体片段的药物组合物用于预防或者治疗如下至少一种：i)由fxi激活介导的疾病、失调或状况；及ii)其中fxi的抑制具有有益效果的疾病、失调或状况。在本文中应理解预防或治疗疾病、失调和/或状况是指降低与所述疾病、失调和/或状况相关的疾病、失调和/或状况或症状发生的风险。优选地，在这个方面，所述疾病、失调或状况是涉及凝血的疾病、失调或状况。更优选地，所述疾病是血栓栓塞性疾病或者通过fxi激活凝血介导的炎性疾病。因此在这些实施方案中，本发明的抗体用于预防或治疗病理性血栓形成或者预防由于医疗程序导致血栓形成的风险增加的对象中的血栓形成。优选地，在这些实施方案中，所述应用是预防或治疗选自如下的至少一种疾病、失调或状况：心肌梗塞，缺血性中风，房颤引起心脏栓塞，血管通路血栓形成，深静脉血栓形成，动脉血栓形成，冠状动脉血栓形成，动脉粥样硬化，关节炎，血管炎，呼吸窘迫综合征，缺血性心脏病，缺血性脑病，肺栓塞，得自手术或卧床的静脉血栓栓塞，合成移植物、支架或av瘘的血栓形成和闭塞，人工心脏瓣膜，弥漫性血管内凝血(dic)，血液透析，房颤，败血症，脓毒性休克，器官衰竭，肾衰竭，体内施用治疗性蛋白质引起的毒性，多发性创伤，缺血再灌注损伤，局部不希望的纤维蛋白沉积和成人呼吸窘迫期间在肺泡中纤维蛋白沉积。根据另一个实施方案，本发明的抗体可用于在各种人体疾病中抑制凝血。结果，本发明的抑制剂可用于制备通过抑制体内凝血而减轻血栓栓塞失调的药物。所述抗体可以单独使用或与其它药物组合使用。在另一个实施方案中，本发明的抗体可以单独使用或以任何合适的比例与其它药物组合使用，用于制备治疗患有病理性血栓形成和/或栓塞所致疾病或疾病症状的对象或者处于这种疾病风险中的对象的药物。因此，在本发明中，可以给患有涉及凝血介导损伤的疾病的患者施用有效量的本发明抗fxi抗体，从而抑制fxi的活化。“有效量”是指抗体的浓度能够抑制凝血酶产生和纤维蛋白形成。治疗(预防性或治疗性)通常包括经肠胃外优选静脉内、动脉内、肌肉内或皮下施用本发明的抗体，例如包含所述抗体或其片段的组合物。gruberandhanson(gruberandhanson,2003,blood102:953-955)施用16-50mg/kg剂量的山羊抗fxi抗体，以实现在狒狒中对fxi的充分抑制。相反，本发明抗体的剂量和施用方案优选在相当于0.5-10mgigg每千克体重每周的剂量的剂量范围内。更优选地，本发明的抗体的施用剂量相当于小于18、16、14、12、10、8、6或4mgigg每千克体重每周的剂量和/或相当于至少0.6、0.8、1.0、1.2、1.5、2或4mgigg每千克体重每周的剂量。应理解，例如在抗体片段的情况中，使用的剂量是所示的mgigg分子每千克体重的相应量的摩尔当量。还应理解本发明抗体的剂量方案基于大约7天的人抗体的平均血清半衰期。技术人员知道怎样调整半衰期短于或长于7天的抗体剂量方案。在另一个实施方案中，当通过静脉内输注给人患者施用时，本发明的抗体提供至少50％、60％、70％、80％或90％的fxi抑制，优选剂量低于10或5mg/kg体重。或者，当通过静脉内输注给人患者施用时，本发明的抗体优选在低于10或5mg/kg体重的剂量使aptt延长至少1.1、1.2、1.25、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、2.0、2.2、2.5、3或4倍。在另一个实施方案中，当通过静脉内输注给人患者施用时，本发明的抗体在低于10或5mg/kg体重的剂量提供治疗益处。在一个实施方案中，相当于上述每周一次剂量的本发明抗体可以通过输注施用。这种施用可以根据需要重复多次。所述施用可以通过推注或输注或在少于2-24小时如2-12小时的时间内的连续输注进行。在另一个实施方案中，本发明的抗体可以在长时间如超过24小时通过缓慢连续输注施用。这种方案可以根据需要是连续的或重复一或多次，例如在6个月或12个月后。所述剂量可以通过使用靶向本发明mab的抗独特型抗体测量在生物样品中施用后循环抗fxi抗体的量而确定或调节。在另一个实施方案中，所述抗体可以通过维持治疗施用，例如每1、2、3、4或6周一次，持续6个月或更长时间。在一个实施方案中，本发明的抗体用于在例如接受定期透析的患者中预防或减少合成移植物、支架或av-瘘的血栓形成(和闭塞)。在这些患者中，所述抗体可以至少每周施用一次或数次(例如2、3或4次)，优选在患者进行透析时。在一个优选实施方案中，通过透析装置将所述抗体施用给患者，例如在回输给患者体内的透析液中。在另一个实施方案中，将本发明的抗体施用给没有常规的肠胃外通路但是需要持续抗凝治疗患者，例如患有房颤、不稳定型心绞痛、深静脉血栓形成、弥漫性血管内凝血、前列腺手术、骨科手术特别是髋关节或膝关节手术以及其它血栓栓塞性失调的患者。在这些患者中，优选每个时间段施用一定次数的所述抗体，例如每2、3、4或6周一次。基于一般知识，本领域技术人员将能选择合适的方法施用本发明抗体以在循环中或局部产生足够高水平的所述抗体以实现如下所述至少一种：(a)基本上阻断fxi活性，和(b)基本上阻断凝血酶产生，从而对于在由fxi活化介导的和/或其中fxi抑制具有有益作用的任何给定疾病、失调和/或状况中所需的期望预防或治疗作用。本发明抗体的产生和纯化本发明的抗fxi抗体可通过任何多种常规技术制备。其通常在重组表达系统中使用本领域已知的任何技术产生。见例如shuklaand(2010,“recentadvancesinlarge-scaleproductionofmonoclonalantibodiesandrelatedproteins”,trendsinbiotechnol.28(5):253–261),harlowandlane(1988)“antibodies:alaboratorymanual”,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,ny,及sambrookandrussell(2001)"molecularcloning:alaboratorymanual(3rdedition),coldspringharborlaboratory,coldspringharborlaboratorypress,ny。本领域已知的任何表达系统均可用于产生本发明的重组多肽。通常，将宿主细胞用包含编码希望多肽的dna的重组表达载体转化。因此，本发明一方面涉及包含编码本发明抗fxi抗体的核苷酸序列的核酸分子。一个核苷酸序列编码包含至少本发明抗fxi抗体的轻链可变结构域的多肽，另一个核苷酸序列编码包含至少本发明抗fxi抗体的重链可变结构域的多肽。优选的核酸分子是表达载体，其中编码本发明抗体多肽的核苷酸序列与表达调节序列例如启动子和信号序列可操纵地连接。另一方面，本发明涉及包含如本章节上文定义的核酸分子的细胞。所述细胞优选是分离的细胞或培养的细胞。可以使用的宿主细胞例如是原核生物、酵母或高等真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或杆菌。高等真核细胞包括昆虫细胞和已建立的哺乳动物来源的细胞系。示例的合适哺乳动物宿主细胞系包括猴肾细胞cos-7系(gluzmanetal.,1981,cell23:175)、l细胞、293细胞、c127细胞、3t3细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞、hela细胞、bhk细胞系、和来自非洲绿猴肾细胞系cvi的cvi/ebna细胞系，如mcmahanetal.,1991,emboj.10:2821所述。用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的合适克隆和表达载体由pouwelsetal.(cloningvectors:alaboratorymanual,elsevier,newyork,1985)描述。转化的细胞可以在促进多肽表达的条件下培养。因此，在一个方面，本发明涉及产生本发明的抗fxi抗体的方法，所述方法包括在有利于多肽表达的条件下培养包含至少一个如本文定义的表达载体的细胞的步骤，及任选包括回收所述多肽的步骤。本发明的抗fxi抗体可通过常规蛋白质纯化方法回收，包括例如蛋白质a-琼脂糖、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析(见例如lowetal.,2007,j.chromatographyb,848:48-63；shuklaetal.,2007,j.chromatographyb,848:28-39)，包括例如使用captureselecttm配体的亲和层析提供基于骆驼科动物衍生的单结构域(vhh)抗体片段的独特亲和纯化方案(见例如eifleretal.,2014.biotechnologyprogressdoi:10.1002/btpr.1958)。预期用于本发明的多肽包括基本上不含污染的内源材料的基本上同质的重组抗fxi抗体多肽。在本文件及其权利要求书中，动词“包含/包括”及其变形以其非限制性含义使用，表示包括该词后面的项目，但不排除未具体提及的项目。另外，提及某元件时使用的不定冠词“一”或“一个”不排除存在多于一个所述元件的可能性，除非上下文明确要求有且仅有一个所述元件。因此，不定冠词“一”或“一个”通常意味着“至少一个”。本说明书中引用的所有专利和参考文献均以其全部内容并入本文作参考。提供以下实施例仅用于说明目的，不以任何方式限制本发明的范围。附图简述图1：纯化的小鼠抗人fximab对于a)aptt、b)pt或者c)人血浆的fxi活性的影响。如示稀释0.2-0.9mg/ml的mab，并与人血浆1:1混合。测量混合物的aptt(a)、pt(b)或者c)fxi活性。图2：mab抗fxi34.2结合fxi的丝氨酸蛋白酶结构域中的表位，mab抗fxi15f8.3结合apple2结构域中的表位。将elisa孔用tpa与fxi的单个apple结构域(在图中表示为apple1-4)的融合蛋白或者用纯化的血浆fxi(因子xi)包被。用过氧化物酶缀合的抗小鼠igg抗体检测抗fximab的结合。mab抗fxi34.2不与任何apple结构域结合，而是仅与血浆因子xi结合，血浆因子xi除4个apple结构域外还包含丝氨酸蛋白酶结构域。图3：mab抗fxi34.2对由a)aptt试剂、b)低浓度tf(1pm)或c)高浓度tf(5pm)诱导的血浆中凝血酶产生的影响。将mab加入集合的正常人血浆中至所示终浓度。加入aptt试剂(a)、终浓度为1pm的tf(b)或者终浓度为5pm的tf(c)，如材料与方法章节所述实时测量凝血酶的产生。x轴表示时间(分钟)，y轴是在指定时间血浆中凝血酶(fiia)的浓度(nm)。图4：抗fximab34.2对于a)fxia的生色活性和b)fxia对fix的转化的影响。a)mab抗fxi34.2抑制fxia的生色活性。将纯化的fxia(～3nm)与25nm和50nm纯化的抗fximab34.2以及对照mab温育。然后用生色底物s2366评估fxia的活性。b)mab抗fxi34.2抑制fxia对fix的转化。将纯化的fxia与纯化的抗fximab温育。然后通过与纯化的fix温育评估活性。然后通过与fx温育监测fixa的产生。随后用生色底物s2222测量混合物中的fxa水平。未与mab温育的fxia设定为100％。图5：mab抗fxi34.2在体内的作用。a)mab抗fxi34.2对于小鼠ivc血栓形成的影响。给予fxi-/-小鼠人fxi，随后注射盐水或mab抗fxi34.2(8mg/kg)。然后通过将浸泡在10％fecl3中的滤纸应用于ivc上3分钟以诱导血栓形成。测量静脉血流30分钟。数据代表5只动物的平均值和sd。b)mab抗fxi34.2不影响小鼠尾部出血时间，而依诺肝素则延长尾部出血时间。给予fxi-/-小鼠人fxi，随后给予单剂盐水(对照)、依诺肝素(1mg/kg)或mab抗fxi34.2(8mg/kg)。随后诱导尾部出血并以秒记录直至停止出血的时间。每个符号代表一只动物，水平线代表中位数。图6：a)示出a)嵌合小鼠-人抗fxi34.2或者b)纯化的复合人抗人fximab对于人血浆aptt的影响。a)将嵌合mab以指定浓度加入人血浆。随后测定混合物的aptt。b)示出原始小鼠mab抗fxi34.2和小鼠-人嵌合抗体的作用以进行对比。npp＝正常集合的血浆(不含mab)。mab抗c2-60是对照mab，mab抗fxi-20d4和抗fxi-100是包括在内作为对照的非抑制性抗fximab。图7.：a)在用来自20个供体的pbmc与a)mabvh4vκ4或者b)小鼠-人嵌合mab抗fxi34.2温育后观察到的第5-8天的增殖指数。刺激指数≥2被认为是阳性的。边界增殖用星号表示。图8：mabvh4vκ4对由如下制剂诱导的血浆中凝血酶产生的影响：a)aptt试剂，b)5pmtf，c)1pmtf，或者d)0.25pmtf。将mabvh4vκ4加入集合的正常人血浆中至所示终浓度。加入aptt试剂(a)或者终浓度5pmtf(b)、1pmtf(c)或0.25pmtf(d)并实时测量凝血酶的产生。x轴表示时间(分钟)，y轴是指定时间血浆中凝血酶浓度(nm)。图9：mabvh4vk4对小鼠实验性ivc血栓形成的影响。给予fxi-/-小鼠人fxi，然后给予单剂盐水或mabvh4vk4(8mg/kg)。然后通过将浸泡在10％fecl3中的滤纸应用于下腔静脉(ivc)3分钟以诱导血栓形成。测量静脉血流30分钟。数据代表6只动物的平均值和sem。盐水对照组与图5a中的相同。图10：凝血的简化方案。为清楚起见，重要成分如磷脂膜、调节蛋白如抗凝血酶和tfpi以及蛋白c系统未示出。实施例1.材料和方法1.1材料人凝血因子fxi、fx和fix购自haematologictechnologies，inc.(essexjunction,vt,usa)。血浆fxi得自lfb(hemoleven；lfb,lesulis,france)。此外，其它来源的fxi(纯化自血浆的fxi或者得自profjcmeijers,amsterdam的重组人fxi)用作fxi来源，对于下文揭示的实验结果是无关紧要的。前激肽释放酶(pk)得自merckmillipore,darmstadt,germany。patromtinsl或kaolinsta(stago)(aptt试剂)、重组innovin和fxi缺陷血浆得自siemenshealthcarediagnostics(marburg,germany)。凝血酶校准和fluca试剂盒得自thrombinoscopebv,maastricht,thenetherlands。荧光底物z-gly-gly-arg-amc购自bachem,bubendorf,switzerland。磷脂(pc/ps/pe,40/40/20)得自avantipolarlipids,alabaster,alabama。生色底物s2366和s2222得自chromogenix(milano,italy)。tpa与fxi的各个apple结构域的重组融合蛋白如(vanmontfoortmletal.,thrombhaemost2013；110:1065-73)所述制备。依诺肝素(clexane)得自sanofi-aventis(paris,france)。1.2抗人fxi的小鼠mab的产生在用纯化的人血浆人fxi注射小鼠后，通过常规方法产生抗fxi的mab。简言之，为balb/c小鼠(雌性，6-8周龄；charlesriverlaboratories)在第0天皮下注射在完全弗氏佐剂中的纯化的fxi(每只小鼠注射在250μl磷酸盐缓冲盐水ph7.4(pbs)混合250μl完全弗氏佐剂(sigma)中的25μgfxi)。然后在第21天和第42天通过皮下注射在不完全弗氏佐剂中纯化的fxi(为每只小鼠注射在250μlpbs混合250μl不完全弗氏佐剂(sigma)中的25μgfxi)，在第63天和第64天腹膜内注射不含佐剂的fxi(为每只小鼠注射在250μlpbs中的25μgfxi))，从而加强小鼠中的抗体应答。在第67天，使用最初由kohler和milstein(1975，nature；256：495-7)描述的标准杂交瘤技术将来自免疫小鼠的脾细胞与sp2/0-ag14骨髓瘤细胞融合。简而言之，处死免疫的小鼠。从脾中取出脾细胞，并用含有glutamax(invitrogen/lifetechnologiescorp)的无血清i培养基洗涤。将对数生长的sp2/0-ag14骨髓瘤细胞在无血清培养基中洗涤并以脾细胞-骨髓瘤细胞以5:1比率的加入脾细胞。然后沉淀细胞，除去上清。在60秒内滴加1ml的37％(w/v)聚乙二醇4000溶液(merck)，之后将细胞在37℃再温育60秒。然后在轻轻搅拌下缓慢加入8ml无血清培养基，随后是含有glutamax/10％(v/v)胎牛血清(fcs；bodinco)的5mlopti-memi培养基。在室温(rt)30分钟后，沉淀细胞，用含有glutamax/10％fcs的opti-memi洗涤以除去残留的聚乙二醇，最后在氨基蝶呤选择培养基中以105细胞/200μl每孔的浓度铺板，所述培养基即具有glutamax/10％fcs的opti-memi培养基，补加50×hybri-maxtm氨基蝶呤(denovodna合成抑制剂；sigma)。从融合实验的第7天，每2-3天添加氨基喋呤选择培养基，在第13天用含有glutamax/10％fcs的opti-memi置换氨基喋呤选择培养基。从融合后第13天，使用elisa筛选杂交瘤上清的抗fxi抗体的产生，其中纯化的血浆fxi包被在96孔板上。筛选elisa如下进行。人fxi用于包被(在pbs中1μg/ml；100μl/孔)。在用pbs/0.05％tween20(w/v)充分洗涤后，将平板用pbs/0.05％tween20/1％牛血清白蛋白(bsa；roche)(w/v)在室温下封闭1小时。随后，将平板与100μl未稀释的杂交瘤上清液/孔在室温下温育1小时。在pbs/0.05％tween20中充分洗涤后，用1:5000稀释的辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠fcγ特异性抗体(jacksonimmunoresearch)在室温下1小时确定抗体的结合，然后用即用型tmb底物溶液(invitrogen)进行生色检测。加入1mh2so4后，使用微平板读器(biorad)在450nm波长(参考波长655nm)测量光密度。将在这个elisa中阳性的杂交瘤扩展并冷冻保存。进一步培养产生延长aptt的mab的杂交瘤。根据制造商的说明书，使用预充填柱(pharmaciahealthcare)通过蛋白g层析法从这个上清中纯化小鼠igg。在elisa中检测抗fximab与前激肽释放酶(pk)的交叉反应性，所述elisa与上述elisa相似，不同之处是使用100ng/孔的纯化pk代替fxi进行包被，省略了用bsa的封闭步骤，及使用1/1000稀释的山羊抗小鼠fcγ特异性抗体(santacruz)检测结合的mab。包括用bsa包被的孔作为对照。1.3表面等离子共振表面等离子共振在配备有研究级cm5传感器芯片的biacore2000(gehealthcare)上进行，以评估mab对fxi的亲和常数。使用胺偶联化学方法固定因子xi。将表面用0.1mn-羟基琥珀酰亚胺和0.1m3-(n，n-二甲基氨基)丙基-n-乙基碳二亚胺的1:1混合物以10μl/分钟的流速活化7分钟。将浓度为在ph5.5的10mm乙酸钠中10μg/ml的配体以1000ru密度固定。未处理的流动池用作参考表面。将所有表面净注射7分钟1m乙醇胺(ph8.0)而封闭。以下方案用于评估mab与fxi的动力学结合。将分析物注射到两个流动池，浓度范围为在10mmhepes、150mmnacl、0.01％tween20(ph7.4)中6.25-100nm，流速为60μl/min，温度为20℃。使所述复合物分别结合和解离360秒和600秒。用注射10秒50mmnaoh再生表面。每个样品一式三份注射(以随机顺序)，空白缓冲液在两个表面上流动。以1hz的速率收集数据。使用biaevaluation4.1软件中提供的全局数据分析选项，将数据拟合为简便的1:1交互作用模型。1.4fxi结构域上抑制性mab表位的定位如(meijersjcetal.,biochemistry1992；31:4680-4)所述，将fxi的各个apple结构域与tpa表达为融合蛋白。使用elisa评估mab与这些融合蛋白的结合，其中将四种融合蛋白以及纯化的血浆fxi以1μg/ml浓度包被在elisa板上，随后与不同的mab温育(vanmontfoortetal.,thrombhaemost2013；110:1065-73)。然后用过氧化物酶缀合的抗小鼠igg测量mab与融合蛋白的结合，并通过与邻苯二胺-二盐酸盐(opd)温育以检测与平板结合的抗体。结果以在490nm的od表示。1.5凝血测定凝血酶原时间(pt)和激活部分促凝血酶原激酶时间(aptt)在自动凝血分析仪(behringcoagulationsystem)上使用制造商(siemenshealthcarediagnostics)的试剂和方案进行测量。为了检测mab的作用，将杂交瘤上清与等体积的新鲜人血浆混合。通过与用纯化的fxi(25nm和更低)稀释液1:1混合的fxi缺陷血浆进行比较，定量杂交瘤上清对fxi活性的影响。结果以fxi的％抑制表示，未添加fxi的fxi缺陷血浆设定为100％抑制，而与25nmfxi混合的血浆设定为0％抑制。纯化延长aptt的mab以及一些对照mab，加入血浆中并检测对于aptt、pt和fxi活性的影响。1.6血浆中凝血酶的产生如hemkeretal(pathophysiolhaemostthromb2002；32:249-53)和制造商(thrombinoscope,maastricht,thenetherlands)提供的手册所述测量实时血浆中的凝血酶生成。简而言之，在存在1或5pm重组人组织因子(innovin，siemenshealthcarediagnostics)、或者aptt试剂(8倍稀释；pathromtinsl，siemenshealthcarediagnostics)、4μm磷脂和417μm荧光底物z-gly-gly-arg-amc(bachem，bubendorf，switzerland)的条件下通过血浆复钙作用触发凝血。使用fluoroskanascent荧光计(thermolabsystems，helsinki，finland)监测荧光，并使用软件计算内源性凝血酶潜力(etp)、峰值、达峰时间、滞后时间和速度指数。1.7评估mab对fxi活化的影响的测定在25mmhepesph7.4、137mmnacl、3.5mmkcl、3mmcacl2和0.1mg/ml牛血清白蛋白(bsa)中进行生色测定。为评估抗fximab对fxiia激活fxi的影响，将100nm纯化的fxi与1-10倍摩尔过量的mab在室温(rt)温育30分钟。接着，加入5mmfxiia并将样品在室温温育2小时。然后用生色底物s2366(0.5mm)测量混合物中的fxia水平。在有和没有50nm高分子量激肽原(hk)的条件下进行这个测定。在相应实验中，评估抗fximab对凝血酶(fiia)激活fxi的影响。将fxi(50nm)与10倍过量的mab在室温温育30分钟。然后加入10nm凝血酶并将混合物温育过夜。通过加入1u水蛭素(以阻断凝血酶)和生色底物s2366(0.5mm)测量混合物中产生的fxia的量。1.8评估mab对fxia活性影响的测定为评估纯化的抗fximab对fxia的酶活性的影响，将fxia和纯化的mab分别在终浓度50nm和500nm的生色测定缓冲液中在37℃温育30分钟。然后加入终浓度为0.5mm的生色底物s2366并在405nm测量底物的转化。在一些实验中，为证实mab抗fxi34.2对fxia的生色活性的影响，使用略微不同的条件，即2.5nmfxia和25nm抗fximab。为评估抗fximab对fxia激活fix的影响，将10nmfxia与抗fximab在具有7mmcacl2的生色底物缓冲液中在37℃温育30分钟，然后加入100nmfix并将混合物在37℃温育10分钟。为评估混合物中的fixa，加入纯化的fx(100nm)和生色底物s2222(0.5mm)。然后在405nm测量生色底物的转化。1.9小鼠实验性血栓形成模型动物处理程序在academicmedicalcenter(amsterdam,thenetherlands)进行，并由该研究所的animalcareandusecommittee批准。本研究中包括c57bl/6背景的8周龄雄性和雌性因子xi敲除小鼠(fxi-/-小鼠)(rosenedetal.,thrombhaemost2002；87:774-6)。将小鼠以恒定的明暗周期圈养在微型隔离笼中，随意获取食物和水。在诱导血栓形成的外科手术之前，给动物补充5u人血浆因子xi浓缩物(1单位是存在于1ml集合的正常人血浆中的fxi的量)。此后，为小鼠静脉内注射mab(8mg/kg)或盐水。在手术前6小时皮下注射依诺肝素(lmwh；1mg/kg)。使用氯化铁(fecl3)诱导的下腔静脉(ivc)血栓形成的已确立的小鼠血栓形成模型评估mab的效力。简而言之，用2.5％吸入异氟醚和氯胺酮/赛拉嗪(2:1)的混合物麻醉fxi-/-小鼠。然后进行中线切口并钝性暴露ivc。随后，将浸泡在10％fecl3溶液中的滤纸置于ivc上肾静脉下方3分钟。除去滤纸并使用组织灌注监测仪(型号blf22；transonicsystemsinc.ithaca,ny,usa)测量30-45分钟的静脉血流。在施用fecl3之前的流量设定为100％并用作参考。施用后的流速计算为这种施用前流量的％。每次处理研究6只小鼠的组。1.10出血测定如所述使用小鼠尾部出血测定(wangxetal.,jthrombhaemost2006；4:1982-8)。简而言之，将小鼠麻醉并置于37℃的加热垫上。在尾部直径约1mm(距末端2-4mm)处切割尾部并置于37℃的盐水中。记录直至出血停止的时间。30分钟后，即使动物仍在出血，实验也停止，并处死动物。通过测量用于从出血尾部收集血液的盐水溶液在575nm的od评估失血情况。1.11mab抗fxi34.2的cdna的克隆将杂交瘤细胞用pbs洗涤，等份并在-80℃以沉淀储存。使用rneasymini分离试剂盒(qiagen)从这些沉淀中分离rna。用分光光度计(a260nm)测定rna浓度。通过逆转录酶，使用revertaidtmhminusfirststrandcdna合成试剂盒(fermentas)从2μgrna合成cdna，储存在-20℃直至进一步使用。设计同种型特异性引物(有义和反义)以扩增小鼠mab抗fxi34.2的v区(表1)。表1.用于克隆mab抗fxi34.2的cdna的pcr引物。简并引物：m＝c或a；r＝a或g；及w＝a或t。为确认mab抗fxi34.2的v区序列，制备嵌合人igg4形式的mab抗fxi34.2，其中将恒定的小鼠κ和ch结构域交换为人结构域。为确保重链间二硫键，在序列中导入铰链区中的突变(s241p；angalsetal.,molimmunol1992；30:105-8)。为此，编码嵌合人igg4重链和编码嵌合人κ轻链的cho细胞优化的cdna序列购自geneart(regensburg，germany)，其编码鼠信号肽，随后是与人igg4恒定区连接的鼠可变重链或者随后是与人κ恒定区连接的鼠可变轻链。使用freestyletmmaxcho(cho-s细胞)表达系统(invitrogen)在cho细胞中表达抗体，用蛋白a亲和层析(gehealthcare)纯化并通过其中人fxi用作包被的elisa检测与人fxi的结合，及通过在人血浆中加入蛋白g纯化的制备物及测量aptt检测功能活性。1.12小鼠mab抗fxi34.2的人和去免疫变体使用复合人抗体(compositehumanantibody)技术(www.antitope.co.uk)对小鼠mab抗fxi34.2的序列进行人源化及去免疫化。复合人抗体包含衍生自不相关的人抗体的v区的多个序列节段(“复合物”)。将衍生自人v区数据库的所有选择的序列节段针对潜在t细胞表位的存在经计算机过滤。为此，首先确定被认为对起始抗体的抗原结合至关重要的氨基酸。然后使用mab抗fxi34.2的vh和vκ结构域的序列选择衍生自不相关的人v区数据库的同源序列节段。设计4种不同的vh和4种不同的vκ序列，产生16种不同抗体。然后使用编码选择的人序列节段组合的合成寡核苷酸产生v区基因。然后将这些克隆进含有人igg4重链和κ轻链的载体中，所述人igg4重链含有铰链稳定突变s241p(angalsetal.,molimmunol1992；30:105-8)。通过电穿孔将嵌合抗体基因和选择的抗fxi34.2igg4(s241p)的所有组合稳定转染进ns0细胞中。每个细胞系的特性通过对来自基因组dna的可变结构域进行dna测序而确认。选择最佳表达系并用于表达17种mab(16种compositehumanantibodytm变体，以及小鼠-人嵌合mab抗fxi34.2)。在蛋白质a琼脂糖柱(gehealthcare)上从细胞培养上清纯化重组抗体。为检测各种mab与人fxi的结合，首先使用竞争elisa，其中人fxi用于包被，生物素化鼠mab抗fxi34.2用作参照抗体。为此，将纯化的鼠mab抗fxi34.2抗体的系列稀释液与嵌合抗体及浓度为16.66μg/ml至0.023μg/ml的16种mab抗fxi34.2的复合变体中的每一种与恒定浓度的生物素化鼠mab抗fxi34.2(0.12μg/ml，终浓度)预混合，然后在室温在用在1×pbsph7.4中稀释的0.5μg/ml因子xi预包被的nuncimmunomaxisorp96孔平底微滴定板上温育1小时。用链霉抗生物素蛋白-hrp(sigma)和opd底物(sigma)检测生物素化抗体的结合。用3mhcl终止反应，在dynextechnologiesmrxtcii读板仪上读取490nm处的吸光度，及绘制结合曲线。1.13评估人源化mab34.2的免疫原性的体外模型使用hla分型的供体的外周血单个核细胞在体外评估lead完全人复合lead抗fximab的免疫原性潜力(episcreentmtechnology；antitope,cambridge,uk)。简而言之，使用lymphoprep(axis-shield，dundee，uk)密度离心随后通过t细胞耗竭(cd8+rosetteseptm；stemcelltechnologiesinc，london，uk)从健康供体血沉棕黄层中分离外周血单个核细胞(pbmc)。使用基于hlassp-pcr的组织分型试剂盒(biotest，solihull，uk)对供体进行hla-dr单倍型分型。选择来自代表在世界和欧洲/北美人群中表达的hla-dr同种异型的数量和频率的20个供体的pbmc，将其与纯化的复合抗体一起温育，终浓度为50μg/ml每样品。对于每个供体，还包括再现性对照(细胞与100μg/ml匙孔血蓝蛋白(klh)温育，pierce(perbio)，cramlington，ukklh)、临床对照(50μg/ml人源化a33抗体)、仅作为对照的培养基以及对照嵌合小鼠-人mab抗fxi34.2。将培养物培养共8天。在第5、6、7和8天，细胞增殖通过在具有0.75μci[3h]-胸苷(perkinelmerr，beaconsfield，uk)的圆底96孔板中脉冲3×100μl等份试样18小时而测量。然后将细胞收集在滤垫(perkinelmerr)上，通过meltilextm(perkinelmerr)闪烁计数确定每个样品每分钟计数(cpm)。然后通过评估与检测样品温育的pbmc和仅用培养基孵育的pbmc的增殖比率(cpm)确定刺激指数(si)。刺激指数≥2被认为表示显著反应。2.结果2.1产生针对人fxi的抑制性抗体产生了32个杂交瘤，其产生在elisa中与人fxi结合的mab。将这些杂交瘤的上清加入人血浆中并检测在aptt中的抑制活性。在这个aptt中，补加不同量fxi的fxi缺陷血浆用作参考。两种杂交瘤上清，抗fximab34.2和抗fximab15f8.3，抑制fxi超过90％。将这些mab通过限制稀释亚克隆及通过蛋白g亲和层析从杂交瘤上清纯化。将纯化的mab加入人血浆中并检测对aptt和pt凝血活性的影响(图1a和1b)。mab34.2和15f8.3剂量依赖地延长aptt，而其不影响pt。此外，对照(非抑制性抗fxi)mab在aptt检测中无作用。最后，将纯化的mab和人血浆的混合物在fxi凝血测定中检测(图1c)。结果参照人血浆集合的稀释度表示为％fxi活性，人血浆集合被称作含有100％fxi。延长aptt的两种mab使人血浆中的fxi活性降低>90％，而其它抗体无作用(图1c)。使用等离子表面共振(biacore)，发现人fxi的mab34.2的kd为0.2nm，而mab15f8.3的kd为0.15nm。2.2表位作图为对fxi结构域上其表位作图，将mab在elisa孔中温育，所述elisa孔用单个apple结构域与tpa的重组融合蛋白包被或者用血浆fxi包被。mab与elisa板的结合用过氧化物酶缀合的抗小鼠igg评估。使用这个系统，发现mab抗fxi15f8.3的表位位于apple2结构域，而mab抗fxi34.2不结合任何apple结构域及仅结合血浆fxi，提示其表位位于fxi的丝氨酸蛋白酶结构域中(图2)。2.3抑制性抗fximab对血浆中凝血酶产生的影响为进一步评估抗fximab对fxi活性的影响，在不存在或存在抗fximab的情况中，通过高浓度组织因子(tf；5pm)、低浓度tf(1pm)或aptt试剂的各种刺激在人血浆中产生凝血酶，并实时测量。mab抗fxi34.2(图3a)和抗fxi15f8.3(数据未示出)剂量依赖地降低由aptt试剂诱导的凝血酶产生，由此预期是因为这两种抗体在加入人血浆时均延长aptt(参见图1a)。已知由低浓度tf诱导的血浆中凝血酶的产生部分依赖于fxi。当通过低浓度tf在血浆中诱导凝血酶产生时，仅mab抗fxi34.2剂量依赖地将凝血酶降低直至30-40％(图3b)。相反，mab15f8.3通过低浓度tf未减少凝血酶产生(数据未示出)。mab抗fxi34.2(图3c)和mab抗fxi15f8.3(数据未示出)对高浓度tf诱导的凝血酶产生均无影响。从这些实验可以推断mab抗fxi34.2不依赖于激活机制而抑制fxi，而mab抗fxi15f8.3仅在由fxiia激活时抑制fxi。因此，选择mab抗fxi34.2用于进一步鉴定和人源化。2.4单克隆抗体抗fxi34.2通过结合fxi的活性位点及阻止fix活化而抑制fxi活性针对fxi/fxia活性位点的mab通常抑制fxia底物的转化，包括小底物如生色底物的转化。诸如fix的大底物也与在活性位点外fxia上称作外部位点的位点相互作用，而小底物仅与活性位点相互作用。因此，mab对fxia的生色活性的抑制表明所述mab的表位与活性位点(至少部分)重叠。针对exocyte的抗体的特征在于其抑制fxia对大底物的转化，但对fxia的生色活性没有影响。mab抗fxi34.2结合丝氨酸蛋白酶结构域(图2)，并抑制fxi在血浆中的功能活性(图1c)。接着检测这个mab对于fxia转化小底物的影响。将纯化的因子xia与mab抗fxi34.2以及与对照mab一起温育。然后用生色底物s2366测量剩余的fxia活性。mab抗fxi-34.2具有较小的抑制作用，而其它mab均不抑制fxia生色活性(图4a)。在整个实验期间始终观测到mab抗fxi34.2的这种较小作用，且在使用抗fxi34.2的重组嵌合人-小鼠mab形式的另一个实验中也观测到。由于生色底物s2366由与对硝基苯胺(l-焦谷氨酰-l-脯氨酰-l-精氨酸-对硝基苯胺)连接的小三肽组成，因此mab抗fxi34.2的抑制作用表明其结合与fxia活性位点(至少部分)重叠的表位。值得注意的是，mab抗fxi34.2与未激活的fxi具有高亲和性(表面等离子共振示出表观kd为0.2nm；参见结果章节2.1)，因此mab抗fxi34.2的表位在fxi以及fxia上表达。生色底物相对小，而fxia的天然底物凝血因子ix(fix)是相对大的底物。在另一组实验中，通过监测fix转化为fixa测量fxia的活性。用fx作为底物(其被转化为fxa)测量fixa活性，然后用生色底物s2222测量。mab抗fxi34.2通过fxia抑制fix转化为fixa，而对照mab没有作用(图4b)。因此，这个实施例中的实验表明，mabfxi34.2通过结合(至少部分)位于活性位点的表位而抑制fxia的底物转化，从而抑制fxi活性。mab抗fxi34.2的这种作用机制是独特的，且之前针对人fxi抗体未曾描述。2.5mab抗fxi34.2在小鼠模型中对实验性血栓形成的作用补充人fxi(vanmontfoortmetal.,thrombhaemost2013；110:1065–73)的fxi敲除小鼠的下腔静脉(ivc)血栓形成小鼠模型(wangxet.,jthrombhaemost2006；4:1982-8)用于评估mab抗fxi34.2的作用。在没有外源性fxi的情况中，fxi-/-小鼠中的aptt>150秒，野生型小鼠的aptt为25-34秒。通过对ivc施用10％fecl3诱导ivc血栓形成。在施用10％fecl3后1分钟内观测到通过ivc的血流迅速下降(图5a中的盐水组)。在45分钟的观测期，依诺肝素处理的小鼠完全防止了这种fecl3诱导的血流受损(vanmontfoortmetal.,thrombhaemost2013；110:1065–73；见文章图7)。在用氯化铁诱导血栓形成之前施用mab抗fxi34.2，在整个观察期内防止血流受损(图5a)。为评估mab抗fxi34.2对正常止血的影响，使用尾部出血测定(wangxet.,jthrombhaemost2006；4:1982-8)。mab抗fxi34.2对尾部出血时间没有影响，相反依诺肝素明显延长尾部出血时间(图5b)。相反，依诺肝素治疗的动物出血直至观测时间结束(30分钟)。因此，这个实施例中描述的实验表明mab抗fxi34.2与依诺肝素同样有效防止血栓形成，但与依诺肝素相反，mab抗fxi34.2不影响出血时间。2.6mab抗fxi34.2的cdna序列如上文方法章节所述克隆mab抗fxi34.2的vh和vκ区。mab抗fxi34.2的vh和vκ结构域的氨基酸序列在序列表中分别示作seqidno.1和2。这些序列用于构建嵌合mab，其具有与人igg4的ch结构域和人cκ结构域连接的小鼠vh和vκ可变结构域。将小鼠-人嵌合mab抗fxi34.2在cho细胞中表达，纯化并通过将其与正常血浆混合并测量混合物的aptt以检测其抑制活性(图6a)。如图6a所示，mab抗fxi34.2和小鼠-人嵌合mab抗fxi34.2剂量依赖地降低aptt。2.7mab抗fxi34.2的人源化基于mab抗fxi的序列，使用复合人抗体平台(antitope，cambridge，uk)设计具有最小(如果有的话)免疫原性的复合人抗fximab。发现mab抗fxi34.2的vh和vκ序列由典型的构架残基和cdr1、2和3基序组成，如表3所示。表3.mab抗fxi34.2的重链和轻链可变结构域中的cdr(高变区)的氨基酸序列。蛋白质序列编号根据kabat。根据上述分析，认为可以产生mab抗fxi34.2的复合人序列，其在cdr外有许多替代残基，但在cdr序列内仅具有少数可能的残基。初步分析表明，来自一些人抗体的相应序列节段可以组合以产生与在鼠序列中的cdr相似或相同的cdr。对于cdr外侧和侧翼区域，广泛选择的人序列节段被鉴定是新复合人抗fxi抗体v区的可能组分。基于结构分析，选择可用于产生人源化mab抗fxi34.2的一大组初步序列节段，并经计算机分析已知抗体序列相关的t细胞表位的存在情况。弃去经鉴别在人体中具有潜在免疫原性的序列节段。这样获得数目减少的序列节段组。再次分析这些组合的潜在免疫原性以确保节段之间的连接不含有潜在的t细胞表位。将选择的序列节段组装成完整的v区序列，其没有显著的t细胞表位。然后选择四个优选的重链(vh1-4)和四个轻链序列(vκ1-4)。表4提供了表示四个优选重链(vh1-4)和四个轻链序列(vκ1-4)的氨基酸序列的seqidno的概述。表4.重链的4个不同可变区(vh变体1-4)和轻链的4个(vκ变体1-4)的序列。蛋白质序列编号根据kabat。合成mab抗fxi34.2的所有变体compositehumanantibodytmvh和vκ区基因并与κ轻链和igg4(s241p，铰链突变体；angalsetal.,molimmunol1992；30:105-8)重链一起表达。通过测序证实构建体。也表达原始小鼠mab抗fxi34.2抗体的vh和vκ序列。通过电穿孔将嵌合抗体基因和复合mab抗fxi34.2igg4(s241p)vh和vκ链的所有可能组合(即共16对，即vh1与vκ1、vκ2、vκ3或vκ4组合，vh2与vκ1、vκ2、vκ3或vκ4组合等)稳定转染进ns0细胞中。mab抗fxi34.2的各种复合人变体根据其链组成进一步标示，即vh1vκ1、vh2vκ4等。最佳表达系用于表达17种mab(16种compositehumanantibodytm变体，及小鼠-人嵌合mab抗fxi34.2)。在蛋白a琼脂糖柱(gehealthcare)上从细胞培养上清中纯化重组抗体及在竞争elisa中检测与人fxi的结合，如方法章节所述。结果表明mab抗fxi34.2的所有复合变体与小鼠-人嵌合mab抗fxi34.2同等地结合人fxi(数据未示出)。然后将数据用于计算每种抗体的ic50值并将这些值标准化为嵌合小鼠-人mab抗fxi34.2抗体的ic50(表5)。所有检测的变体的标准化ic50数据在0.69-1.13的范围内，表明所有复合抗fximab的结合效率与嵌合34.2的结合效率相似。此外，大多数变体通过相应的ns0细胞系比嵌合抗体更好地表达。表5.衍生自mab抗fxi34.2的复合人mab的相对ic50、kd和相对aptt为证实复合人抗fximab的亲和性，使用biacore系统通过等离子表面共振检测其与fxi的结合。小鼠mab抗fxi34.2结合fxi的kd为0.2nm。结果总结在上表5中。与kd为0.2nm的小鼠mab抗fxi34.2相比，用0.071-1.14nm范围的复合人mab测量的亲和性(表5)表明对一些抗fxi复合mab的亲和性略低，对其它抗fxi复合mab的亲和性略高。通过将纯化的mab与正常人血浆混合并通过测量血浆混合物的aptt而评估复合mab的抑制活性。结果表明，所有复合人抗fximab均使aptt延长相应程度(参见图6b；表5)。这些实验表明，所有复合人抗fxi抗体均具有原始小鼠mab抗fxi34.2(kd为0.2nm)的范围内的亲和性，可能除外复合mabvh2vκ3和vh4vκ1，其kd略为高于小鼠mab的。关于在aptt中测量的功能活性，所有复合mab也具有与小鼠mab抗fxi34.2相似的抑制活性。最后，所有mab在ns0细胞中具有适当的表达水平。预计复合mabvh4vκ4具有最低的免疫原性潜力，且由于这种mab与大多数其它mab在亲和性、功能活性和表达方面是相似的，因此选择这种复合mabvh4vκ4进一步分析。值得注意的是，这种抗体形式是人igg4，因为预期在体内使用其不与补体或fcγ-受体相互作用。在igg4重链中导入铰链区中的突变(s241p)，因为这个突变有利于igg4重链的链间二硫键形成，而不是链内二硫键形成。2.8mabvh4vκ4的免疫原性潜力通过与来自一组20个健康供体的pbmc温育并适时测量细胞增殖以测试mabvh4vκ4的免疫原性潜力。在这个检测中，在50μg/ml终浓度检测mabvh4vκ4。为进一步改进测定，在第5-8天每日四次测量增殖情况以测量t细胞活化。mabvh4vκ4不影响pbmc生存力，如用来自6个供体的细胞及在培养7天后pbmc台盼蓝染料排除而确定(图7a)。此外，图7b示出用小鼠-人嵌合mab抗fxi34.2观测的增殖结果。可以看出，来自4个供体的pbmc显著增殖，来自另一个供体的pbmc出现边界增殖。通常，用mabvh4vκ4观测的刺激指数低于用嵌合mab抗fxi34.2观测的刺激指数，仅一次观测到si高于2。这些数据表明与嵌合mab相比，与mabvh4vκ4温育时cd4t细胞的增殖较少。因此，这些结果支持了与小鼠-人嵌合mab抗fxi34.2相比，mabvh4vκ4的较低免疫原性潜力。2.9在体外检测mabvh4vκ4在人血浆中加入纯化的mabvh4vκ4几乎消除了由aptt试剂诱导的凝血酶产生(图8a)，而tf对凝血酶产生的影响取决于用于在血浆中产生凝血酶的tf的剂量(图8b-d)。因此，mabvh4vκ4在这些实验中示出fxi抑制剂的典型性质，其完全抑制由aptt试剂诱导的凝血酶产生，在低浓度tf情况中部分抑制凝血酶产生及在高浓度tf情况中不抑制凝血酶产生。2.10在小鼠血栓形成模型中在体内检测mabvh4vκ4如2.5章节所述在小鼠血栓形成模型中在体内检测mabvh4vκ4。在用fecl3诱导血栓形成之前施用人源化mabvh4vκ4在整个观测期间可防止血流受损，表明mabvh4vκ4有效地防止血栓形成(图9)。序列表<110>普希克斯私人有限公司<120>抗因子xi的活性位点的单克隆抗体及其用途<130>p6059802pct<150>nl2016477<151>2016-03-23<160>28<170>patentinversion3.3<210>1<211>117<212>prt<213>musmusculus<400>1glnvalglnleuglnglnproglysergluleuvalargproglyala151015servallysleusercyslysalaserglytyrthrphethrargtyr202530trpmethistrpvallysglnarghisglyglnglyleuglutrpile354045glyasniletyrproaspseraspserthrasntyraspglulysphe505560argthrlysalathrleuthralaaspthrserserserthralatyr65707580methisleuserserleuthrsergluaspseralavaltyrtyrcys859095thrargmetglyphetyralametasptyrtrpglyglnglythrser100105110valthrvalserser115<210>2<211>108<212>prt<213>musmusculus<400>2asnilevalmetthrglnserprolyssermetsermetservalgly151015gluargvalthrleusercyslysalasergluasnvalvalthrtyr202530valsertrppheglnhislysprogluglnserprolysleuleuile354045tyrglyalaserasnargtyrthrglyvalproaspargphethrgly505560serglyseralathraspphethrleuthrileserservalglnala65707580gluaspleualaasptyrhiscysglyglnsertyrsertyrproleu859095thrpheglyalaglythrlysleugluleulysarg100105<210>3<211>5<212>prt<213>musmusculus<400>3argtyrtrpmethis15<210>4<211>17<212>prt<213>musmusculus<400>4asniletyrproaspseraspserthrasntyraspglulysphearg151015thr<210>5<211>8<212>prt<213>musmusculus<400>5metglyphetyralametasptyr15<210>6<211>11<212>prt<213>musmusculus<400>6lysalasergluasnvalvalthrtyrvalser1510<210>7<211>7<212>prt<213>musmusculus<400>7glyalaserasnargtyrthr15<210>8<211>9<212>prt<213>musmusculus<400>8glyglnsertyrsertyrproleuthr15<210>9<211>26<212>dna<213>artificial<220><223>heavychainsenseprimer<400>9atggratggagckgggtctttmtctt26<210>10<211>21<212>dna<213>artificial<220><223>heavychainantisenseprimer<400>10cagtggatagacagatggggg21<210>11<211>24<212>dna<213>artificial<220><223>lightchainsenseprimer<400>11atgggcwtcaaagatggagtcaca24<210>12<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>lightchainantisenseprimer<400>12actggatggtgggaagatgg20<210>13<211>117<212>prt<213>artificial<220><223>34.2mabhumanizedheavychainvariabledomainvariant1<400>13glnvalglnleuvalglnserglysergluleulyslysproglyala151015servallysleusercyslysalaserglytyrthrphethrargtyr202530trpmethistrpvallysglnalahisglyglnglyleuglutrpile354045glyasniletyrproaspseraspserthrasntyraspglulysphe505560argthrargalathrleuthralaaspthrserthrserthralatyr65707580methisleuserserleuthrsergluaspseralavaltyrtyrcys859095thrargmetglyphetyralametasptyrtrpglyglnglythrser100105110valthrvalserser115<210>14<211>117<212>prt<213>artificial<220><223>34.2mabhumanizedheavychainvariabledomainvariant2<400>14glnvalglnleuvalglnserglysergluleulyslysproglyala151015servallysleusercyslysalaserglytyrthrphethrargtyr202530trpmethistrpvallysglnalaproglyglnglyleuglutrpile354045glyasniletyrproaspseraspserthrasntyraspglulysphe505560argthrargalathrleuthralaaspthrserthrserthralatyr65707580metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys859095thrargmetglyphetyralametasptyrtrpglyglnglythrthr100105110valthrvalserser115<210>15<211>117<212>prt<213>artificial<220><223>34.2mabhumanizedheavychainvariabledomainvariant3<400>15glnvalglnleuvalglnserglysergluleulyslysproglyala151015servallysleusercyslysalaserglytyrthrphethrargtyr202530trpmethistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpile354045glyasniletyrproaspseraspserthrasntyraspglulysphe505560argthrargvalthrleuthralaaspthrserthrserthralatyr65707580metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys859095thrargmetglyphetyralametasptyrtrpglyglnglythrthr100105110valthrvalserser115<210>16<211>117<212>prt<213>artificial<220><223>34.2mabhumanizedheavychainvariabledomainvariant4<400>16glnvalglnleuvalglnserglysergluleulyslysproglyala151015servallysleusercyslysalaserglytyrthrphethrargtyr202530trpmethistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpile354045glyasniletyrproaspseraspserthrasntyraspglulysphe505560argthrargvalthrleuthralaaspthrserthrserthralatyr65707580metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys859095thrargmetglyphetyralametasptyrtrpglyglnglythrthr100105110valthrvalserser115<210>17<211>108<212>prt<213>artificial<220><223>34.2mabhumanizedlightchainvariabledomainvariant1<400>17asnilevalmetthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcyslysalasergluasnvalvalthrtyr202530valsertrppheglnglnlysproglyglnalaprolysleuleuile354045tyrglyalaserasnargtyrthrglyvalproaspargphethrgly505560serglyseralathraspphethrleuthrileserserleuglnala65707580gluaspvalalaasptyrhiscysglyglnsertyrsertyrpro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