用于治疗疾病的穹窿体RNA的调节剂的制作方法

发明背景

巨自噬(自噬)是一种用于靶向细胞组分(包括蛋白质、蛋白质聚集体和细胞器)以便在溶酶体中降解的重要机制。这种分解代谢的细胞自消化过程是响应于饥饿或应激而诱导的，导致形成称为自噬体的双膜囊泡，其吞噬蛋白质和细胞器。自噬体然后与溶酶体融合，其中自噬体及其货物被降解。这种溶酶体-介导的细胞自消化用于回收细胞内营养物质以在饥饿期间维持细胞代谢并消除在应激期间积累的受损蛋白质和细胞器。尽管通过泛素介导的蛋白酶体降解途径消除了单个蛋白质，但自噬途径可以消除蛋白质聚集体和细胞器。因此，自噬与蛋白酶体功能互补并重叠，以防止在饥饿和应激期间受损细胞组分的积累。通过这些功能，自噬是一种重要的细胞应激响应，可维持蛋白质和细胞器质量控制，保护基因组免受损害并维持细胞和哺乳动物的活力。

自噬的核心分子机制由从酵母到哺乳动物进化保守的一组atg基因编码的蛋白质产物控制。自噬囊泡的成核需要ptdins3p，即iii型pi3激酶复合物的产物，包括苄氯素1(酵母atg6的哺乳动物同源物)和vps34，以及两种泛素样分子，atgl2和lc3(atg8的同源物)，其在介导自噬体的形成中依序起作用。在第一泛素化样反应中，atgl2缀合至atg5并形成大的多聚体蛋白质复合物，其在决定自噬体的成核中起关键作用。在第二反应中，lc3缀合至磷脂酰乙醇胺，导致对于自噬体的延伸和闭合重要的膜易位。

自噬功能障碍是疾病的主要原因，包括但不限于神经退行性变、肝病和癌症。许多人类神经退行性疾病与异常突变和/或多聚泛素化蛋白质积累和过度的神经元细胞死亡有关。具有靶向自噬缺陷的小鼠的神经元积累多聚泛素化的和含p62的蛋白质聚集体，其导致神经退行性变。人肝病脂肪性肝炎和肝细胞癌(hcc)的主要子集与含p62的蛋白质聚集体(马洛里小体(mallorybodies))的形成有关(zatloukal,k.,等人(2002),p62isacommoncomponentofcytoplasmicinclusionsinproteinaggregationdiseases,am.j.pathol.160,255-263)。具有自噬缺陷的小鼠的肝脏具有含p62的蛋白质聚集体、过度的细胞死亡和hcc。

自噬已被提出在癌症的发展和治疗中发挥复杂的作用。自噬的激活通过预防坏死细胞死亡和随后有利于肿瘤生长的炎症而起到肿瘤抑制机制的作用。另一方面，自噬的抑制可通过未知机制导致基因组不稳定，这可解释多系癌症中苄氯素1杂合性的频率增加和恶性上皮卵巢癌中自噬相关蛋白的表达降低。因此，长期抑制自噬可以刺激肿瘤发生。

自噬在细胞垃圾处理中的重要性是显而易见的，因为自噬是大细胞结构诸如细胞器和蛋白质聚集体周转的唯一确定的机制。细胞器如何被识别并送往自噬体进行降解可能涉及细胞器特异性过程，诸如线粒体自噬和er-自噬，其可以减轻由功能障碍的细胞器发出的氧化应激。在应激过程中积累的受损蛋白质可被蛋白酶体途径重折叠、泛素化和降解，或被自噬聚集和降解。为了将受损或未折叠的蛋白质引导至自噬途径，p62结合多聚泛蛋白化的蛋白质从而通过寡聚化/聚合形成蛋白质聚集体，并结合自噬体膜上的atg8/lc3以将聚集体靶向至自噬体进行降解。蛋白质聚集可以是通过隔离限制细胞暴露于有毒蛋白质的保护机制，以及收集并指导受损蛋白质到自噬体的有效包装和递送机制。小鼠中的肝脏特异性自噬缺陷导致p62聚集体积累、氧化应激升高和肝细胞死亡。因此，不受任何理论或操作理论的束缚，认为不能通过自噬处置p62聚集体可能对正常组织有毒。

穹窿体是20世纪80年代中期鉴定的最大的核糖核苷酸-蛋白质复合物(kedersha和rome，1986)。穹窿体存在于广泛的真核生物中，但是不存在于例如果蝇、蛔虫或酵母中(stadler等人，2009)。虽然穹窿体与各种细胞过程有关，如抗药性、细胞凋亡或核转运(berger等人，2009)，但它们的确切功能仍然模糊不清。桶形穹窿体包含三种蛋白质-主要穹窿体蛋白(mvp)，其赋予主要穹窿体结构；端粒酶相关蛋白1(tep1)，一种被认为位于穹窿体的帽处的rna结合蛋白；和聚-a-核糖聚合酶4(parp4)，位于颗粒内部。此外，穹窿体含有小的非编码穹窿体rna(vtrna)，预测它位于由tep1结合的复合物的帽处(kong等人，2000)。人类有4种vtrna旁系同源物(vtrna1-1、vtrna1-2、vtrna1-3、vtrna2-1)，长度为88-100nt，由rnapoliii转录并在5q染色体上编码。沉淀实验表明，只有少数总vtrna汇集物被掺入穹窿体(nandy等人，2009)。vtrna1-1的过表达在ebv感染的细胞模型中显示出对细胞凋亡的保护作用(amort等人，2015)，并且经由pkr失活有利于流感病毒复制(li等人，2015)。然而，穹窿体内部或外部的穹窿体rna的确切功能在很大程度上仍未确定。

然而，仍然没有足够的治疗方法将靶向自噬作为许多人类病症的主要贡献者。因此，本发明的目的是提供用于细胞中自噬的靶向调节以允许治疗神经退行性疾病和癌症疾病的新方法。

如本文所用，术语“穹窿体”或“穹窿体颗粒”是指在真核细胞中存在大的细胞质核糖核蛋白(rnp)颗粒。穹窿体或穹窿体颗粒由mvp、vparp和/或tep1蛋白质和一种或多种未翻译的vtrna分子组成。人穹窿体包含vtrna1-1、vtrna1-2、vtrna1-3和vtrna2-1。

术语“穹窿体rna”和“vtrna”是指发现穹窿体内相缔合或包含的非蛋白质编码rna分子。

术语“自噬”是指参与细胞自身成分降解的分解代谢过程；诸如，长寿蛋白质、蛋白质聚集体、细胞的细胞器、细胞膜、细胞器膜和其他细胞组分。自噬的机制可包括：(i)在细胞的靶向区域周围形成膜，将内含物与细胞质的其余部分分开，(ii)所得囊泡与溶酶体的融合和随后囊泡内含物的降解。例如，术语自噬可以指饥饿细胞将营养物从不必要的过程重新分配到更重要的过程的机制之一。此外，例如，自噬可以抑制某些疾病的进展并对细胞内病原体的感染起到保护作用。

术语“自噬相关疾病”包括可以通过诱导或减少自噬来治疗的疾病。此类疾病的实例包括由错误折叠的蛋白质聚集体引起的疾病。术语“由错误折叠的蛋白质聚集体引起的疾病”旨在包括与错误折叠的蛋白质聚集体相关或由其引起的任何疾病、病症或病况。例如，这些疾病包括阿尔茨海默氏病(alzheimer'sdisease)、帕金森氏病(parkinson'sdisease)、肌萎缩侧索硬化症、亨廷顿氏病(huntington'sdisease)、脊髓小脑性共济失调、眼咽肌营养不良症、朊病毒疾病、致命性家族性失眠、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、齿状核红核苍白球路易体萎缩、额颞叶痴呆、进行性核上性麻痹、x-连锁脊髓延髓性肌萎缩和神经元核内透明包涵体疾病。术语“自噬相关疾病”还包括癌症，如任何癌症，其中自噬的诱导会抑制细胞生长和分裂、减少诱变、去除被活性氧物质损坏的线粒体和其他细胞器或杀死发展中的肿瘤细胞。自噬相关疾病可以是慢性疾病。

如本文所用，术语“自噬通量”是指自噬周转，即自噬体(ap)的形成和清除的速率。

在第一方面，通过用于调节细胞中自噬的方法解决了上述问题，该方法包括抑制或增加细胞中的穹窿体rna(vtrna)和p62的相互作用，或者穹窿体和p62之间的相互作用的步骤。

根据本发明的vtrna优选选自包括以下的组：vtrna1-1和vtrna1-2，vtrna1-3和vtrna2-1；优选vtrna1-1，和vtrna1-2，和vtrna2-1，并且最优选vtrna是vtrna1-1。应当理解，根据生物体，技术人员可以选择在相应物种中存在的其他vtrna同源物。seqidno：3至6显示人序列，但特别地，出于筛选的目的，小鼠或大鼠或其他哺乳动物vtrna也可以是本发明的主题。

本发明令人惊讶地发现了自噬所涉及的蛋白质p62作为rna结合蛋白的功能。到目前为止还不知道p62与rna结合，并且特别地新发展是来自穹窿体的rna结合p62并调节其功能。p62也称为sqstm1(死骨片1)。

p62与穹窿体或与vtrna之间的相互作用是vtrna(照此或在穹窿体复合物的背景下)与p62蛋白的结合。如果预期，穹窿体或vtrna与p62的结合可以通过如本文实施例部分中公开的方法确定。

在本发明的进一步另外或可替代的优选实施方案中，自噬的调节是细胞中自噬通量的调节。自噬通量优选通过监测细胞中lc3b的缀合和/或p62斑点的形成的调节来确定。微管相关蛋白1a/1b-轻链3(lc3)是分子量约为17kda的可溶性蛋白质，其普遍存在于哺乳动物组织和培养细胞中。在自噬期间，自噬体吞噬细胞质组分，包括细胞溶质蛋白和细胞器。同时，细胞溶质形式的lc3(lc3-i)缀合至磷脂酰乙醇胺形成lc3-磷脂酰乙醇胺缀合物(lc3-ii)，其被募集到自噬体膜中。此外，在自噬期间，p62的自身寡聚化促进蛋白质聚集体形成，其被观察为斑点并因此可用作自噬通量的标志物。

在本发明中，存在这样的实施方案，其中优选增加细胞中的自噬通量。增加自噬通量优选通过抑制细胞中的穹窿体rna(vtrna)和p62的相互作用来实现。

然而，在本发明的其他优选实施方案中，优选降低细胞中的自噬通量。通过增加细胞中的穹窿体rna(vtrna)和p62的相互作用来实现本发明上下文中自噬通量的减少。

在本发明的一些优选实施方案中，通过使所述细胞与vtrna的表达、功能或稳定性的拮抗剂或激动剂接触来实现抑制或增强细胞中vtrna和p62的相互作用。还包括通过使所述细胞与分别能够(竞争性地)干扰或增强vtrna和p62之间的结合的物质接触来实现抑制或增加细胞中vtrna和p62之间的相互作用。这种结合的干扰物优选是与位于p62(人p62；其他哺乳动物中的相应序列位置可以源自序列比对)中的氨基酸位置r139和/或k141紧邻或附近的p62区域结合的物质。该区域的长度优选为100个氨基酸，更优选为约50、30、20、15或5-10个氨基酸，并且包含(人)p62的r139和/或k141(在其他同源物中各自相应的位置)。

将增加vtrna或穹窿体和p62的相互作用的物质在本公开的上下文中优选地称为vtrna或穹窿体和p62的相互作用的增强剂。本发明的增强剂是能够诱导穹窿体或vtrna与p62的结合增加的任何物质。根据本发明的发现即抑制vtrna和p62之间的相互作用导致自噬通量增加，优选地此类化合物具有作为自噬拮抗剂的作用。

这种增强物质可选自寡核苷酸、经修饰的寡核苷酸、抗体、小分子、核酶、肽或重组蛋白。vtrna和p62的相互作用的增强剂的优选实例是vtrna模拟寡核苷酸，或vtrna表达构建体，其在细胞中允许vtrna水平的增加并因此vtrna与p62的结合增加。vtrna和p62的相互作用的增强剂优选地可以包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包含vtrna序列或者与vtrna或vtrna的cdna序列具有至少50％、更优选60％、70％、80％、90％、95％、最优选98或99％序列同一性的经修饰的vtrna序列(对于人vtrna，参见seqidno:3-6)。在本发明的上下文中，vtrna或vtrna模拟物表达构建体包含这样的序列，其为vtrna序列或vtrna模拟物的cdna序列或者vtrna的基因序列，而vtrna分子或vtrna模拟物分子包含这些结构相应的rna序列。vtrna，相应的vtrna基因的序列是本领域熟知的。

表达构建体可以包含编码相应vtrna并且优选与用于表达vtrna序列的启动子可操作地连接的vtrnadna序列。此类表达构建体是熟知的，并且可以是适于在细胞中表达外源dna的任何载体、质粒或其他基于核酸的构建体。

在其他实施方案中，本发明提供或涉及用于抑制vtrna或穹窿体与p62相互作用的物质。此类物质在下文中称为vtrna或穹窿体和p62相互作用的抑制剂。本发明的抑制剂是能够诱导穹窿体或vtrna与p62蛋白结合减少的任何物质。根据本发明的发现即抑制vtrna和p62之间的相互作用导致细胞中自噬通量增加，优选地此类化合物具有作为自噬激动剂的作用。

优选地，vtrna或穹窿体和p62的相互作用的此类抑制剂是vtrna的拮抗剂。优选的拮抗剂是靶向vtrna序列的反义核酸或反义分子。因此，根据本发明的术语“反义分子”涉及核酸分子，优选rna、dna、rna/dna或lna分子，其具有与给定vtrna即“有义”序列互补的碱基序列。在一些实施方案中，反义分子是sirna、lna、shrna或另一种反义rna干扰寡核苷酸。

本发明的反义分子的特别优选的实例是内切核糖核酸酶制备的sirna(esirna)。esirna是由用内切核糖核酸酶诸如大肠杆菌(escherichiacoli)rna酶iii或dicer切割长双链rna(dsrna)而产生的sirna寡核苷酸的混合物。esirna是使用化学合成的sirna用于rna干扰(rnai)的另一种概念。esirna是体外酶促消化长双链rna。为了生成esirna，vtrna模板的cdna可以通过pcr扩增并用两个细菌噬菌体-启动子序列标记。然后使用rna聚合酶生成与靶基因cdna互补的长双链rna。随后可以用来自大肠杆菌的rna酶iii消化该互补rna，以生成长度为18-25个碱基对的sirna的短重叠片段。这种短双链rna的复杂混合物类似于体内dicer切割生成的混合物，并因此称为内切核糖核酸酶-制备的sirna或短esirna。因此，esirna是全部靶向相同的mrna序列的sirna的异质混合物。esirna导致高度特异性和有效的基因沉默。

为了靶向vtrna，根据本发明的反义分子的序列同一性为vtrna序列的至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％和100％(优先性递增)。用于确定序列同一性的手段和方法是本领域已知的。优选地，blast(基本局部比对搜索工具)程序用于确定关于本领域已知的一种或多种vtrna的序列同一性。另一方面，优选的反义分子诸如本发明的sirna和shrna优选使用适当保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规rna合成仪化学合成。rna合成试剂的供应商包括proligo(hamburg,germany)、dharmaconresearch(lafayette,co,usa)、piercechemical(perbioscience的一部分,rockford,il,usa)、glenresearch(sterling,va,usa)、chemgenes(ashland,ma,usa)和cruachem(glasgow,uk)。

反义分子sirna和shrna在体内有效但可逆地沉默vtrna和基因的能力使得这些分子特别适用于也将在下文中描述的本发明的药物组合物中。向人施用sirna的方法描述于fougerolles等人，currentopinioninpharmacology,2008,8:280-285中。此类方法也适用于施用其他小rna分子如shrna。因此，此类药物组合物可以通过直接配制成盐水、经由基于脂质体和基于聚合物的纳米颗粒方法、作为缀合或复合的药物组合物、或经由病毒递送系统来施用。直接施用包括注射到组织中、鼻内施用和气管内施用。基于脂质体和基于聚合物的纳米颗粒方法包括阳离子脂质genzyme脂质(gl)67、阳离子脂质体、壳聚糖纳米颗粒和阳离子细胞穿透肽(cpp)。缀合或复合的药物组合物包括pei复合的反义分子、sirna、shrna或mirna。此外，病毒递送系统包括流感病毒包膜和病毒体。

反义分子sirna、shrna可以包含经修饰的核苷酸，诸如锁核酸(lna)。lna核苷酸的核糖部分用连接2'氧和4'碳的额外桥修饰。该桥将核糖“锁定”在3'-内(北)构象中，这通常在a型双链体中发现。只要需要，lna核苷酸可以与寡核苷酸中的dna或rna残基混合。此类寡聚物是化学合成的并且可商购获得。锁定的核糖构象增强了碱基堆叠和骨架预组织。这显著增加了寡核苷酸的杂交性质(解链温度)。sirna的特别优选的实例是gapmer(lna^tmgapmer(exiqon))。gapmer是用于高效抑制mrna和vtrna功能的有效反义寡核苷酸。gapmer含有侧接有lna区块的dna单体的中心区段。gapmer的长度优选为14-16个核苷酸，并且任选地完全硫代磷酸酯化。dna空位激活rna酶h介导的靶向rna的降解，并且也适合直接靶向细胞核中的转录物。

用作vtrna拮抗剂的优选反义分子是具有与seqidno:3至6中所示的任何vtrna序列互补的序列的反义构建体。最优选的是包含根据seqidno:1或2的序列或基本上由根据seqidno:1或2的序列组成的反义分子(实施例中使用的lna构建体)。

根据本发明各个方面的不同优选实施方案，本发明的vtrna或穹窿体和p62相互作用的抑制剂也可以是适配体、核酶、抗体、蛋白质药物或小分子抑制剂。

该实施方案的适配体、核酶、抗体、蛋白质药物或小分子抑制剂特异性结合一个或多个vtrna或穹窿体，从而抑制vtrna或穹窿体与p62的结合。根据本发明的术语“适配体”是指处于天然d构象或l构象的dna或rna分子(“镜像适配体(spiegelmer)”)，基于它们结合其他分子的能力从随机汇集物中对其进行选择。已经选择了结合核酸、蛋白质、小有机化合物和甚至整个生物体的适配体。适配体数据库保存在http://aptamer.icmb.utexas.edu/。更具体地，适配体可以分类为dna或rna适配体或者肽适配体。然而前者由寡核苷酸链(通常是短的)组成，后者由两端附接至蛋白质骨架的短可变肽结构域组成。核酸适配体是这样的核酸物质，其通过反复数轮的体外选择或等效地selex(指数富集的配体系统演化)已被工程化以结合各种分子靶标诸如小分子、蛋白质、核酸以及甚至细胞、组织和生物体。本发明设想的分子靶标是核酸，即vtrna(诸如seqidno3至6)。因此，可以针对本发明的靶分子产生适配体。肽适配体是经设计用于干扰细胞内其他蛋白质相互作用的肽。它们由两端附接至蛋白质骨架的可变肽环组成。这种双结构约束将肽适配体的结合亲和力极大地增加至与抗体相当的水平(纳摩尔范围)。可变环长度通常包含10至20个氨基酸，并且骨架可以是具有良好溶解性质的任何蛋白质。目前，细菌蛋白硫氧还蛋白-a是最常用的骨架蛋白，可变环被插入还原活性位点，其是野生蛋白中的-cys-gly-pro-cys-环，两个半胱氨酸侧链能够形成二硫桥。肽适配体选择可以使用不同的系统进行，但目前最常用的是酵母双杂交系统。最优选的是这样的肽适配体，其在vtrna结合的上述指定结合区结合p62。

适配体为生物技术应用和治疗应用提供了实用性，因为它们提供的分子识别性质可与常用的生物分子，特别是抗体的分子识别性质相媲美。除了它们的区别识别之外，适配体还提供优于抗体的优点，因为它们可以在试管中完全工程化、易于通过化学合成产生、具有所需的储存性质并且在治疗应用中引起很少的免疫原性或不引起免疫原性。未经修饰的适配体从血流中快速清除，半衰期为数分钟至数小时，这主要是由于核酸酶的降解和通过肾脏从身体中的清除，这是适配体固有的低分子量的结果。适配体的快速清除在诸如体内诊断成像的应用中可能是有利的。科学家可以获得几种修饰，诸如2'-氟-取代的嘧啶、聚乙二醇(peg)连接等，使用所述修饰可以将适配体的半衰期容易地增加到一天或甚至一周的时标。

术语“核酶”是指在没有蛋白质的情况下充当酶的rna分子。这些rna分子起催化作用或自催化作用，并且能够在特定靶位点处切割如其他rna，但也发现它们催化核糖体的氨基转移酶活性。可以如例如zaher和unrau(2007),rna13(7):1017-1026中所述进行适当的靶位点和相应的核酶的选择。

充分表征的小自切割rna的实例是锤头状核酶、发夹状核酶、丁型肝炎病毒核酶和体外选择的前导依赖性核酶。这些小催化剂的组织与较大的核酶诸如第i组内含子的组织相反。

在过去的十年中，催化自切割的原理已经得到很好的证实。锤头状核酶在具有核酶活性的rna分子中是最佳表征的。由于显示锤头状结构可以整合到异源rna序列中并且核酶活性因此可以转移到这些分子，所以似乎可以产生几乎任何靶序列的催化序列，条件是靶序列含有潜在匹配的切割位点。

构建锤头状核酶的基本原理如下：选择含有guc(或cuc)三联体的rna的感兴趣区域。取两条寡核苷酸链，每条链具有6至8个核苷酸，并将催化锤头序列插入它们之间。合成这种类型的分子用于许多靶序列。它们在体外显示出催化活性，并且在某些情况下也在体内显示出催化活性。通常用短核酶和靶序列获得最佳结果。因为靶序列是短rna序列，即vtrna。适配体和核酸也可以包含经修饰的核苷酸，诸如锁核酸(lna)。

根据本发明使用的术语“抗体”包括，例如多克隆抗体或单克隆抗体。此外，仍然保留结合特异性的抗体的衍生物或片段也包括在术语“抗体”中。抗体片段或衍生物尤其包括fab或fab'片段、fd、f(ab')2、fv或scfv片段、单结构域vh或v样结构域，诸如vhh或v-nar结构域，以及多聚体形式诸如微抗体、双抗体、三抗体、四抗体或化学缀合的fab'-多聚体(参见，例如，altshuler等人，2010.，holliger和hudson，2005)。术语“抗体”还包括诸如嵌合(人恒定结构域，非人可变结构域)抗体、单链和人源化(除非人cdr之外的人抗体)抗体的实施方案。根据本发明，本发明的此类抗体优选结合p62或穹窿体或vtrna并抑制穹窿体或vtrna和p62的相互作用。

在某些优选的实施方案中，本发明第一方面的方法可以是用于增强细胞中自噬的方法。此类方法可用于治疗对象的与细胞中自噬通量减少或不足相关的疾病。在下文中将描述本发明的各个方面和实施方案的医学用途的更多内容。

根据本发明的细胞是生物细胞，优选哺乳动物细胞，诸如小鼠、大鼠或人细胞。根据本发明的相应应用，细胞类型可选自神经元细胞、肝细胞、肿瘤细胞或免疫细胞。

上文所述的方法可以优选地选自离体或体外方法，或者可选地-特别是在医学领域-体内实践的方法。

在第二方面，还提供了用于筛选自噬的调节剂的方法，该方法包括使细胞与候选化合物接触、监测vtrna和p62的相互作用，其中vtrna和p62之间的相互作用增加表明候选化合物是细胞中自噬通量的抑制剂，而vtrna和p62之间的相互作用减少表明候选化合物是细胞中自噬通量的增强剂。同样，结合是两种分子vtrna/穹窿体和p62之间的优选相互作用。

候选化合物可以是任何化合物，并且特别选自上文所述的化合物作为vtrna或穹窿体与p62相互作用的抑制剂或增强剂。以上针对本发明的第一方面提供的相应描述应同样适用于第二方面。

在第三方面，提供了vtrna或穹窿体与p62相互作用的调节剂的医学应用。此类医学应用优选使用用于医药中的化合物或用于治疗对象的方法，所述方法包括向对象施用本发明上下文所述的调节剂的步骤。因此，提供了通过增加/增强细胞自噬来治疗对象的疾病的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的穹窿体rna(vtrna)和p62相互作用的抑制剂。

在一些实施方案中，在本发明的上下文中待治疗的疾病具有受益于受疾病影响的细胞中的自噬增加的病理，例如是与细胞组分的病理性积累相关的疾病。在优选的实施方案中，通过使用vtrna或穹窿体与p62的相互作用的上述抑制剂之一来影响该增加。此类抑制剂将促进自噬，并且本文使用的“促进自噬”意指与不存在治疗时的自噬速率相比增加细胞或生物体或患者内的自噬速率。如本文所用，“自噬相关病症”选自癌症、中风、肌肉减少症、感染、免疫系统缺陷、肝病、神经退行性疾病和心脏病症，并将在下面进一步详细公开。

由于本发明提供了调节细胞或生物体中自噬的新策略，因此受益于自噬增加的任何病症是本文公开的治疗的主题。自噬与从癌症到神经退行性病症的各种病症的关联在本领域中是熟知的。自噬和神经退行性变之间的联系例如在参考文献“autophagyandneurodegeneration”，rebeccaa.frake,thomasricketts,fionam.menzies和davidc.rubinsztein,thejournalofclinicalinvestigation；第125卷,第1期,2015年1月中详细解释，将其通过引用整体并入。因此，在本领域中自噬的调节和神经退行性疾病的治疗之间存在既定的联系。

待用根据本发明的抑制剂治疗的优选对象是已被诊断患有神经退行性疾病或肝病的对象，或者已经治疗神经退行性疾病的对象，包括先前治疗难以治疗的对象。

本发明的方法可用于治疗任何神经退行性疾病。在某些实施方案中，神经退行性疾病是蛋白病或蛋白质折叠疾病。此类蛋白病的实例包括但不限于阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、路易体痴呆、als、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调和脊髓延髓性肌萎缩。在其他实施方案中，本发明的方法可用于治疗任何神经退行性疾病。可通过本发明的方法治疗的神经退行性疾病包括但不限于肾上腺脑白质营养不良、酒精中毒、亚历山大氏病(alexander'sdisease)、阿尔珀氏病(alper'sdisease)、阿尔茨海默氏病、肌萎缩侧索硬化症、共济失调性毛细血管扩张、巴登病(battendisease)、牛海绵状脑病、卡纳万病(canavandisease)、脑麻痹、科克因综合征(cockaynesyndrome)、皮质基底节变性、克罗伊茨费尔特-雅各布病(creutzfeldt-jakobdisease)、家族性致命性失眠、额颞叶变性、亨廷顿氏病、hiv相关性痴呆、肯尼迪氏病(kennedy'sdisease)、克拉伯氏病(krabbe'sdisease)、路易体痴呆、神经疏螺旋体病(neuroborreliosis)、马查多-约瑟夫病(machado-josephdisease)、多系统萎缩、多发性硬化症、发作性睡病、尼曼皮克病(niemannpickdisease)、帕金森氏病、佩利措伊斯-梅茨巴赫病(pelizaeus-merzbacherdisease)、皮克氏病(pick'sdisease)、原发性侧索硬化症、朊病毒疾病、进行性核上性麻痹、雷夫叙姆氏病(refsum'sdisease)、桑德霍夫病(sandhoffdisease)、希尔德氏病(schilder'sdisease)、继发于恶性贫血的脊髓亚急性联合变性(subacutecombineddegenerationofspinalcordsecondarytoperniciousanaemia)、斯皮尔梅伊尔-沃格特-肖格伦-巴登病(spielmeyer-vogt-sjogren-battendisease)、脊髓小脑性共济失调、脊髓性肌萎缩、斯蒂尔-理查森-奥尔谢夫斯基病(steele-richardson-olszewskidisease)、脊髓痨和中毒性脑病。

有需要的对象还可以包括，例如，已经被诊断患有肝病的对象或已经接受过肝病治疗的对象，包括先前治疗难以治疗的对象。在某些实施方案中，肝病是蛋白病或蛋白质折叠疾病。这种蛋白病的实例是α1-抗胰蛋白酶缺乏症。可以通过根据本发明的细胞中自噬通量增加来治疗的另一种肝病是脂肪性肝炎，诸如非酒精性脂肪性肝炎(nash)，特别是为了预防肝硬化和肝癌(hcc)的发展，所述肝硬化和肝癌是已知的nash的进一步阶段。

有需要的对象还可包括，例如，已被诊断患有肌肉疾病的对象或已经接受过肌肉疾病治疗的对象，包括先前治疗难以治疗的对象。在某些实施方案中，肌肉疾病是蛋白病或蛋白质折叠疾病。此类蛋白病的实例包括但不限于缺陷散发性包涵体肌炎、肢带型肌营养不良2b型和三好氏肌肉病变(miyoshimyopathy)。

有需要的对象还可包括，例如，已被诊断患有蛋白病的对象，包括先前治疗难以治疗的对象。蛋白病的实例包括但不限于阿尔茨海默氏病、脑β-淀粉样血管病、视网膜神经节细胞变性、朊病毒疾病(如牛海绵状脑病、库鲁病、克罗伊茨费尔特-雅各布病、变异型克罗伊茨费尔特-雅各布病、格斯特曼-斯召斯列-史茵克综合征(gerstmann-straussler-scheinkersyndrome)、致命性家族性失眠)、tau病变(如额颞叶痴呆、阿尔茨海默氏病、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、额颞叶变性)、额颞叶变性、肌萎缩侧索硬化症、亨廷顿氏病、家族性英国痴呆、家族性丹麦痴呆、遗传性脑出血伴有淀粉样变性(iclandic)、cadasil、亚历山大病、seipin蛋白病(seipinopathies)、家族性淀粉样变性神经病、老年性系统性淀粉样变性、seipin蛋白病、al淀粉样变性、aa淀粉样变性、ii型糖尿病、主动脉内淀粉样变性、apoai淀粉样变性、apoii淀粉样变性、apoaiv淀粉样变性、芬兰型家族性淀粉样变性(familialamyloidosisofthefinishtype)、溶菌酶淀粉样变性、纤维蛋白原淀粉样变性、透析淀粉样变性、包涵体肌炎/肌病、白内障、甲状腺髓样癌、心脏心房性淀粉样变性、垂体泌乳素瘤、遗传性晶格角膜营养不良、皮肤苔藓状淀粉样变性、角膜乳铁蛋白淀粉样变性、角膜乳铁蛋白淀粉样变性、肺泡蛋白沉积症、牙源性肿瘤淀粉样蛋白、精囊淀粉样蛋白、囊肿性纤维化、镰状细胞病和危重病肌病。

复杂的多细胞真核生物诸如哺乳动物中的细胞在正常生理条件下很少经历营养缺乏。然而，当此类细胞经历营养缺乏或细胞应激时，自噬通常被上调，这增强了细胞存活。由于癌细胞的快速生长和遗传不稳定性，它们比未转化细胞更依赖于自噬以存活和生长(ding等人,(2009),mol.cancerther.,8(7),2036-2045)。另外，响应于由化学治疗剂引起的细胞应激，自噬经常被激活作为癌细胞中的存活机制。因此，自噬抑制剂可单独或与其他癌症治疗组合作为抗癌治疗剂(maiuri等人,(2007)nat.rev.cellbiol.8,741-752；amaravadi等人,(2007)j.clin.invest.117,326-336)。然而，在某些情况下，自噬也可以是肿瘤抑制性的，特别是在恶性肿瘤的早期阶段。一个实例是通过使用自噬的增强剂来预防nash患者的hcc(参见上文)。自噬与癌症之间的联系详细描述于“autophagyinmalignanttransformationandcancerprogression”galluzzil等人theembojournal(2015)34,856-880，其也通过引用整体并入本文。

因此，在将癌症作为自噬相关病症进行治疗的背景下，优选预防癌症或治疗非常早期的癌症阶段将涉及使用将增强自噬的如上文详细描述的vtrna或穹窿体和p62之间的相互作用的抑制剂。另一方面，治疗晚期癌症应包括使用将抑制自噬的如上文详细描述的vtrna或穹窿体和p62之间的相互作用的增强剂。

可通过本发明的方法和组合物/化合物治疗的癌症包括但不限于来自以下的癌细胞：膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳腺、结肠、食道、胃肠、牙龈、头部、肾、肝、肺、鼻咽、颈、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌头或子宫。此外，癌症可具体地属于以下组织学类型，但不限于这些：恶性肿瘤；癌；未分化的癌；巨细胞癌和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管癌；肝细胞癌；肝细胞癌合并胆管癌；小梁性腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；家族性结肠息肉腺癌；实体癌；恶性类癌瘤；细支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡状腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；非包围性硬化性癌(nonencapsulatingsclerosingcarcinoma)；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附属器癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；耳垢腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；乳腺佩吉特氏病(paget'sdisease)；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌伴鳞状化生；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质瘤；恶性泡膜细胞瘤；恶性颗粒细胞瘤；和恶性母细胞瘤；塞尔托利氏细胞癌(sertolicellcarcinoma)；恶性莱迪希细胞瘤(leydigcelltumor,malignant)；恶性脂质细胞瘤；恶性副神经节瘤；恶性乳腺外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑色素瘤；无黑素性黑色素瘤；浅表扩散性黑色素瘤；巨大色素痣内恶性黑色素瘤；上皮样细胞黑色素瘤；恶性蓝痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；间质肉瘤；恶性混合瘤；缪勒混合瘤(mullerianmixedtumor)；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；恶性间叶瘤；恶性布伦纳瘤；恶性叶状瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢甲状腺瘤；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西氏肉瘤(kaposi'ssarcoma)；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁成骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性软骨母细胞瘤；间叶性软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因氏肉瘤(ewing'ssarcoma)；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原生质星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突胶质细胞瘤；成少突胶质细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；神经节神经母细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金氏病(hodgkin'sdisease)；霍奇金氏淋巴瘤；副肉芽肿；小淋巴细胞性恶性淋巴瘤；大细胞弥漫性恶性淋巴瘤；滤泡性恶性淋巴瘤；蕈样真菌病；其他指定的非霍奇金氏淋巴瘤；恶性组织细胞增多病；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓样白血病；嗜碱细胞性白血病；嗜酸粒细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；骨髓肉瘤；和毛细胞白血病。

在某些实施方案中，本发明的方法包括治疗癌症，其包括与化学治疗剂组合施用本发明的调节剂。任何化学治疗剂都适用于本发明的方法，特别是诱导癌细胞中的细胞应激的化学治疗剂。放射疗法也可以与本发明的调节剂组合应用于治疗癌性病症。

根据本文上述发明，可以在治疗中受益于自噬增强的其他疾病包括中风、肌肉减少症、感染、免疫系统缺陷、肝病和心脏病症。

此外，提供了用于确定候选化合物是否是细胞中自噬通量的激活剂的方法，其包括抑制细胞中vtrna的表达、使所述细胞与候选化合物接触以及监测所述细胞中的自噬通量的变化，其中自噬通量的增加表明候选化合物是自噬通量的激活剂。在本发明的这个方面，vtrna选自vtrna2-1、vtrna1-1和vtrna1-2，并且优选地是vtrna1-1。各候选化合物选自前述调节剂，并且是例如抗体(例如，缀合抗体)，蛋白质，肽，小分子，rna干扰剂，如sirna分子、lna、shrna、mirna、核酶和反义寡核苷酸或构建体。

另一方面还提供了如前所述的穹窿体rna(vtrna)和p62相互作用的抑制剂，其用于医学用途。上文中详细描述了医学用途。

此外，在另一方面，提供了用于医学用途的药物组合物，其包含穹窿体rna(vtrna)和p62相互作用的抑制剂或增强剂以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。上文已经描述了本发明的各个化合物以及可以使用本发明的药物组合物的医学用途。

在一些实施方案中，本发明的主题药物组合物将以足以向患者递送治疗有效量的掺入治疗剂或其他材料的量掺入待递送的一种或多种物质，作为预防性或治疗性治疗的一部分。所需的活性剂浓度将取决于药物的吸收、失活和排泄速率以及化合物的递送速率。应注意，剂量值也可随待缓解的病况的严重程度而变化。应进一步理解，对于任何特定对象，应根据个体需要和施用或监督组合物施用的人的专业判断随时间调整具体剂量方案。通常，将使用本领域技术人员已知的技术确定给药。

可以通过参考试剂的血浆浓度来确定主题试剂的用量。例如，可以使用最大血浆浓度(cmax)和从时间0到无穷大的血浆浓度-时间曲线下面积(auc(0-4))。本发明的用量包括产生上述cmax值和auc(0-4)值的用量以及导致那些参数的值更大或更小的其他用量。

可以改变本发明的药物组合物中活性成分的实际用量水平，以便获得有效实现特定患者、组合物和施用模式的期望治疗响应而对患者无毒的活性成分的量。

选择的剂量水平将取决于多种因素，包括所用特定试剂的活性，施用途径，施用时间，所用特定化合物的排泄或代谢速率，治疗持续时间，与所用特定化合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料，所治疗患者的年龄、性别、体重、病况、一般健康状况和既往病史，以及医学领域中熟知的相似因素。

具有本领域普通技能的医生或兽医可以容易地确定和开出所需药物组合物的有效量。例如，医生或兽医可以以低于实现期望治疗效果所需的水平开出和/或施用药物组合物中使用的本发明试剂的用量，并逐渐增加用量直至实现期望效果。

以下附图、序列和实施例仅用于说明本发明，并不应解释为将本发明的范围限制于实施例中描述的本发明的具体实施方案。本文引用的所有参考文献均通过引用整体并入本文。

图1.鉴定p62为rbp和分析p62结合的rna

a.比较性相互作用组捕获结果列出了蛋白质的倍数变化，其中dmog处理后rna结合增加和减少(padj<0.05)。右栏列出了蛋白质的全细胞裂解物蛋白质组学数据。粗体数字表示显著变化(padj<0.05)。n.a.表示未检测到。

b.huh7细胞用dmog或对照处理并且uv交联(cl)或不进行uv交联(无cl)。进行小规模mrna相互作用组捕获，并分析输入样品和下拉洗脱液的蛋白质水平。

c.将来自uv交联(cl)或对照细胞的裂解物用rna酶a处理，并用于免疫沉淀，然后进行t4多核苷酸激酶标记。sds-page后，将印迹在薄膜上暴露过夜，随后用于蛋白质印迹。

d.来自所有对照和p62ip上的rna的显著(fdr<0.05)交联位点的deseq2比较。红点是p62ip中显著(padj<0.01)富集的交联位点。

e.展示在vtrna1-1转录物序列上的p62ip的显著(fdr<0.05)交联位点读取值(n＝3,平均值±s.e.m.)。预测的二级结构展示在rna序列下方(点代表单链区域，括号代表双链区域)。

图2.p62和rna的体外和体内相互作用

a.emsa，使用32p-utp标记的vtrna1-1和仅mbp标签，mbp-p62或在pb1结构域中具有突变的mbp-p62。

b.emsa，使用32p-utp标记的vtrna1-1和mbp-p62或具有r106e/r107e突变的mbp-p62。

c.按比例绘制的人p62结构域结构的方案。

d.放大aa98-163之间的人p62蛋白区域。在下面比对直系同源蛋白质；斑马鱼中的点线区域代表长肽的插入。显示了接头区和推定的锌指残基。灰色阴影肽代表来自rbdmap方案的n-连接肽。用于突变分析的残基在下面以粗体指示。

e.对表达野生型和突变形式的p62的亲本huh-7细胞或稳定细胞系进行uv-交联和裂解。将rnasea处理的裂解物用于ha免疫沉淀，然后进行t4多核苷酸激酶标记。sds-page后，将印迹在薄膜上暴露过夜，随后用于蛋白质印迹。rk/a-r139a+k141a；ryk/a-r139a+y140a+k141a；rkf-r139a+k141a+f168a；pb1m(r21a+d69a+d73a)；pb1m+2re(r21a+d69a+d73a+r106e+r107e)。

f.将表达野生型和突变形式的p62的huh-7细胞或稳定细胞系进行uv交联和裂解。用ha抗体进行免疫沉淀，然后进行pnk标记、洗脱和sds-page-。将印迹暴露于磷成像屏，并随后用于蛋白质印迹。

图3.vtrna1-1水平对自噬通量的作用

a.用sirna(seqidno:1和2)转染细胞72小时，然后裂解并分析蛋白质水平。

b.用sirna转染细胞72小时，分离总rna并通过northern印迹分析。*表示非特异性条带。

c.用指定浓度的lna寡聚物转染细胞，并在48小时后裂解。分离总rna并通过northern印迹分析。

d.用指定浓度的lna寡聚物转染细胞，并在48小时后裂解。分析蛋白质水平。

e.将细胞接种在盖片上，并在24小时后用指定的lna(50nm)转染。使细胞再生长48小时，固定，针对p62染色并在荧光显微镜下分析。

f.用空载体(ev)或编码vtrna1-1的质粒转染细胞，并在24小时后裂解。分析总蛋白质水平。

g.用指定的lna寡聚物(50nm)和sirna(20nm)转染细胞并孵育48小时。在裂解之前，将细胞在新鲜的完全培养基中孵育1小时(对照)，缺乏血清和氨基酸持续1小时(-aa)或用50nm巴佛洛霉素a1(bafa)处理5小时。分析裂解物的总蛋白质水平。

h.用指定的sirna转染细胞并在72小时后裂解。将裂解物以20,000xg预清除并保存上清液(s20)。将沉淀重新悬浮，随后以100,000xg离心。然后将上清液(s100)和沉淀(p100)用于蛋白质印迹。*表示非特异性条带。

图4：比对vtrna序列

图5：用空载体(ev)或p62野生型和变体(k141a，rk/a是指r139/k141-aa)转染用指定sirna处理的huh-7细胞。将细胞暴露于254nmuv-c光、裂解并用于ip，然后进行rna的放射性标记和蛋白质印迹。

图6：vtrna1-1经由p62调控自噬。(a)将细胞用指定的vtrna转染、进行媒介物处理或用100nm的bafa处理5小时，然后裂解。通过蛋白质印迹分析裂解物，并定量lc3b染色的图像。n＝3，***p<0.005；(b)将细胞用指定的vtrna转染，24小时后分离总rna并通过northern印迹分析。(c)用指定的lna寡聚物和对照或p62sirna转染细胞，并孵育48小时。在指定的情况下，用bafa处理细胞。通过蛋白质印迹用指定的抗体分析裂解物。(d)将细胞在基本培养基中饥饿指定时间，暴露254nmuv-c光并裂解。裂解物用于p62ip和rna放射性标记测定。sds-page和转移后，将膜在薄膜上暴露过夜，随后用于蛋白质印迹。将p62的rna结合(蓝线)定量为放射性信号与免疫沉淀蛋白质的量的比率。通过northern印迹从总裂解物中分析vtrna1-1水平，并相对于0小时饥饿时间点(红线)作图。

并且在序列中：

seqidno1：5’-ttaaagaactgtcgaa-‘3(vtrna1-1#1)

seqidno2：5’-ttaaagaactgtcga-‘3(vtrna1-1#3)

seqidno3：人vtrna1-1

seqidno4：人vtrna1-2

seqidno5：人vtrna1-3

seqidno6：人vtrna2-1

seqidno:7-14：图2和4的序列。

实施例

实施例1：dmog增加至poliiirna靶标的p62rna结合

由于翻译后修饰(ptm)对蛋白质性质和功能具有巨大影响(karve和cheema，2011)，本申请的发明人最初设定研究羟基化对rbp的rna结合活性的作用。为此目的，二甲基乙二酰基甘氨酸(dmog)用作脯氨酰羟化酶的抑制剂，所述脯氨酰羟化酶需要α-酮戊二酸(αkg)以及氧和亚铁离子进行其酶促活性。为了鉴定所涉及的新型rbp，进行了用0.5mmdmog处理90分钟的细胞上的比较性mrna相互作用组捕获，以防止由于失活的mtorc1引起的翻译关闭所导致的rbp结合的巨大变化。

全细胞裂解物蛋白质组学表明蛋白质组的巨大变化，其中mtorc1复合物的主要调节剂或组分出现在前几个上调-(ddb1、tsc2、lamtor1)或下调(lamtor2、pten)蛋白质中。比较性相互作用组捕获揭露了dmog处理后随着rna结合增加的参与应激颗粒装配、mrna输出和降解的rbp，而核糖体蛋白、翻译因子和氨酰基-合成酶显示rna结合减少(图1a)，并且rbp中的这些动力学反映了蛋白质合成速率下降。检查相互作用组蛋白肽上的肽羟基化水平在dmog和对照样品之间没有产生差异(未显示)，表明那些rbp的差异结合不受它们的肽羟基化动力学的影响。

出乎意料的是，在dmog处理后rna结合最显著增加的蛋白质是死骨片1(也称为p62)，一种靶向自噬的受体。p62是重要的自噬蛋白，已经描述了由mtorc1和p62严格控制的过程与mtorc1本身形成复合物(duran等人，2011)，这促使本申请的发明人进一步研究p62的迄今未知的rna结合功能。

通过直接蛋白质印迹可以证实来自dmog处理的huh-7细胞的mrna相互作用组捕获洗脱液中p62rna结合增加(图1b)。重要的是，dmog没有诱导tdp43的rna结合的变化，tdp43是一种熟知的易于聚集的rbp(未显示)。接下来，对细胞进行254nmuv交联(uv-cl)以共价保留rna-蛋白相互作用，然后内源性p62被免疫沉淀(ip)，并且rna的5'末端用t4多核苷酸激酶(pnk)进行磷光体-标记(图1c)。重要的是，根据rna酶浓度预处理，p62-rna复合物在sds-page凝胶中向上移动，证实了rna被磷酸化。本申请的发明人也用外源表达的flag-p62重复pnk标记测定(未显示)。

为了鉴定p62的rna靶标，使用iclip(konig等人，2010)，其允许rna-蛋白质接触(交联位点，cs)的核苷酸解析鉴定。使用两种p62抗体(小鼠单克隆和兔多克隆)、空珠粒和各自的同种型对照，并且通过蛋白质组学证实p62确实是纯化的主要蛋白，产生rna依赖性磷光体信号。接下来，本申请的发明人用来自用dmog或仅dmso、pnk标记的rna-蛋白质复合物处理的细胞的p62ip继续进行，并用随后的蛋白质印迹证实了在高rna酶处理的ip中纯化的复合物中p62的特性。在cdna产生、测序、独特定位至人类基因组之后，发现与对照相比，过滤和统计测试1998个cs(在总共约106个cs中)富集在p62样品中(图1d)。这些位点主要定位至trna和trna假基因中。来自显著p62多重定位读取(n＝5221)的cs落入5srrna、y-rna、u1和u6rna中。有趣的是，cs也在几个未剪接的trna的初级rna转录物中被鉴定，表明p62与rna的结合发生在细胞核中，可能在poliii转录附近。为了基于富集评分对p62相互作用的rna进行排序，本申请的发明人计算了结合的rna种类的长度上的定性cs密度。这表明4种穹窿体rna中的3个(vtrna2-1、vtrna1-1、vtrna1-2)是前几个富集的p62相互作用rna(图1e)。最后，p62ip中cs定量计数的比较表明，在dmog处理后具有降低的读取值的很少cs也位于上述vtrna中(图1e)。

穹窿体rna的5’和3’序列是高度保守的并且形成末端茎环区域，而中心结构域在所有四种vtrna旁系同源物之间是不同的(stadler等人，2009)。检查vtrna上的p62结合位点，并注意到p62优先结合vtrna物质的中心结构域中的单链环区域，没有明显的序列特异性(图1e)。重要的是，观察到在寡-dt级分中共纯化的vtrna，这可能解释了为什么p62出现在寡-dt介导的相互作用组捕获中，尽管主要结合poliii靶标。

这些结果显示将p62确立为rna结合蛋白，其在dmog处理后增加其rna结合并结合受限制的poliii转录的rna组，包括vtrna。

实施例2：vtrna1-1影响p62寡聚化

自从他们发现并认识到所有穹窿体rna都可以与穹窿体颗粒相缔合(nandy等人，2009)，研究最多的穹窿体rna是vtrna1-1，特别是与γ-疱疹病毒感染有关(amort等人，2015)。体外使用放射性标记的vtrna1-1和mbp标记的p62，使用电迁移率变动测定(emsa)重现rna-蛋白质相互作用。观察到vtrna1-1与mbp标记的p62相互作用，但不与仅mbp标签相互作用(图2a)，并且该相互作用易受冷标记的vtrna1-1的特异性竞争(未显示)。mbp_p62-vtrna1-1复合物的表观kd在60nm范围内。尽管事实上p62的预测pi为5.1并且使用了用于emsa的tbe缓冲液(ph8.3)，但观察到rna-蛋白质复合物信号紧接在emsa凝胶中的孔下方。

p62蛋白含有具有不同功能的结构域和基序(stolz等人，2014)。pb1结构域负责p62的寡聚化，lir-基序负责与gabarab/lc-3的结合，kir基序负责与keap1的相互作用(komatsu等人，2010)，uba结构域负责与聚泛素的结合，而zz结构域，一种简并锌指，是迄今为止表征最少的结构域，显示与rip-1相互作用(sanz等人，1999)。此外，p62具有两个核定位信号和核输出序列(pankiv等人，2010)(图2c)。

本申请的发明人假设vtrna1-1诱导与p62形成更高序的复合物，其可能通过经由pb1结构域诱导寡聚化，从而排除复合物分解成凝胶。然而，在pb1结构域的关键残基中具有突变(r21a、d69a、d73a)的p62变体消除了其聚合特性，在相似的nm范围内与vtrna1-1形成复合物并且也堆积在凝胶孔下方(图2a)。这表明vtrna1-1可能通过除了与pb1结构域相互作用之外的其他方式影响p62的更高序结构。以前，pb1和zz结构域之间的接头区显示在体外稳定p62聚合物-细丝中起重要作用(ciuffa等人，2015)。有趣的是，此区域中的双精氨酸突变(r106e，r107e)阻止了细丝形成(ciuffa等人，2015)，也显著降低了vtrna1-1与p62的结合(图2b)，这表明接头区可能有助于体外rna结合。

为了定位p62上的一个或多个rna结合残基(图2c)，本申请的发明人使用rbdmap方案(castello等人)。简而言之，将与聚a+rna交联的相互作用组捕获蛋白进行低频蛋白酶(lysc)切割，并通过寡-dt珠粒进行第二次富集。用胰蛋白酶进一步消化rna交联肽并在ms上分析。由于不可预测的质量转移，无法鉴定与rna交联的肽，相邻的肽(n-连接)表明邻近rna结合残基(castello等人)。p62的n-连接肽落入zz结构域(图2d)，预计其经由cccc和cchh残基容纳锌原子。因此，本申请的发明人通过表达p62的flag-ha标记变体，然后进行uv交联、ip和pnk标记，测试了n-连接肽近端和远端的潜在rna结合氨基酸残基的丙氨酸突变阵列。基于质粒转染的测定表明来自ryk-基序的残基r139和k141可能参与rna结合。这个基序从牛蛙到人类是保守的，并且同源建模以“对齐的”顺序呈现zz结构域外的残基r139和k141，其可以形成接触结合的rna的平台。由于内源性p62与外源表达的突变体p62杂聚，它可能干扰ip-pnk标记后的信号评价。本申请的发明人制备了可诱导的稳定细胞系和重复的ip-pnk标记(图2e)。这表明突变k141a是最多降低p62与rna结合的突变。接下来，使用稳定的诱导型细胞系通过ip-pnk测定在体内研究p62细丝形成和rna结合的关系。与体外数据相比，pb1结构域突变没有消除p62的rna结合，而2re突变与野生型组合或者与pb1结构域突变组合对p62的rna结合没有影响(图2e)。这可以反映p62在体内与rna结合的差异模式，其在体内经受体外不能再现的ptm或rnp复合物性质。

由于在page上形成p62较大的mw条带(双重峰，三重峰等)以及在堆积凝胶中聚集，可以观察到p62的多聚化(cha-molstad等人，2015)。当施加uv-cl时，这些多聚体变得显著(未显示)。如所预期的，与野生型相比，当使用p62pb1突变体时未形成多聚体，但是当使用p62k141a突变体时多聚体是显著的(图2f)。这与单体单元的rna结合呈负相关(图2f)，表明rna结合缺陷型p62更易于经由pb1结构域进行多聚化。

为了进一步显示p62蛋白的残基k141和r139参与与rna的相互作用，本申请的发明人进行了图5中所示的实验。首先，使用sirna进行对照或p62敲低。然后，分别用空载体质粒或者编码野生型或变体p62蛋白的质粒转染细胞。然后，进行免疫沉淀和t4pnk标记以评估p62的rna结合。如在图5的右上图中所观察到的，残基k141突变为丙氨酸降低了p62的rna结合，这通过k141a/r139a的双突变变得更显著。

因此，vtrna1-1通过调控p62的聚合性质和利用位于pb1和zz结构域之间接头区的贡献诱导“更小有序复合物”来影响p62的更高序形成。

实施例3：vtrna1-1水平调控p62-依赖性自噬通量

由于p62在靶向自噬过程中起作用，我们最初假定其rna结合活性可能反映参与“rna-自噬”途径，类似于酵母中描述的核糖体自噬途径(kraft等人，2008)。为了测试这一点，我们在蛋白质sirna敲低(kd)后使用northern印迹评价了vtrna水平。在p62旁边，我们敲低了vtrna稳定性所必需的tep1(kickhoefer等人，2001)，以及不直接与vtrna相互作用的穹窿体的结构组分mvp。p62的kd(图3a)导致vtrna1-1的稳态水平降低，并且vtrna1-2也降低，但程度较小，而vtrna1-3和vtrna2-1或对照trnalys和5srrna似乎未受影响(图4b)。如所预期的，tep1kd影响除vtrna1-3之外的所有vtrna种类的稳定性，而scr或mvpkd不影响vtrna水平(图3b)。因此，vtrna的降解不需要p62。

然后本申请的发明人关注vtrna1-1并观察到其使用lna的kd导致tep1和mvp蛋白水平降低，这可能是由于穹窿体复合物中这些组分的相互作用导致的(图3c，d)。有趣的是，vtrna1-1的耗损也导致p62水平降低和显著的lc3b缀合(图3c，d)，并且p62斑点的形成增加(图3e)，表明自噬通量增加。相反，本申请的发明人检查具有通过含有诱导型h1启动子的质粒过表达vtrna1-1的细胞中的自噬通量，vtrna1-1的过表达导致p62水平增加并显著降低lc3b缀合(图3f)。如通过lc3b缀合测量的，vtrna1-1过表达也可以逆转lnakd表型，尽管程度较低。这些实验表明vtrna1-1的水平影响基本的自噬通量。

接下来，本申请的发明人研究了vtrna1-1对自噬的影响是否依赖于p62。与scrsirna处理的样品相比，p62和vtrna1-1的同时kd减少了对lc3b的缀合效应(图3g)。巴佛洛霉素a1处理显示在nega和vtrna1-1lna处理的细胞之间缀合的lc3b水平没有差异，表明vtrna1-1在自噬体周转阶段不影响自噬(图3g)。因此，vtrna1-1经由p62介导其对自噬通量的影响。

vtrna1-1是穹窿体颗粒的组成部分，并且其kd也影响mvp的水平(参见图3d，g)。然而，据报道，只有约20％的vtrna1-1与穹窿体相缔合，而其余的则位于游离细胞质中(nandy等人，2009)。因此，本申请的发明人从用p62、tep1或mvpsirna处理的细胞中使用100,000g离心分离了穹窿体，并观察到在tep1和p62缺陷细胞中也形成了穹窿体(图3h)。此外，大多数tep1与穹窿体不缔合(图3h)，暗示穹窿体颗粒外的vtrna1-1-tep1复合物的功能。

实施例4：vtrna1-1特异性调节自噬

为了评估穹窿体rna1-1对p62介导的自噬的调控潜能是否也在其他穹窿体rna中观察到或对vtrna1-1特异，作者分别用对照质粒或编码不同穹窿体rna的质粒转染细胞，并通过检查lc3b缀合来测定自噬。图6a显示了几个独立实验的定量，其中lc3b缀合受到穹窿体rna1-1过表达的显著影响，但不受其他穹窿体rna的过表达的影响。重要的是，在用巴佛洛霉素a1处理后，恢复了lc3b缀合比，这显示出自噬通量的限制，而不是缀合过程中的缺陷。为了控制过表达的穹窿体rna的水平，作者从转染的细胞中分离总rna并通过northern印迹检查它们的水平，如图6b所示。

实施例5：穹窿体rna1-1-介导的对自噬的作用需要p62

为了证明穹窿体rna1-1对自噬的作用是经由p62介导的，作者使用对照或p62sirna转染结合lna介导的对照或穹窿体rna1-1的敲低。可选地，用巴佛洛霉素a1处理lna敲低细胞。图6c显示，lna介导的敲低对自噬有影响，如通过p62水平降低和lc3b的缀合增加所观察到的(比较泳道1和2)。接下来，去除p62减少了穹窿体rna敲低对lc3b缀合的作用(比较泳道2和4)，证实穹窿体rna1-1介导的对自噬的作用需要p62。最后，用巴佛洛霉素a1处理恢复了lc3b-i和lc3b-ii物质之间的相对水平(比较泳道5和6)，证实穹窿体rna1-1不抑制自噬体-溶酶体phusion，而是增加自噬通量。

实施例6：rna结合负责p62在自噬中的作用

为了确立p62的rna结合与其在自噬中的作用之间的关系，作者使细胞挨饿并通过p62免疫沉淀物的t4pnk标记测定p62的rna结合。如图6d所示，该实验显示在自噬过程中，当p62积极地清除细胞溶质货物时，其rna结合逐渐减少。这确立了p62rna结合活性与其自噬潜能之间的反比关系。接下来，作者检查了饥饿过程中的穹窿体rna1-1的水平，并观察到穹窿体rna1-1的水平逐渐下降(图6d)。该实验显示饥饿导致p62抑制剂(穹窿体rna1-1)去除，并且在穹窿体rna1-1和p62rna结合水平之间确立了因果关系。

总体而言，穹窿体rna或穹窿体的自噬清除不需要p62rna结合，而是在自噬体-溶酶体融合之前vtrna1-1经由p62用作自噬通量的负调节剂。此外，去除穹窿体也会影响自噬。

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