使用等离子体在植物细胞内导入物质的方法与流程

本发明涉及使用等离子体在植物细胞内导入蛋白质、核酸等物质的方法。

背景技术：

将蛋白质、核酸等物质导入细胞内，不仅对于基础研究，对于各种产业用途也是非常有意义的。

关于对哺乳动物细胞的物质导入，已经确立了利用细胞的胞吞作用、参与微生物的细胞内侵入的细胞透过性因子等的方法，被广泛使用。另外各种转染试剂有市售，通过适宜选择这些市售试剂，能够将所述物质导入哺乳动物细胞。

另一方面，关于植物细胞，这样的转染法不大有效，导入所述物质是困难的。认为这是因为，植物细胞被包含纤维素的强韧的细胞壁包围，因而该细胞壁成为物质导入的阻碍。

关于这样的对植物细胞的物质导入，尝试了如下方法：预先用纤维素酶等酶处理细胞壁的方法(原生质体法)、使用微小的注射器在细胞内导入物质的方法(显微注射法)；将金属微粒子用物质包覆，将其打入细胞内的方法(基因枪法)；用电在细胞膜上开孔，使物质流入细胞内的方法(电穿孔法)。

然而，为了通过这些方法进行导入，需要对每种植物研究适当的条件，尚未确立导入条件的植物种也较多。进而，利用这些方法的导入是复杂且花费工夫的操作，需要时间。另外在导入效率方面也缺乏，进而对作为导入对象的植物细胞带来伤害(损伤)。另外，在原生质体法中，原生质体的分离困难，进而其培养、由其在分化成个体困难的情况也较多。因此，鉴于这些问题点，需要能够对植物细胞无论其来源的植物和组织的种类如何，都能够不带来损伤、简便且高效率地导入物质的方法，现状是尚未确立这样的方法。

此外，等离子体处理、特别是大气压非热等离子体处理在各种领域，例如，制造业、制药业、环境控制中受到关注。实际上本发明者们已经证实了该等离子体处理对聚酰亚胺膜表面的亲水处理有效。另外，也报告了通过大气压等离子体能够分解麻醉气体和有毒化学药品。进而，关于对生物的效果，也已经表明通过大气压非热等离子体能够将细菌、生物体分子灭活。

另外，关于使用等离子体处理向细胞的物质导入，报告了通过在物质存在下对哺乳动物细胞照射等离子体，从而将该物质导入该细胞内(专利文献1和2)。此外，专利文献2中显示，该等离子体处理通常对细胞带来损伤，例如该文献中还显示照射后的细胞生存数变为一半以下(参照专利文献2的[0076]栏的记载)。另外该文献中还显示在利用等离子体处理向哺乳动物细胞导入蛋白质时，在cpp存在下其导入效率被促进(请参照专利文献2的[0082]栏的记载)。

然而，关于植物细胞，如上所述，现状是尚未确立无论其来源的植物和组织的种类如何，都能够不带来损伤、简便且高效率地对植物细胞导入物质的方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开2002/064767号

专利文献2：国际公开2011/148996号

技术实现要素：

发明要解决的课题

本发明是鉴于上述现有技术所存在的课题而做出的，目的是提供对植物细胞无论其来源植物和组织的种类如何，都能够不带来损伤、简便且高效率地导入物质的方法。

用于解决课题的手段

本发明者们为了实现上述目的反复进行了深入研究，结果表明，通过使蛋白质、核酸等物质与进行了等离子体处理的植物组织接触，该物质被导入该植物细胞内。专利文献1和2中将细胞在物质存在下进行等离子体处理，但令人惊讶的是，对于植物细胞，即使实施等离子体处理之后放置一段时间再使物质接触，也能够将该物质导入细胞。另外，植物细胞由于具有细胞壁而一般比哺乳动物细胞物质导入更困难，但根据该方法，能够不使用细胞透过性肽(cpp)等地在植物细胞中导入物质。另外，还发现对能够导入物质的植物和组织的种类无限制，通过等离子体处理不会给植物细胞带来损伤，从而完成了本发明。

即，本发明涉及使用等离子体在植物细胞内导入蛋白质、核酸等物质的方法，更详细地说提供以下发明。

＜1＞在植物细胞中导入物质的方法，该方法中，将该细胞用等离子体处理之后，使物质与该细胞接触。

＜2＞根据＜1＞所述的方法，所述物质是蛋白质或核酸。

＜3＞根据＜1＞或＜2＞所述的方法，所述等离子体是常温大气压等离子体。

＜4＞根据＜1＞～＜3＞的任一项所述的方法，所述等离子体是选自二氧化碳等离子体、氮气等离子体、氧气等离子体、氢气和氩气混合等离子体、以及空气等离子体中的至少一种等离子体。

＜5＞根据＜1＞～＜3＞的任一项所述的方法，所述等离子体是选自二氧化碳等离子体和氮气等离子体中的至少一种等离子体。

此外，本发明中，“二氧化碳等离子体”、“氮气等离子体”等是基于用于生成各等离子体的气体的种类(二氧化碳、氮气等)的名称。

发明的效果

根据本发明，对植物细胞无论其来源植物和组织的种类如何，都能够不带来损伤、简便且高效率地导入物质。

附图说明

图1是显示实施例中使用的本发明所涉及的等离子体处理的一个实施方式的概略图。即，是显示在使等离子体生成用气体从气体供给部2流入等离子体发生装置1的内部的同时，利用气体冷却装置4使该气体冷却，然后利用电力供给部3对等离子体发生装置内的内部电极施加电压，从而将等离子体5照射到试样6(植物细胞，例如，烟草的叶片)的图。

图2是显示将在大肠杆菌中表达使用镍亲和层析担载体纯化的his标签融合蛋白质用sds-page展开，用cbb染色和免疫印迹进行分析的结果的照片。图中，“1”显示将his标签融合sgfp-cyaa蛋白质用cbb染色进行分析的结果，“2”显示将his标签融合sgfp-cyaa蛋白质用利用抗gfp抗体的免疫印迹进行分析的结果，“3”显示将his标签融合sgfp-cyaa-r8蛋白质用cbb染色进行分析的结果，“4”显示将his标签融合sgfp-cyaa-r8蛋白质用利用抗gfp抗体的免疫印迹进行分析的结果。此外，供于这些分析的蛋白质的量在cbb染色中为1μg，在免疫印迹中为50ng。

图3是显示将在照射二氧化碳等离子体、氧气等离子体、氢气和氩气混合气体等离子体或氮气等离子体之后接触了his标签融合sgfp-cyaa-r8蛋白质的烟草的叶片用共聚焦显微镜观察而得到结果的照片。此外图中“notreatment”表示未实施等离子体处理的结果。

图4是显示在氢气和氩气混合气体等离子体、二氧化碳等离子体、氮气等离子体、或氧气等离子体之后接触了his标签融合sgfp-cyaa-r8蛋白质的烟草的叶片中的camp产生量的测定结果的图。此外图中，对于各条件显示独立试验的2片叶片的结果。另外图中，“noprotein”表示仅接触pbs溶液(不含有蛋白质)的结果，“notreatment”表示未实施等离子体处理的结果。此外“plasma”表示等离子体，“sec”表示秒。

图5是显示照射二氧化碳等离子体或氮气等离子体6天后的烟草的叶片的外观的照片。图中“2sec”和“5sec”显示等离子体的照射时间。图中的比例尺显示1cm。

图6是显示将在照射二氧化碳等离子体或氮气等离子体之后接触了his标签融合sgfp-cyaa蛋白质的烟草的叶片用共聚焦显微镜观察的结果的照片。

图7是显示在照射二氧化碳等离子体或氮气等离子体之后接触了his标签融合sgfp-cyaa蛋白质的烟草的叶片中的camp产生量的测定结果的图。

图8是显示将在照射空气(air)等离子体之后接触了his标签融合sgfp-cyaa蛋白质的烟草的叶片用共聚焦显微镜观察的结果的照片。

图9是显示将在照射二氧化碳等离子体或氮气等离子体之后接触了his标签融合sgfp-cyaa蛋白质的拟南芥的叶或稻的根用共聚焦显微镜观察的结果的照片。

图10是显示将在照射二氧化碳等离子体之后接触了编码sgfp蛋白质的质粒dna的溶液的烟草的叶片用共聚焦显微镜观察的结果的照片。图中的比例尺显示50μm。

具体实施方式

(向植物细胞导入物质的方法)

本发明的在植物细胞中导入物质的方法是将该细胞用等离子体处理之后，使物质与该细胞接触的方法。

本发明中所谓“植物”不特别限制，可列举例如，包含双子叶植物(烟草、拟南芥等)和单子叶植物(稻等)的被子植物、裸子植物、苔藓类植物、蕨类植物、草本植物、以及木本植物。

作为“植物细胞”，可以将存在于任意组织中的植物细胞或来源于任意组织的植物细胞在本发明中作为对象，不特别限制。作为这样的组织，可列举例如，叶、根、根尖、花药、花、种子、荚、茎、顶端、胚、花粉。另外，本发明的方法中，也可以以人工处理后的植物细胞(例如，愈伤组织、悬浮培养细胞)作为对象。

作为被导入前述的植物细胞的“物质”不特别限制，可列举例如，核苷酸(dna、rna)、肽、糖、脂质等生物体高分子。其中，核苷酸包含寡核苷酸、多核苷酸和核酸，肽包含寡肽、多肽和蛋白质，糖包含寡糖和糖链。另外，本发明所涉及的“物质”不仅限于天然存在的生物体高分子，还包含它们的衍生物(例如，交联型核苷酸、非天然型氨基酸)，进而还包含它们的复合体(例如，糖蛋白质、糖脂质、rna-蛋白质复合体)。

本发明中，“等离子体”包含构成气体的分子通过电离而被分成正(阳离子)和负(电子)的带电粒子群，是指作为全体为基本电中性的粒子的集团(电离气体)。作为处理植物细胞的“等离子体”不特别限制，可以是在大气压下发生的(大气压等离子体)，另外也可以是在低于大气压的压力下发生的(低压等离子体)，但从其发生不需要真空系统、另外接近植物的生存环境这样的观点考虑，优选为大气压等离子体。此外，本发明中，大气压不需要严格地为1013hpa，只要是其附件的压力(700～1300hpa)范围即可。

作为发生大气压等离子体的方法不特别限制，只要是本领域技术人员就能够适宜使用公知的方法来进行。作为该公知的方法，可列举例如，介质阻挡放电、电感耦合等离子体放电(icp)、电容耦合等离子体放电(ccp)、空心阴极放电、电晕放电、流注放电、辉光放电、电弧放电。其中，从能够得到比较高的等离子体/电子/基团密度、并且容易将等离子体气体温度保持较低这样的观点考虑，优选辉光放电、空心阴极放电。

另外，用于产生放电的电流根据该放电的种类、用于发生该放电(进而发生等离子体)的装置的大小和形状、为了产生放电而施加电压的电极的大小和形状等而不能一概而论，但既可以是直流也可以是交流。

另外，作为处理上述植物细胞的“等离子体”的温度不特别限制，通常为-90～200℃，优选为0～50℃，更优选为20～30℃(常温)。这样的温度控制例如可以通过oshitat，kawanoh，takamatsut，miyaharah，okinoa(2015)“温度制御可能な大気プラズマ源(温度可控的大气等离子体源)”ieeetranssci43：1987-1992、日本特开2010-061938号公报等所述的方法实现。更具体地，根据该方法，将用于生成后述的等离子体的气体通过使用液氮等的气体冷却装置冷却到低温(例如，-195℃)后，用加热器加热到所期望的温度，进行等离子体化，进而将其生成的等离子体的气体温度反馈到加热器，从而以1℃单位将等离子体的温度控制为所期望的值。

作为为了生成等离子体而施加电压的气体的种类，不特别限制，但从物质的导入效率的观点，优选为选自二氧化碳、氮气、氧气、氢气和氩气中的至少1种气体，进一步更优选为二氧化碳、氮气。另外，如后述实施例所示，也适合使用由氢气和氩气组成的混合气体(作为体积百分率，优选为0.01～50％氢气和99.99～50％氩气)、由氮气和氧气组成的混合气体(所谓空气。作为体积百分率，优选为90～70％氮气和30～10％氧气)。

另外，关于供给至等离子体发生装置的所述气体的流量，考虑该装置的大小和形状等、以及避免试样(植物细胞)被等离子体的气流吹飞、使等离子体的发生稳定，只要是本领域技术人员就能够适宜调整，可列举例如，3～5l/分钟。

作为这样的发生等离子体的装置不特别限制，例如，可提示如图1所示的构成。更具体地，本发明的用于在植物细胞中导入物质的装置除了具备能够发生等离子体的等离子体发生装置1以外，优选至少具备用于对该装置供给用于生成等离子体的气体的装置(气体供给部2)、和供给用于使所述气体电离的电力的装置(电力供给部3)，进一步更优选具备用于控制等离子体的温度的气体冷却装置4和/或用于载置试样6(植物细胞)的台(载置台)。另外，虽然图1中没有显示，但进一步优选在气体供给部2与等离子体发生装置1之间设置气体冷却和气体加温系统(气体温度调整系统)以代替气体冷却装置4。进一步另外，虽然图1中没有显示，但为了避免来自外部的热流入，也可以具备阻热材以代替气体冷却装置4。此外，作为等离子体发生装置也不特别限制，适宜使用公知的装置即可。例如，日本特开2015-072913号公报、日本特开2014-212839号公报、日本特开2013-225421号公报、日本特开2013-094468号公报、日本特开2012-256501号公报、日本特开2008-041429号公报、日本特开2009-082796号公报、日本特开2010-061938号公报中所公开的装置适合在本发明中使用。

利用如上发生的等离子体的植物细胞的处理，通常通过在等离子体照射口之下放置该细胞而照射等离子体来实现。此时，作为照射时间不特别限制，可根据所使用的等离子体和植物细胞的种类等适宜调整，从抑制对植物细胞的损伤、并且进一步提高物质的导入效率这样的观点考虑，优选为0.01～3分钟，更优选为1～30秒，进一步优选为1～10秒，特别优选为2～5秒。

进而，作为从等离子体照射口到植物细胞的距离不特别限制，因为等离子体离开等离子体发生部之后立即开始失活，所以期望尽可能缩短与等离子体照射口的距离。另一方面，等离子体需要作为气体流被排气，另外也期望抑制植物细胞被吹飞，并且对其全面地照射。而且，只要是本领域技术人员，就能够考虑所使用的等离子体装置及其气体流、以及植物细胞的种类和大小等，使上述观点并存地适宜调整，例如，作为从等离子体照射口到植物细胞的距离，可列举5～7mm左右。

另外，作为这样进行等离子体处理后的植物细胞与导入该细胞的物质的接触开始时间，不特别限制，从进一步提高利用等离子体处理的物质导入效率这样的观点考虑，优选为利用所述等离子体处理后0.01～30分钟之间，更优选为0.01～5分钟之间。进而，对于植物细胞与物质的接触时间也不特别限制，从物质的导入效率和植物细胞之后的正常生长的观点考虑，优选为1分钟～30小时。

对使物质与等离子体处理后的植物细胞接触的方法不特别限制，可以将物质本身直接添加到植物细胞的等离子体接触部，也可以根据该物质的性状在用于促进导入的担载体中担载、添加、混合或含有而添加。作为该担载体，可列举例如，脂质体等磷脂组合物、金属(金、钨等)、包含无机物(硅化合物等)的粒子、晶须、藻酸珠、病毒性物质(例如外壳蛋白质)、细胞透过性肽(cpp)。

进而，植物细胞与物质的接触也可以通过在含有物质(或所述物质与担载体的混合物等)的溶液中添加植物细胞或者在该溶液中浸泡植物细胞来进行。作为这样的溶液，只要能够维持植物细胞生存就不特别限制，可列举例如，缓冲液(磷酸缓冲生理盐水(pbs)、磷酸缓冲液(napo4和kpo4)、hepes缓冲液、tris缓冲液、mes缓冲液、柠檬酸缓冲液等)、培养基(murashige&skoog(ms)培养基等)。另外，作为溶液中的物质的浓度，可以根据各物质的种类、导入的植物及其组织的种类等来适宜调整，在物质是蛋白质的情况下，通常为1～100μg/ml，在物质是dna的情况下，通常为1～100μg/ml。

实施例

以下，基于实施例更具体地说明本发明，但本发明不限于以下实施例。另外，后述实验使用以下所示的材料和方法进行。

(植物)

供于本发明的等离子体处理等的植物组织如下制备。

对于烟草(nicotianatabacumcv.samsunnn)，将其种子播种在土中，在25℃、16小时光周期/8小时暗周期的循环下栽培，将播种后4～8周的叶(成熟叶)在纸巾上切成约1.5～2cm的四方片，供于后述的等离子体处理。另外，叶片的维持培养使用murashige&skoog(ms)的1/2盐浓度的平板培养基。

对于稻(日本晴)，在27℃、16小时光周期/8小时暗周期的循环下使用自来水进行水耕栽培，将播种后2～3周的根在载片上切成约0.5～3cm长度，供于后述的等离子体处理。

对于拟南芥(col-0)，将其种子播种在土中，在22℃、12小时光周期/12小时暗周期的循环下进行栽培，切下播种后4～8周的叶(成熟叶)，直接供于后述的等离子体处理。

(sgfp-cyaa融合蛋白质的制备)

通过本发明的等离子体处理而导入所述植物组织的蛋白质如下制备。

即首先，制备融合有腺苷酸环化酶(cyaa)、超折叠绿色荧光蛋白质(sgfp)和his标签的蛋白质(his标签融合sgfp-cyaa蛋白质)。更具体地，以pgwb5(请参照nakagawat等、(2007)、journalofbioscienceandbioengineering104，34-41.)作为模板，通过使用bamhi-sgfp-f引物(5’-taggattcaccatggtgagcaagggcgagg-3’、序列号：2)和ecori-sgfp-r引物(5’-tagaattccttgtacagctcgtccatgccg-3’、序列号：3)的pcr扩增编码sgfp的dna片段(序列号：1)。另外，为了制备pentr3c-sgfp载体，将上述扩增而得的片段用bamhi和ecori处理，然后插入pentr3c载体(invitrogen社制)。接着，以phmcya(请参照furutania等、molplantmicrobeinteract.(2009)jan；22(1)：96-106.)作为模板，通过使用ecori-cya-f引物(5’-tagaattcatgcagcaatcgcatcaggc-3’、序列号：5)和xhoi-stop-cya1200r引物(5’-tcactcgagctactggcgttccactgcgccc-3’、序列号：6)的pcr扩增在cyaa的开放阅读框(orf、序列号4)中编码其n末端400个氨基酸的部分。将这样扩增而得的片段用ecori和xhoi处理，插入pentr3c-sgfp，从而制备pentr3c-sgfp-cyaa。接下来，将该质粒用bamhi和xhoi处理，为了在sgfp-cyaa的n末端融合6×组氨酸(his标签)，将该处理片段(sgfp-cyaa片段)插入pet28a载体(novagen社制)，制备pet28a-sgfp-cyaa质粒。

另外，进一步为了制备融合有细胞透过性肽精氨酸8氨基酸(r8、序列号：7)的his标签融合sgfp-cyaa-r8蛋白质，使单链dnaecori-r8-stop-xhoi-f和xhoi-stop-r8-ecori-r退火而制备编码r8的dna片段，插入用ecori和xhoi处理后的pentr3c-sgfp中。以phmcya作为模板，通过使用ecori-cya-f引物和ecori-cya1200r引物(5’-tcgaattcctggcgttccactgcgccc-3’、序列号：8)的pcr扩增编码cyaa的n末端400个氨基酸的orf。将这样扩增而得的片段用ecori处理，插入用ecori处理后的pentr3c-sgfp-r8中。接着，将这样得到的质粒进一步用bamhi和xhoi处理，从而切下sgfp-cyaa-r8片段，将其插入pet28a载体，制备pet28s-sgfp-cyaa-r8质粒。

将如上制备的质粒pet28a-sgfp-cyaa和pet28a-sgfp-cyaa-r8导入大肠杆菌bl21(de3)。然后通过培养这些大肠杆菌，使这些质粒所编码的融合蛋白质his标签融合sgfp-cyaa和his标签融合sgfp-cyaa-r8分别表达，使用his标签蛋白质纯化用层析担载体(geヘルスケア社制、制品名：niセファロースハイパフォーマンス)，通过其说明书所述的方法进行纯化。

此外，通过cbb染色和使用抗gfp抗体(abcam社制)的免疫印迹来确认这些纯化蛋白质是所期望的融合蛋白质(参照图2)。

(等离子体处理)

等离子体处理按照takamatsut，hiraih，sasakir，miyaharah，okinoa(2013)“大気ダメージフリーマルチガスプラズマジェット源を用いた、ポリイミドフィルムの表面親水化”ieeetrans.plasmasci41：119-125、和、oshitat，kawanoh，takamatsut，miyaharah，okinoa(2015)“温度制御可能な大気プラズマ源”ieeetranssci43：1987-1992所述的方法进行。

更具体地，如图1所示，使等离子体发生装置(株式会社プラズマコンセプト東京社制、ダメージフリーマルチガスプラズマジェット(ダメージフリープラズマ(日本注册商标第5409073号)、マルチガスプラズマ((日本注册商标5432585号)、制品编号：pct-dfmj02))的装置本体接地，通过装置本体，对等离子体发生部的内部高压电极供给指定的高电压。指定的高电压是10～30khz和最大9kv调制的交流电压，这样的电力被供给到等离子体发生部，产生辉光放电，进而以氩气、氢气、二氧化碳、氮气、氧气、空气(air)、和它们的混合气体等作为气体种，以5l/分钟的流速通过1mm孔，从而生成稳定的大气压等离子体。

此外，这样生成的等离子体的温度(距离等离子体照射口5mm处的温度)根据热电对测定的结果为50℃以下。为了生成更低温(约20～30℃)的等离子体，通过使用液氮的气体冷却装置对气体进行了冷却。

然后，在如上所述制备的植物组织的正上方5mm处设置照射口，实施等离子体处理。然后，使包含或不包含所述纯化融合蛋白质的pbs溶液与该植物组织接触。

(camp酶免疫测定)

cyaa蛋白质是依赖于细胞质中存在的钙调蛋白蛋白质和atp而催化环amp(camp)产生的酶。因此，在将包含cyaa的融合蛋白质导入细胞内的情况下，通过测定细胞的camp量，能够评价导入的该蛋白质的量。

因此，为了定量地分析通过所述等离子体处理而导入植物组织的融合蛋白质，使用campbiotrak酶免疫测定(eia)系统(アマシャム社制)，按照其附带的说明书的方法测定camp量。

更具体地，通过本发明的方法处理烟草的叶之后，由该叶制备直径13mm的叶盘，将其与液氮一起用研杵和研钵磨碎，进而将所得的粉末用6％(w/v)三氯乙酸320μl处理。接下来，将200μl的匀浆以4℃、2000g离心15分钟。所得的上清用经水饱和的5倍量的乙醚洗涤4次。接着，将残余的水提取物以55℃用真空干燥机使其干燥。然后，使干燥提取物溶解在试剂盒附带的200μl测定用缓冲液中，将各溶解提取物的40μl供于camp酶免疫测定。

(共聚焦显微镜)

为了分析导入植物组织中的融合蛋白质，检测该蛋白质所含的gfp发出的荧光。具体地，使用共聚焦激光扫描型显微镜fv-300和fluoview软件(均为オリンパス社制)，获得gfp图像、内在荧光和明视场图像。

(实施例1)

通过等离子体处理向烟草的叶导入蛋白质

将使用低温(20～30℃)マルチガスプラズマジェット进行了等离子体处理(照射时间：2～30秒)的烟草叶，在实施该照射1～5秒后悬浮于含有his标签融合sgfp-cyaa-r8蛋白质的pbs溶液中，进行孵育(孵育时间：12～24小时、蛋白质溶液的浓度：50μg/ml、溶液量：400μl)。然后，在该孵育开始12～24分钟后通过共聚焦显微镜检测gfp蛋白质来源的荧光信号。此外，作为マルチガスプラズマジェット的气体源，使用co2、o2、h2与ar的混合气体(体积百分率：5％h2和95％ar)、n2。

其结果如图3所示，表明通过使用任一气体源进行等离子体处理都能对烟草的叶导入蛋白质。特别令人惊讶的是，即使如专利文献1和2所公开的那样不将细胞在物质存在下进行等离子体处理，对于植物细胞即使实施等离子体处理后隔开时间接触物质，也能够将该物质导入细胞。

接着，为了进一步选择导入效率良好的气体源，与上述同样地通过使用co2、o2、h2与ar的混合气体、n2作为气体源发生的等离子体处理烟草的叶，定量地分析该叶中的camp量。

其结果如图4所示，与图3同样地，确认了通过使用任一气体源进行等离子体处理都能对烟草的叶导入蛋白质。特别是通过由co2或n2产生的等离子体进行处理，无论其处理时间如何，camp量与由这些气体处理产生的camp量(对照)相比均有意义地增加。对于o2、h2与ar的混合气体，通过产生的等离子体进行20秒或30秒处理，确认了camp量的增加，但在5秒或10秒的处理时间下倾向于难以确认与对照的差异。

(实施例2)

对于等离子体处理对植物细胞的影响的检验

已经表明由co2或n2产生的等离子体具有使微生物灭活的能力(请参照takamatsut，ueharak，sasakiy，hidekazum，matsumuray，iwasawaa，iton，kohnom，azumat，okinoa(2015)“マルチガスプラズマジェットによって誘導される、液相における微生物不活性化”plosone10：e0135546)。

另外，虽然报告了通过在物质存在下对哺乳动物细胞照射等离子体能够将该物质导入该细胞内，但等离子体处理通常给细胞带来损伤，例如显示照射后的细胞的生存率为一半以下(请参照专利文献2的[0076]栏的记载)。因此，对于这些等离子体是否给植物组织带来损伤进行了调查。具体地，通过co2等离子体或n2等离子体将烟草的叶处理2秒或5秒，然后观察该叶的形态6天。

其结果如图5所示，即使实施等离子体处理后经过6天，也没有在烟草的叶中观察到有意义的损伤。因此表明，该等离子体处理不给植物组织带来损伤。

(实施例3)

不使用cpp通过等离子体处理对烟草的叶导入蛋白质

在本申请提出之前，关于对植物细胞的物质导入，蛋白质导入特别难，报告了通过在成花素(florigen)蛋白质等和细胞透过性肽(cpp)的悬浮液中暴露植物的顶端分生组织等，能够将该蛋白质导入这些组织的细胞(请参照国际公开2013/118863号)。还报告了通过使用注射器的浸润能够将包含多阳离子序列的cpp与蛋白质等的复合体导入植物细胞(参照ngkk等、(2016)、plosone11：e0154081.、国际公开2013/129698号)。另外，在通过等离子体处理向哺乳动物细胞的物质导入中，也显示了cpp促进其导入效率(请参照专利文献2的[0082]栏的记载)。

因此，为了对于在通过等离子体处理向植物细胞的蛋白质导入中cpp是否必要进行调查，在通过co2等离子体或n2等离子体处理烟草的叶片之后，悬浮在含有his标签融合sgfp-cyaa蛋白质的pbs溶液中，代替含有上述his标签融合sgfp-cyaa-r8蛋白质的pbs溶液，进行孵育，对于该融合蛋白质导入的有无进行检测。

如图6所示的结果表明的那样，在通过co2等离子体或n2等离子体进行了处理的任一细胞中都检测到gfp来源的荧光。进而如图7所示，通过co2等离子体处理，与通过该气体进行处理的情况下相比，camp量有意义地增加到约4.0倍。另外通过n2等离子体处理，与通过该气体进行处理的情况相比，camp量有意义地增加到约1.3倍。

此外，为了确认通过利用等离子体处理的his-sgfp-cyaa导入camp量确实增加了，等离子体处理后未添加蛋白质的叶片中测定camp量。其结果如预期的那样，在等离子体处理与未处理之间未发现有意义的差异(参照图7的c)。

由以上结果表明，在通过等离子体处理向植物细胞的蛋白质导入中，cpp不是必要的。特别令人惊讶的是表明，尽管植物细胞由于具备细胞壁而比哺乳动物细胞物质导入困难，但根据该方法，能够不使用cpp地在植物细胞中导入物质。

另外，将气体种由co2和n2替换为air(体积百分率：80％n2和20％o2)，同样地分析等离子体处理后的烟草的叶中的his标签融合sgfp-cyaa蛋白质的导入的有无。其结果如图8所示，表明即使通过air等离子体处理(2秒)，也能够不需要cpp地将蛋白质导入植物细胞内。

(实施例4)

通过等离子体处理向稻的根和拟南芥的叶中导入蛋白质

为了与上述烟草的叶同样地，对其他植物、其他组织也确认能够通过等离子体处理导入蛋白质，通过将稻的根和拟南芥的叶进行等离子体处理(处理时间：2～5秒)而尝试蛋白质导入。此外，尝试导入的蛋白质是his标签融合sgfp-cyaa蛋白质。

其结果如图9所示结果表明的那样，在任一植物和组织中都检测到gfp来源的荧光，由此确认本发明的方法无论植物及其组织的种类如何都能够导入蛋白质。

(实施例5)

通过等离子体处理向植物细胞导入dna

与上述的蛋白质同样地，按照以下记载确认通过本发明的方法也能够将dna导入植物细胞。

具体地，作为被导入植物细胞的dna，使用编码报告基因的质粒dna。此外，作为报告基因，更具体地使用编码绿色荧光蛋白质(sgfp)的p35s-sgfp-tnos、编码β葡糖醛酸糖苷酶(gus)的p35s-gus-tnos、编码荧光素酶(luc)的p35s-luc-tnos质粒dna。另外，其中，p35s是指花椰菜花叶病毒的35s启动子序列，tnos是指土壤杆菌属的胭脂碱合酶基因的终止子序列。

然后，与上述蛋白质同样地，对于烟草的叶、稻的根、拟南芥的叶制备各切片，对该切片照射n2等离子体或co2等离子体2～5秒。接下来，在以1～100μg/ml的浓度包含所述质粒dna的pbs溶液中浸泡所述切片。然后，将该切片放置在琼脂培养基上，在27℃维持1～5天。

质粒dna的导入以向细胞内导入的报告基因移动到核内、被转录翻译从而由报告基因所编码的蛋白质在细胞内表达作为指标进行确认。sgfp蛋白质的表达通过将维持27℃的切片用共聚焦显微镜进行观察来检测。gus蛋白质的表达通过将维持27℃的切片用作为显色底物的x-gluc处理，作为蓝色的显色用实体显微镜观察。luc蛋白质的表达通过将维持27℃的切片用作为luc的底物的荧光素处理，用高灵敏度ccd相机(las-3000)等检测化学发光。

实际上，与上述蛋白质同样地，对于烟草的叶制备切片，对该切片照射co2等离子体5秒。接下来，在以20μg/ml的浓度包含后述的质粒dna(pugw2-sgfp)的1/4xpbs溶液中浸泡所述切片。3～8小时之后，将该切片放置在愈伤组织形成用培养基[1xmurashige&skoog(ms)、1xms维生素(0.1μg/ml盐酸硫胺，0.5μg/ml盐酸吡哆醇，0.5μg/ml烟酸，2μg/ml甘氨酸，100μg/ml肌醇)，0.1μg/mlα-萘乙酸，1μg/ml6-苄氨基嘌呤，30g/l蔗糖，200μg/ml头孢噻肟，8.5g/l琼脂，ph5.8]上，室温放置一夜。然后，移至28℃、16小时光周期/8小时暗周期的循环下进一步使其生长1天，用共聚焦显微镜观察所述切片中的sgfp蛋白质的表达，从而尝试检测。另外，作为对照组，准备实施co2气体处理代替所述co2等离子体处理的样品，和co2等离子体处理后不接触下述质粒dna(pugw2-sgfp)的样品，在这些切片中也尝试sgfp蛋白质的表达的检测。所得的结果示于图10。

此外，导入的质粒dna(pugw2-sgfp)如下制备。以上述pgwb5作为模板，通过使用ecori-sgfp-f引物(5’-taggaattcatggtgagcaagggcgagg-3’、序列号：9)和xhoi-sgfp-r引物(5’-agtctcgagttacttgtacagctcgtccatgc-3’、序列号：10)的pcr扩增编码sgfp的dna片段(序列号：1)。接下来，将扩增的片段用ecori和xhoi处理，插入pentr3c(invitorogen-thermofisherscientific社制)的ecori和xhoi位点，制作pentr-sgfp进入克隆(entryclone)。进而，通过gateway的lrclonase反应，在pugw2目标载体(请参照nakagawaetal(2007)journalofbioscienceandbioengineering104，34-41.)中插入sgfp，从而制备pugw2-sgfp。

如图10所示结果表明的那样，在实施了等离子体处理的烟草的叶中检测到gfp来源的荧光，由此能够确认，根据本发明的方法，不仅蛋白质，连dna也能够不特别使用cpp等地导入植物细胞中。

产业可利用性

如以上说明的那样，根据本发明，无论植物细胞的来源植物和组织的种类如何，都能够对植物细胞简便且高效率地导入物质，并且不引起损伤。

因此，根据本发明的方法，能够根据植物细胞等表型的变化来分析导入的物质(基因、蛋白质等)的功能，因此在基础研究中非常有用。另外，通过这样的物质导入而被添加了新的功能的植物细胞在生物质、功能性食材、医药品材料等的生产、开发的场合非常有用，本发明给各种产业用途带来了巨大贡献。

符号说明

1…等离子体发生装置、2…气体供给部、3…电力供给部、4…气体冷却装置、5…等离子体、6…试样。

序列表自由文本

序列号：1

＜223＞超折叠绿色荧光蛋白质的基因序列

序列号：2

＜223＞人工合成的引物(bamh1-sgfp-f)的序列

序列号：3

＜223＞人工合成的引物(ecor1-sgfp-r)的序列

序列号：4

＜223＞腺苷酸环化酶

序列号：5

＜223＞人工合成的引物(ecor1-cya-f)的序列

序列号：6

＜223＞人工合成的引物(xho1-stop-cya1200r)的序列

序列号：7

＜223＞细胞透过性肽精氨酸8氨基酸的序列

序列号：8

＜223＞人工合成的引物(ecor1-cya1200r)的序列

序列号：9

＜223＞人工合成的引物(ecori-sgfp-f)的序列

序列号：10

＜223＞人工合成的引物(xhoi-sgfp-r)的序列