用于分析物检测的方法、组合物和传感器与流程

本发明涉及通过荧光信号检测分析物的方法，用于产生所述信号的组合物和用于实施所述方法的传感器。

背景技术：

芬顿试剂是过氧化氢与铁(ii)化合物的溶液，其用于通过铁(ii)化合物的歧化形成氧自由基：

fe²⁺+h2o2→fe³⁺+ho·+oh^-

fe³⁺+h2o2→fe²⁺+hoo·+h⁺

woodward,j.等人‘couplingofglucoseoxidaseandfenton’sreactionforasimpleandinexpensiveassayofbeta-glucosidase’enzymemicrob.technol.1985,7,449-453公开了在硫酸亚铁氧化成硫酸铁时紫外光吸收的增加。提出了葡萄糖氧化酶和芬顿试剂的测定(assay)，用于测量酶如纤维素和β-葡糖苷酶的活性。

jiang,y.等人‘colorimetricdetectionofglucoseinratbrainusinggoldnanoparticles’angew.chem.int.ed.2010,49,4800-4804公开了基于金纳米颗粒的测定，其基于吸光度的变化对鼠脑中的葡萄糖进行直接比色可视化。

hu,r.等人‘anefficientfluorescentsensingplatformforbiomoleculesbasedonfentonreactiontriggeredmolecularbeaconcleavage’biosens.bioelectron.2013,41,442-445公开了含有荧光团和猝灭剂的分子信标。通过葡萄糖氧化酶对葡萄糖的作用原位形成的羟基自由基使分子信标分裂，从而引起荧光团和猝灭剂的分离。

chih,t.等人‘glucosesensingbasedoneffectiveconversionofo2andh2o2intosuperoxideanionradicalwithclayminerals’j.electroanal.chem.2005,581,159-166公开了用蒙脱石k10粘土矿物从h2o2和o2产生超氧阴离子自由基，其特征在于使用安普莱克司红(amplexred)和超氧化物歧化酶作为探针的荧光测定。

本发明的一个目的是提供一种用于检测分析物的方法，从该分析物可以形成过氧化氢，其能够检测低浓度的分析物。

本发明的另一个目的是提供一种用于检测分析物的方法，从该分析物可以形成过氧化氢，其能够检测跨宽的浓度范围的分析物。

本发明的又一目的是提供一种用于检测分析物的低成本的测定，从该分析物可以形成过氧化氢。

发明概述

在第一方面，本发明提供了一种测试液体样品中是否存在分析物的方法，该方法包括以下步骤：

通过使样品与组合物接触形成混合物，该组合物包含用于从分析物形成过氧化氢的氧化酶、能够在氧自由基和铁化合物的存在下形成荧光指示剂的荧光指示剂前体，其中铁化合物溶解于该混合物中；

照射该混合物；和

测量来自荧光指示剂的荧光。

在第二方面，本发明提供了一种组合物，该组合物包含：用于从分析物形成过氧化氢的氧化酶；铁化合物；和荧光指示剂前体，该荧光指示剂前体能够在氧自由基的存在下形成荧光指示剂，其中荧光指示剂前体选自于由如下构成的组：荧光素、罗丹明、香豆素、硼-二吡咯亚甲基、萘酰亚胺、二萘嵌苯、苯并蒽酮(benzanthrones)，苯并蒽酚酮(benzoxanthrones)、和苯并噻蒽酚酮(benzothiooxanthrones)。

附图说明

现在将参考附图更详细地描述本发明，其中：

图1a示出了根据本发明实施方案的传感器，其包括处在微流体装置的相对侧上的光源和光检测器；

图1b示出了根据本发明实施方案的传感器，其包括在微流体装置相同侧上的光源和光检测器；

图2是根据本发明的示例性方法形成的具有相对低的铁浓度的混合物的传感器电流与葡萄糖浓度的关系图；

图3是根据本发明的示例性方法形成的具有相对高的铁浓度的混合物的传感器电流与葡萄糖浓度的关系图；和

图4是根据本发明的示例性方法形成的具有不同葡萄糖氧化酶浓度的混合物的传感器电流与时间的关系图。

发明详述

本文所述方法包括通过使液体样品与包含铁化合物、荧光指示剂前体和氧化酶的组合物接触来形成混合物。可以通过以任何顺序将液体样品和组合物的组分合并来形成混合物。组合物的各种组分可在与液体样品混合之前进行合并。液体样品可以与组合物的一种或多种但不是全部组分混合，然后与组合物的剩余组分混合。

与液体样品接触的本文所述组合物可以是固体形式，任选为冻干形式，或者可以是溶液或悬浮液。

在组合物与样品接触时，发生以下步骤：

(i)过氧化氢从分析物化合物的氧化酶催化的形成；

(ii)通过过氧化氢与铁化合物的反应形成氧自由基；和

(iii)通过荧光指示剂前体与氧自由基的反应形成荧光指示剂。

本文所用的“氧自由基”是指含有氧自由基原子的任何物质，例如ho·或hoo·。

过氧化氢的形成

氧化酶催化的过氧化氢形成可能需要或可能不需要分子氧(o2)的存在。该反应优选在周围空气环境中发生。

可以通过分析物的氧化酶催化反应由分析物形成过氧化氢，或者分析物可以经历一个或多个预反应以形成能够氧化酶催化产生过氧化氢的化合物。

如果分析物经历一个或多个预反应，那么用于一个或多个预反应的所述试剂或每种试剂优选存在于组合物中。以这种方式，将理解的是，可发生由一个或多个预反应和氧化酶催化的过氧化氢生成组成的级联反应。任选地，用于一个或多个预反应的一种或多种试剂包括至少一种酶。

如果通过分析物的氧化酶催化反应形成过氧化氢，则氧化酶可以是组合物中存在的唯一酶。

用于通过分析物的氧化酶催化反应产生过氧化氢的示例性分析物和相关酶包括但不限于：

在分子氧(o2)存在下的葡萄糖和葡萄糖氧化酶。

在分子氧存在下的胆固醇和胆固醇氧化酶。

在分子氧存在下的d-半乳糖和半乳糖氧化酶。

在分子氧存在下的d-氨基酸和d-氨基酸氧化酶。

在分子氧存在下的次黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶。

在分子氧存在下的l-古洛糖酸-1,4-内酯和l-古洛糖酸内酯氧化酶。

可以进行一个或多个预反应的示例性分析物是甘油三酯，由其可以产生磷酸甘油酯，用于在分子氧存在下通过磷酸甘油酯氧化酶催化反应的氧化酶催化产生过氧化氢。在这种情况下，该测定任选地包含用于由甘油三酯形成甘油的脂肪酶；以及atp和甘油激酶，用于通过甘油和atp的甘油激酶催化反应形成磷酸甘油酯。

另一种示例性分析物是淀粉，其可以通过α-淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶水解成葡萄糖，可以用葡萄糖氧化酶由其产生h2o2。

在组合物和液体样品的混合物中氧化酶的浓度范围任选为0.5-200μg/ml，任选1-100μg/ml。

氧化酶和组合物的任何其他试剂优选溶解在液体样品和组合物的混合物中。

铁化合物

在混合物中可以使用铁(ii)化合物或铁(iii)化合物，优选铁(ii)化合物。

通过氧化酶催化反应原位产生的过氧化氢可以与组合物中存在的铁(ii)化合物的铁(ii)反应形成氧自由基。

铁(ii)化合物可以是任何化合物，包括但不限于铁(ii)盐，例如硫酸铁(ii)或铁(ii)络合物，例如铁(ii)edta或铁(ii)dtpa。

铁(iii)化合物可以与邻苯二酚组合使用，例如以下文献中所公开：“degradationofrecalcitrantcompoundsbycatechol-drivenfentonreaction”，waterscience&technology49(4)：81-4，2004年2月。

可根据铁化合物的期望溶解度对其进行选择。铁化合物优选是水溶性的。优选地，该组合物的所有铁离子都溶解在由组合物和液体样品形成的混合物中。

混合物中的铁离子浓度优选为至少0.1mm，更优选至少1或至少5mm，并且任选地至多50mm。

荧光指示剂形成

通过过氧化氢和铁化合物的反应形成的氧自由基可以与测定中存在的荧光指示剂前体反应从而形成荧光指示剂。

本文所用的“荧光指示剂”是指在光照射时发荧光的材料。

可以通过如下方式测量荧光指示剂的存在：用光源激发指示剂并使用光检测器测量荧光。

可以从荧光测量确定样品中分析物的存在。如果存在分析物，则可以确定其在样品中的浓度。

与荧光指示剂相比而言，在用光源照射时荧光指示剂前体不发射或几乎不发射荧光，所述光源任选为发射可见光范围(390-700nm)或紫外光范围(大于10nm直至小于390nm，任选100-380nm)内的光的光源。

优选地，在用可见光范围内的光照射时荧光指示剂发光。

荧光指示剂前体可以选自但不限于以下化合物，各化合物可以是未取代的或取代有一个或多个取代基：荧光素及其盐、罗丹明、香豆素、硼-二吡咯亚甲基(bodipy)、萘酰亚胺、二萘嵌苯、苯并蒽酮，苯并蒽酚酮、和苯并噻蒽酚酮。

示例性的取代基是氯、烷基氨基、苯基氨基、和羟基苯基。示例性的荧光素包括但不限于：2,7-二氯荧光素、3'-(对氨基苯基)荧光素和3'-(羟基苯基)荧光素。荧光素指示剂前体可以与氧自由基反应从而产生荧光性、氧化的荧光素指示剂。

组合物和液体样品的混合物中荧光指示剂前体的浓度任选地在0.1-10mm，任选1-10mm的范围内。

荧光素可具有式(ia)或(ib)或其盐：

其中x在每次出现时独立地为h、f或cl且r为h或取代基，任选为苯基，该苯基可以是未取代的或取代有一个或多个取代基。苯基的取代基可以是羟基或氨基基团。

荧光指示剂前体优选可溶于水。荧光指示剂前体优选溶解在混合物中。

液体样品

本文所述的液体样品在环境压力(1大气压)和环境温度(20℃)下处于液态。将理解，“液体”样品可以是但不限于溶液、胶体液体或悬浮液。

本文所述的液体样品可以是：生物液体，任选为血液、尿液、唾液、泪液、粪便、胃液、胆汁、汗液、脑脊髓液或羊水液；细胞培养基或其他生物样品；或非生物样品，例如食品，环境水，例如河水、海水或雨水，葡萄酒或土壤提取物。

可以在生理ph(约7.4)下分析生物液体。任选地，在组合物与生物液体接触时对ph的影响很小或没有影响。任选地，与组合物接触时生物液体的ph的任何变化不大于0.5、0.2或0.1。

分析物检测

检测样品中的分析物的方法包括步骤：使液体样品与组合物接触，所述组合物包含铁化合物、荧光指示剂前体和氧化酶或由它们组成。优选地，该组合物不包含能够猝灭来自荧光指示剂的发光的猝灭剂。

液体样品可以与组合物的溶液或悬浮液混合，或者可以与固体形式(任选冻干形式)的组合物接触。

在分析物检测期间，铁化合物和荧光指示剂前体优选为溶解形式。如果液体样品与组合物的溶液或悬浮液混合，则铁化合物和荧光指示剂前体优选溶解在溶液或悬浮液的溶剂中。如果液体样品与固体形式的组合物接触，则铁化合物和荧光指示剂优选溶解在液体样品中。

氧化酶可以溶解在溶液或悬浮液中。

氧化酶可以固定在固体表面上(任选聚合物表面)、溶液或悬浮液中或固体组合物中。

如果分析物被一个或多个预反应转变为能够氧化酶催化产生过氧化氢的化合物，则用于一个或多个预反应的所述试剂或每种试剂可各自独立地固定在固体表面上、溶解在溶剂中或以固体形式提供在组合物中。

可以使液体样品与设置在装置中或装置上的组合物接触，以混合液体样品和组合物。组合物可以提供在微流体装置的通道或腔室中或固定在横向流动装置的表面上。

用光源照射混合物。可以使用任何光源，包括但不限于无机led或led阵列；一种或多种有机发光器件(oled)；激光；或弧光灯。光源优选为oled。

oled包括阳极、阴极以及介于阳极和阴极之间的包含有机发光材料的发光层。可以在阳极和阴极之间提供一个或多个另外的层，任选一个或多个电荷传输层、电荷注入层或电荷阻挡层。在阳极和阴极之间施加偏压时，从有机发光材料发射光。oled可以如organiclight-emittingmaterialsanddevices，editorszhigangliandhongmeng，crcpress，2007中所述，通过引用将其内容并入本文。

荧光指示剂优选在390-700nm的可见光范围内的光照射时发光，并且可以相应地选择从光源发射的光的波长范围。

从荧光指示剂发射的光优选在可见光范围内或在红外范围内(大于700nm，任选地至少750nm，至多约1000nm)，优选在可见光范围内。

可以通过以下装置检测从荧光指示剂发射的光：光检测器、任选地有机光检测器(opd)、电荷耦合器件(ccd)或光电倍增器，优选opd或ccd。

opd包括阳极、阴极以及介于阳极和阴极之间的有机半导体区域。该有机半导体区域可以包含相邻的电子给予层和电子接受层，或者可以包括含电子接受材料和电子给予材料的混合物的单一层。可以在阳极和阴极之间提供一个或多个另外的层。可以在零偏压(光伏)模式或反向偏压模式中检测入射光到电流的转换。opd可如以下文献所述：ruthshinar&josephshinar“organicelectronicsinsensorsandbiotechnology”mcgraw-hill2009，通过引用将其内容并入本文。

未按任何比例绘制的图1a示出了适用于本文所述方法的传感器，其包括光源、光检测器和微流体装置。

在使用中，在微流体装置的通道或腔室101中使液体样品与本文所述的组合物接触，并用来自光源103的波长为hν1的光照射。如果已形成荧光指示剂，则来自光源的光被荧光指示剂吸收并作为更长波长hν2的光重新发射，其可由具有光入射于其上的表面105s的光检测器105检测。

在图1a的实施方案中，光源103被提供在微流体装置的第一表面上，光检测器105被提供在相对的第二表面上。

可以在光源和光检测器之间提供滤光器(未示出)，以消除荧光指示剂发射的波长范围以外的一些或所有波长的光。

可以在光源和混合物之间提供滤光器(未示出)，以消除荧光指示剂吸收的波长范围以外的一些或所有波长的光。

未按任何比例绘制的图1b示出了另一种传感器的其它布置，其中光源103和光检测器105被提供在微流体装置的第一表面上。在该实施方案中，可以通过如下方式防止从光源发射的光到达光检测器105：使用在与第一表面相对的微流体装置的第二表面上或上方的高度吸收(黑色)层和/或使用在光检测器的光入射的表面上或上方的滤光器。

光源103和光检测器105被提供在共用基底107上，例如玻璃或塑料基底，提供在微流体装置的第一表面附近。在另一实施方案中，微流体装置的第一表面可以形成共用基底，在该共用基底上形成光源和光检测器。在又一个实施方案中，光源103和光检测器105可以被提供在第一表面上的分离基底上。

在光源是oled并且光检测器是opd的情形中，oled和光检测器可以形成在共用基底上，然后使其与微流体装置的第一表面相邻以形成传感器。可以使用基底上的共用透明阳极层(任选共用氧化铟锡层)来形成该实施方案的opd和oled。

将理解，光源和光检测器可以按广泛的布置提供，以感测来自荧光指示剂的荧光发射，并且可以与如下一起使用(但不限于此)：滤光器、光吸收层、光反射层、透镜、光纤及其组合。

传感器可以具有模块化结构，其中微流体装置可与光源和/或光检测器分离。任选地，传感器的微流体装置包括单次使用的玻璃或透明塑料微流体芯片，其可以被移除并用另一芯片替换。

任选地，微流体装置不是模块化的，整个传感器是单次使用的传感器。

组合物的该组分或各种组分可以从溶液或悬浮液引入微流体装置中，所述溶液或悬浮液包含溶解或悬浮于其中的一种或多种、任选所有的组合物组分，然后使溶液或悬浮液冻干。

通过将组合物的组分从一种或多种溶液或悬浮液施加到装置的表面上，然后蒸发所述溶液或悬浮液的所述一种或多种溶剂，可将固体组合物吸收到横向流动装置之上或之中。

该传感器可以是便携式装置。该传感器可以是手持装置。

图1a和1b示出了包含微流体装置的传感器，其中使样品与组合物接触，但是将理解的是，可以使用其它设备用于将液体样品与组合物混合，例如具有表面的横向流动装置，组合物以固体形式固定于该表面上。

图1a和1b示出了具有仅一个光源和仅一个光检测器的传感器。对于每个检测器可以存在多于一个光源。

传感器可以是多通道微流体装置，其中至少一个通道配置成检测本文所述的分析物，所述一个或多个另外的通道各自配置成通过本文所述的方法或通过技术人员已知的其它方法检测不同的分析物。

本文描述的传感器可以使得能够检测低浓度的分析物和/或跨越宽的分析物浓度范围的分析物。用于分析的样品中的分析物浓度可以在约1pm-300mm的范围内，任选0.1-100mm，任选0.2-10mm。

应用

本文所述的组合物可用于检测分析物的测定中，包括但不限于葡萄糖、胆固醇、甘油三酯，并且本文所述的传感器可用作护理点传感器用于所述分析物的定量测量。

实施例

所有试剂均购自sigmaaldrich。

实施例1：2,7-二氯荧光素检测试剂的形成

以1mg/ml(2mm)的浓度将2,7-二氯荧光素二乙酸酯溶解在dmso中。向50μl该溶液中加入甲醇(50μl)和2m氢氧化钾水溶液(50μl)，并将混合物在室温下静置1小时(检测试剂的最终浓度为0.67mm)。

实施例2：葡萄糖测定—较低的铁(ii)浓度

制备含以下的溶液：15μl检测试剂溶液(如实施例1中制备)，100μl的edta水溶液(2.5mm)，100μl硫酸铁(ii)水溶液(2.5mm)和685μl的d-(+)-葡萄糖(0.1、0.3、1、3或10mm)在磷酸钠缓冲液(0.1m，ph7.4)中的溶液。向这些溶液中的每一种添加100μl葡萄糖氧化酶的水溶液(20mg/ml)，并将样品管快速倒置以混合。1小时后，使用～130μl溶液完全填充微流体流动池(20×9mm面积，光程长度为0.5mm)。

将该流动池置于oled/opd检测器中，如图1a所示，在oled和微流体流动池之间具有短通滤光器(shortpassfilter)，在微流体流动池和opd之间具有长通滤光器(longpassfilter)。

oled被支承在玻璃基底上，并且包括透明阳极、空穴注入层、聚合物空穴传输层、包含荧光蓝色发光聚合物的发光层和阴极。oled的峰值发射波长为480nm。

opd支承在玻璃基底上，并且包含透明阳极、空穴传输层、下示的供体聚合物与c70富勒烯受体材料的混合物层和阴极。

使用20ma的驱动电流、0v的opd偏压和100ms的脉冲时间测量来自荧光指示剂的荧光。使用印制的短通滤光器和长通滤光器来锐化oled光谱并防止激发光到达opd。

参考图2，传感器电流(对应于来自荧光指示剂的荧光的强度)与葡萄糖浓度之间存在线性关系。

实施例3：葡萄糖测定—较高的铁(ii)浓度

制备含以下的溶液：15μl的检测试剂溶液(如实施例1中制备)，50μl硫酸铁(ii)水溶液(100mm)，50μl的edta水溶液，785μl的d-(+)-葡萄糖(0、0.06、0.6或6μm)在磷酸盐缓冲盐水(ph7.4)中的溶液。向这些溶液中的每一种添加100μl葡萄糖氧化酶的水溶液(20mg/ml)，并将样品管快速倒置以混合。在室温下5分钟后，使用～130μl溶液完全填充微流体流动池(20×9mm面积，光程长度为0.5mm)，并如实施例2中所述测量荧光强度。

参考图3，在葡萄糖浓度和传感器电流之间观察到基本上线性的关系。

实施例4

如实施例3制备三种溶液。向这些溶液中的每一种添加葡萄糖氧化酶在水中的溶液，从而得到0.02、0.2或2mg/ml的最终酶浓度，以及1ml的最终体积。在混合后，将～130μl溶液立即转移到微流体流动池(20×9mm区域，光程长度为0.5mm)，并使用oled/opd平台和实施例2中所述的测量参数在20分钟时间进程内每15秒测量荧光强度。

参考图4，给定时间点的传感器电流和传感器电流增加速率均与葡萄糖氧化酶的浓度成比例。

虽然关于具体的示例性实施方案描述了本发明，然而应领会在不偏离以下权利要求所述的本发明范围的情况下，本文所公开特征的各种修改、改变和/或组合对本领域技术人员而言将是明显的。