本申请要求于2016年7月19日提交的美国临时申请号62/363,951的优先权，其内容通过引用以其全文并入本文中。序列表的并入包含在2016年6月27日创建的名为“c1497.70006wo00.txt”的文件中的序列表同时通过电子提交(使用美国专利局的efs-web文件提交系统)并且通过引用以其全文并入本文中。本发明的领域涉及可用于辣椒素的微生物产生的方法和过程。更具体地，在一些实施例中，本发明提供了一种用于以基于植物的系统中否则不可能的产率来产生香草壬酰胺和其它特定辣椒素的方法。本发明尤其提供了一种经修饰以生物合成期望辣椒素的经基因修饰的大肠杆菌菌株、一种产生经基因修饰的微生物以产生期望辣椒素的方法、以及一种从特定起始材料开始以高产率和纯度水平产生期望辣椒素产物的方法。
背景技术：
：：在一些实施例中，本发明涉及一种用于修饰微生物菌株以便使用微生物菌株的特定进给源以高产率产生期望辣椒素化合物的方法。辣椒素化合物(包含但不限于：辣椒碱(cp)、二氢辣椒碱(dhcp)、香草壬酰胺(nv)等)是辣椒的“辣”组分，并且可以通过促进能量代谢、刺激中枢神经系统以及激活脂肪分解酶来有效预防多种病理。另外，这些化合物在消耗时对胃肠道进行消毒、提高免疫力并且对激活免疫和缓解疲劳也有效。辣椒素化学“辣味”或刺激性是产生被称为辣椒素的生物碱的辣椒属辣椒的独特特性。在自然界中，据信辣椒素存在于植物中以阻止哺乳动物食用其果实并破坏种子。人类可以通过与瞬时受体电位通道(或“trp”离子通道家族)的成员在结构上相关的受体来感受辣椒素。类似于在感觉神经元中具有重要性的其它受体，辣椒碱受体(“trpv1”，也称为辣椒素trp、辣椒素1受体或trpv1)通过可逆地丧失对辣椒碱以及其长时间暴露于相同刺激时的其它疼痛和热刺激的敏感性来中和与辣椒碱和胡椒碱相关联的辛辣气味和痛感/热感(caterina等人，1997)。这一现象可以部分解释为什么人类可以忍受并且甚至享受辣的食物，因为疼痛传感器可以被关闭。辣椒碱(“cp”)8-甲基-n-香草基-反式-6-壬烯酰胺和二氢辣椒碱(“dhcp”)8-甲基-n-香草基壬酰胺是辣椒中的两大主要的辣椒素并且共同负责辣椒(包含鬼影辣椒)的高达90％的刺激性(garcés-claver等人，2007)。这两种化合物和较次要的辣椒素化合物代表世界各地消费的食品和其它用品中的重要成分(欧洲委员会食品科学委员会(europeancommissionscientificcommitteeonfood)，2002)。一般而言，辣椒的辣椒碱含量范围为0.1％w/w到1％w/w(govindarajan和sathyanarayana，1991)，并且在许多用途中需要使用该方法来浓缩cp和/或dhcp化合物。由于辣椒素在食品、医药和其它工业和自卫用途中的广泛使用，对辣椒素化合物的产生和浓缩的需求不断增加。辣椒属包含超过20种辣椒，其中彩椒(c.annuum)、小米椒(c.frutescens)、黄灯笼辣椒(c.chinense)、风铃辣椒(c.baccatum)和绒毛辣椒(c.pubescens)已经被驯化(walsh和hoot，2001)。由于存在不同水平和类型的辣椒素，各种辣椒物种的刺激性或辣味水平存在广泛的基因变异。例如，来自彩椒的非刺激性甜椒的得分为0.0shu(斯高威尔辣度单位(scovilleheatunit)；指示辣椒碱的量的标度)，而“印度鬼椒(bhutjolokia)”或鬼影辣椒是来自印度东北部的介于黄灯笼辣椒与小米椒之间的杂交种、得分高达1,001,304shu(bosland和baral，2007)。从植物中萃取的纯cp在热指数上通常评为约16,000,000斯高威尔单位，并且在这一浓度下每克售价可以超过5000美元(batchelor，2000)。然而，辣椒中辣椒素的含量通常非常低并且可能受环境和生长条件影响很大，从而导致了可维持性和一致性问题。当从植物中萃取时，典型地，通常采用使用如己烷、氯仿和乙醇等溶剂的固-液萃取来进行辣椒素回收(catchpole等人，2003)。然而，溶剂萃取本身属于能源密集型，导致了有毒废物处理的问题，需要大量面积供植物本身生长并且产生了需要进一步纯化以回收少量成分的产物。因此，需要新的产生方法来降低纯辣椒碱和/或其它辣椒素的成本并且减少大规模培植和加工的环境影响(yao等人，1994)。对所选微生物菌株的基因操纵有可能解决这些需要的改进并且增加期望辣椒素品种的选择度、丰度和纯度。除此之外，消费者赞同并积极寻求食品、香味、调味或药用组分的天然和生物来源的同时，他们还关注采购、一致效能和环境可持续性生产。在这一情况下，本发明的微生物发酵和产生方法在一些实施例中提供了由经修饰的微生物菌株产生的化合物，该经修饰的微生物菌株能够以生物学方式产生可用于各种工业和研究的量的产物，，同时以比无机化学合成更自然的方式这样做。因此，需要开发一种使用可以稳定地产生期望的辣椒碱化合物的经修饰微生物菌株、通过开发特定生物途径来产生cp、nv和dhcp以及其它辣椒素的新型方法。具体地，本发明尤其提供了用于根据发酵过程产生商业相关量的cp、nv和dhcp的方法。技术实现要素：本发明涵盖了产生辣椒素的改进方法。本发明提供了在包括细胞系统如酵母或细菌的经修饰的微生物中产生辣椒素的方法。申请人已经分离了酰基-coa合成酶(“acs”)(seqidno:1)和辣椒碱合酶(“cs”)(seqidno:2)的基因，并将其插入到感兴趣的细胞系统中，在优选实施例中，这个细胞系统在大肠杆菌中。这些基因在表达时允许在这个系统中产生辣椒素。根据本发明，在一些实施例中，这个系统产生了大量cp、dhcp和nv辣椒素。根据本发明，在一些实施例中，提供了一种由中/长链羧酸制备羧基coa的生物合成方法，该方法包含在细胞系统中表达acs和cs。在一些实施例中，该系统需要长链羧酸，从而在培养基中生长由acs和cs转化的细胞系统并产生羧基coa。然后，这些培养物在经修饰的微生物菌株从天然前体进给时产生某些辣椒素。因此，壬酸可以用作进给前体并且可以从例如天竺葵油或欧洲橄榄油(油橄榄)获得。本发明的其它进给前体包含辛酸、癸酸、香草醛和香兰素胺。根据本发明，也可以使用辛酸，并且辛酸天然存在于例如棕榈油和椰子油中。癸酸存在于萼距花属物种的种子中。天然香草醛也可以通过微生物发酵产生(zhou和yu，2014)。另外，可以通过pamt从香草醛中获得天然香兰素胺(weber等人，2014)。本发明的方法提供了一种开发细菌菌株的方法，该细菌菌株能够通过对更具成本效益且更容易获得的特定起始分子进行基因修饰和靶向进给来产生大量的辣椒素。在本发明的某些实施例中，产生的目标辣椒素选自由nv、cp和dhcp组成的组。本公开的实施例是通过由中至长链羧酸制备羧基coa来开发辣椒素的生物合成方法，该方法包括在细胞系统中表达acs、将中至长链羧酸进给到细胞系统、在培养基中生长细胞系统以及产生羧基coa。进一步的实施例是从克隆自鬼影辣椒的acsl表达acs。(参见表1)。替代性实施例是从基于lcas4或lcas5的拟南芥表达acs。在另一个实施例中，从克隆自辣椒属的acs2表达acs。进一步地，在一些实施例中，本发明中使用的acs是与从鬼影辣椒克隆的acsl共享至少66％(例如，至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)的序列同一性的acs。在另一个实施例中，acs是在蛋白质水平上与从鬼影辣椒克隆的acsl共享至少92％(例如，92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列相似性的acs。进一步的实施例是中链或长链羧酸是8-甲基-反式-6-壬烯酸。长链羧酸通常具有14个至18个碳，而中链羧酸通常具有8个至13个碳。在本发明的一个实施例中，将中至长链羧酸进给到细胞系统包括将中至长链羧酸加入到细胞系统中以供所选菌株使用。在本发明的一个实施例中，将中至长链羧酸进给到细胞系统包括从细胞系统中的生物合成途径表达中至长链羧酸。在产品/商业功用方面，美国市场上有几十种含有辣椒碱的产品，并且其可以用于从止痛剂到驱虫剂的一切以及用于食品中并且作为膳食补充剂。含有辣椒碱的产品可以是例如气雾剂、液体或颗粒制剂。至于本实施例中的细胞系统，其选自由细菌、酵母及其组合组成的组或者是允许用所选基因进行基因转化并随后由替代性进给前体以生物合成方式产生期望辣椒素的任何细胞系统。在最优选的微生物系统中，适用大肠杆菌来产生期望的辣椒素化合物。本公开的实施例是一种制备8-甲基壬烯酰基-coa的生物合成方法，该生物合成方法包括在细胞系统中表达acs、将8-甲基-反式-6-壬烯酸进给到该细胞系统、使该细胞系统在培养基中生长以及产生8-甲基壬烯酰基-coa。在一些实施例中，本发明的acs从克隆自鬼影辣椒的acsl表达。可替代地，该acs可以从克隆自拟南芥的lcas4或lcas5表达。在另一个实施例中，本发明的acs从克隆自辣椒属的acs2表达。进一步地，在一些实施例中，acs是与从鬼影辣椒克隆的acsl共享至少66％(例如，至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)的序列同一性的acs。在另一个实施例中，acs是在蛋白质水平上与从鬼影辣椒克隆的acsl共享至少92％(例如，92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列相似性的acs。在一些方面，本发明提供了一种制备感兴趣的辣椒素的生物合成方法，其包括：在转化的细胞系统中表达acs和cs；使该细胞系统在培养基中生成；以及产生该感兴趣的辣椒素。在一些实施例中，该acs是从辣椒属植物克隆的。在一些实施例中，该辣椒属植物是鬼影辣椒。在一些实施例中，表达的该acs衍生自从基于lcas4或lcas5的拟南芥克隆的基因。在一些实施例中，该cs是从辣椒属植物克隆的。在一些实施例中，该辣椒属植物是鬼影辣椒。在一些实施例中，该方法进一步包括除培养基之外还将源材料进给到该细胞系统。在一些实施例中，该源材料选自由以下组成的组：壬酸；天竺葵油；辛酸；癸酸；香草醛；以及香兰素胺。在一些实施例中，该源材料是以下中的两种或更多种的混合物：壬酸；天竺葵油；辛酸；癸酸；香草醛；以及香兰素胺。在一些实施例中，该源材料是壬酸。在一些实施例中，该源材料选自由以下组成的组：属于中至长链脂肪酸的c6至c12碳氢化合物。在一些实施例中，该源材料是属于中至长链脂肪酸的两种或更多种c6至c12碳氢化合物的混合物。在一些实施例中，该转化细胞系统选自包含酵母、非辣椒素产生植物、藻类和细菌的组。在一些实施例中，该细胞系统是大肠杆菌。在一些实施例中，该感兴趣的辣椒素是辣椒碱。在一些实施例中，该感兴趣的辣椒素是nv。在一些实施例中，该感兴趣的辣椒素是dhcp。在一些实施例中，所产生的辣椒素是包括cp、nv和dhcp的混合物。在一些实施例中，该感兴趣的辣椒素是降二氢辣椒碱。在一些实施例中，所利用的acs是与seqidno:3共享至少75％(例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)的dna序列相似性的acs。在一些实施例中，所利用的acs是与seqidno:1共享至少90％(例如，至少90％、至少95％、至少99％或100％)的蛋白质序列相似性的acs。在一些实施例中，所利用的cs是与seqidno:4共享至少75％(例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)的dna序列相似性的cs。在一些实施例中，所利用的cs是与seqidno:2共享至少90％(例如，至少90％、至少95％、至少99％或100％)的蛋白质序列相似性的cs。在一些实施例中，该细胞系统选自由细菌、酵母、植物细胞、动物细胞、体外转译系统及其组合组成的组。在一些实施例中，产生该感兴趣的辣椒素包括：i)纯化粗产物；以及ii)在真空下除去溶剂以提供浓缩的辣椒素产物。在一些实施例中，该粗产物通过柱色谱法纯化。在一些实施例中，该粗产物通过酸-碱萃取纯化。在一些实施例中，该粗产物通过真空蒸馏纯化。在一些实施例中，该产物通过半制备型hplc纯化。在一些实施例中，该细胞系统进一步包括转氨酶，该转氨酶能够催化香草醛向香兰素胺的转换。在一些实施例中，该转化细胞系统包含来自长春花的caugt2。在一些实施例中，该转化细胞系统包含与seqidno:5共享至少75％(例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)的dna序列相似性的caugt2。在一些实施例中，该转化细胞系统包含与seqidno:6共享至少90％(例如，至少90％、至少95％、至少99％或100％)的蛋白质序列相似性的caugt2。在其它方面，本发明提供一种在培养基中生长的转化细胞系统产生的感兴趣的辣椒素。在一些实施例中，该转化细胞系统选自由以下组成的组：酵母、非辣椒素产生植物、藻类和细菌。在一些实施例中，该转化细胞系统通过衍生自辣椒属植物的acs和cs的存在进行转化。在一些实施例中，转化到该细胞系统中的该acs是衍生自基于lcas4或lcas5的拟南芥的acs。在一些实施例中，该转化细胞系统通过衍生自辣椒属植物的acs和cs的存在进行转化。在一些实施例中，该转化细胞系统通过衍生自鬼影辣椒的acs和cs的存在进行转化。在一些实施例中，产生的方法进一步包括向该转化细胞系统进给特定的源材料。在一些实施例中，该源材料选自由以下组成的组：壬酸；天竺葵油；辛酸；癸酸；香草醛；以及香兰素胺。在一些实施例中，该源材料选自以下中的两种或更多种的混合物：壬酸；天竺葵油；辛酸；癸酸；香草醛；以及香兰素胺。在一些实施例中，该辣椒素是cp。在一些实施例中，该辣椒素是nv。在一些实施例中，该辣椒素是dhcp在一些实施例中，所产生的辣椒素是cp、nv和dhcp的混合物。在一些实施例中，该辣椒素的纯度大于70％(例如，大于70％、大于80％、大于90％、大于95％、大于98％或大于99％)。在一些实施例中，以干重计，辣椒素含量大于约85％(例如，大于约85％、大于约90％、大于约95％、大于约98％、或大于约99％)。在一些实施例中，该辣椒素是纯化的辣椒碱。在又其它方面，本发明提供一种产生感兴趣的辣椒素的方法，其包括向转化的微生物培养物进给特定的脂肪酸前体。在一些实施例中，该感兴趣的辣椒素是辣椒碱并且该脂肪酸前体是6e-8-甲基-6-壬烯酸。在一些实施例中，该感兴趣的辣椒素是二氢辣椒碱并且该脂肪酸前体是8-甲基壬酸。在一些实施例中，该感兴趣的辣椒素是香草壬酰胺并且该脂肪酸前体是壬酸。在一些实施例中，该感兴趣的辣椒素是n-香草辛酰胺并且该脂肪酸前体是辛酸。在一些实施例中，该感兴趣的辣椒素是n-香草癸酰胺并且该脂肪酸前体是癸酸。在一些实施例中，所转化的培养物是酵母或细菌的微生物培养物。在一些实施例中，该微生物培养物表达与seqidno:3共享至少75％(例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)的dna序列相似性的acs。在一些实施例中，该微生物培养物表达与seqidno:1共享至少90％(例如，至少90％、至少95％、至少99％或100％)的蛋白质序列相似性的acs。在一些实施例中，该微生物培养物表达与seqidno:4共享至少75％(例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)的dna序列相似性的cs。在一些实施例中，该微生物培养物表达与seqidno:2共享至少90％(例如，至少90％、至少95％、至少99％或100％)的蛋白质序列相似性的cs。在一些实施例中，该微生物培养物表达与seqidno:5共享至少75％(例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)的dna序列相似性的caugt2。在一些实施例中，该微生物培养物表达与seqidno:6共享至少90％(例如，至少90％、至少95％、至少99％或100％)的蛋白质序列相似性的caugt2。在其它方面，本发明提供一种用于局部治疗疼痛的镇痛组合物，其中该组合物含有有效量的一种或多种辣椒素，其中该镇痛组合物是通过本文所述的任何方法产生的，其中改进包括在微生物细胞系统中产生该辣椒素。在一些实施例中，该有效量为至少0.0125％的感兴趣的辣椒素。在一些实施例中，该辣椒素选自包括以下的组：香草壬酰胺、n-香草基壬酰胺、n-香草基磺酰胺、n-香草基脲、n-香草基氨基甲酸酯、n[(被取代的苯基)甲基]烷基酰胺、亚甲基取代的n[(被取代的苯基)甲基]烷烃酰胺、n[(被取代的苯基)甲基]-顺式-单饱和烯烃酰胺、n[(被取代的苯基)甲基]二不饱和酰胺、3-羟基乙酰苯胺、羟基苯基乙酰胺、假辣椒碱、二氢辣椒碱、降二氢辣椒碱、高辣椒碱、高二氢辣椒碱i、大麻素、胡椒碱、姜油酮、八氢三甲基萘醇二醛(warburganal)、水蓼二醛(polygodial)、非砂仁二醛(aframodial)、肉桂二醛(cinnamodial)、肉桂硫酰亚胺(cinnamosmolide)、肉桂酸内酯(cinnamolide)、赛维德(civamde)、香草壬酰胺、奥伐尼(olvanil)、n-油烯基-高香草酰胺(n-oleyl-homovanillamidia)、小皮伞烷型化合物(isovelleral)、鳞二醛(scalaradial)、祖二醛(ancistrodial)及其任何组合或混合物。在其它方面，本发明提供一种香精和香料组合物，其中该香精和香料组合物具有根据本文所述的任何方法产生的至少一种辣椒素。在一些实施例中，该辣椒素选自包括以下的组：香草壬酰胺、n-香草基壬酰胺、n-香草基磺酰胺、n-香草基脲、n-香草基氨基甲酸酯、n[(被取代的苯基)甲基]烷基酰胺、亚甲基取代的n[(被取代的苯基)甲基]烷烃酰胺、n[(被取代的苯基)甲基]-顺式-单饱和烯烃酰胺、n[(被取代的苯基)甲基]二不饱和酰胺、3-羟基乙酰苯胺、羟基苯基乙酰胺、假辣椒碱、二氢辣椒碱、降二氢辣椒碱、高辣椒碱、高二氢辣椒碱i、大麻素、胡椒碱、姜油酮、八氢三甲基萘醇二醛、水蓼二醛、非砂仁二醛、肉桂二醛、肉桂硫酰亚胺、肉桂酸内酯、赛维德、香草壬酰胺、奥伐尼、n-油烯基-高香草酰胺、小皮伞烷型化合物、鳞二醛、祖二醛及其任何组合或混合物。尽管本公开易于有各种修改和替换形式，但是其特定实施例通过举例示出在附图中并且将在本文中详细描述。然而，应当理解的是，本文所呈现的附图和详细描述并非旨在将本公开限制于所公开的特定实施例，相反，其目的是覆盖落入如随附权利要求书所限定的本公开的精神和范围内的所有修改、等同物和替代方案。参考附图，本发明的其它特征和优点将在以下对本发明的优选实施例的详细描述中变得显而易见。附图说明图1示出了辣椒素生物合成途径。转氨酶(pamt)催化由香草醛形成香草壬酰胺。图2示出了根据本发明的转化细胞系统的实施例的特定辣椒素化合物的产生水平。分别由6e(6e-8-甲基壬烯酸)、c8:0(辛酸或羊脂酸)、c9:0(壬酸或天竺葵酸)和c10:0(癸酸或羊蜡酸)产生的cp(辣椒碱)、cp8(n-香草辛酰胺)、cp9(香草壬酰胺)或cp10(n-香草癸酰胺)。一式三份地进行实验。每对中的左栏是1d。每对中的右栏是2d。图3示出了优选的细胞系统的hplc图谱，特别是来自分别进给有c8:0、c9:0和c10:0的大肠杆菌培养物的粗乙酸乙酯萃取物的hplc图谱。cp8(n-香草辛酰胺)、cp9(香草壬酰胺)和cp10(n-香草癸酰胺)的保留时间分别为10.9分钟、11.3分钟和11.8分钟。插入的图片是其紫外可见光谱(uv-visspectra)。图3是底物和产物的读数，在280nm处测量峰面积。图4示出了香草壬酰胺标准物的hplc图谱以与本发明的细胞系统的实施例进行比较。图5示出了在pamt合酶存在的情况下由香草醛产生辣椒碱。图6示出了caugt2的ni-nta亲和色谱。pre：柱前；post：柱后；e1、e2、e3：从柱中收集的馏分。带his标签的caugt2的分子量为约58kd。图7示出了在体外通过caugt2产生辣椒碱-葡糖苷(capsaicin-glu)和香草壬酰胺-葡糖苷(nonivamide-glu)。图8示出了降二氢辣椒碱(7m-cp)的结构。降二氢辣椒碱(7m-cp)是辣椒中第三丰富的cp，占总辣椒素的约7％。图9示出了7m-cp产生和c9-cp产生的hplc图谱。图10示出了在同一培养系统中对c9-cp产生和7m-cp产生的比较。一式两份地进行实验。优选实施例说明以下缩写在说明书中具有指定含义：本文所使用的术语解释：辣椒碱或cp是无色刺激性酚酰胺c18h27no3并且是存在于各种辣椒物种及其杂交种中的一系列酚酰胺中的一种，辣椒碱给予辣椒其热性或刺激性且用于食品、医药和安全应用。纯cp是挥发性、疏水、无色、无味、结晶至蜡状化合物。辣椒素如本文所使用的是指负责辣椒的热量的与辣椒碱有关的一类刺激性化合物。辣椒素对于包含人类在内的哺乳动物而言是刺激物并且可以在其接触的任何组织中产生灼烧感。辣椒素是由辣椒产生的次级代谢物，可能作为针对某些哺乳动物和真菌的顿感剂。示例性辣椒素包含但不限于：香草壬酰胺、n-香草基壬酰胺、n-香草基磺酰胺、n-香草基脲、n-香草基氨基甲酸酯、n[(被取代的苯基)甲基]烷基酰胺、亚甲基取代的n[(被取代的苯基)甲基]烷烃酰胺、n[(被取代的苯基)甲基]-顺式-单饱和烯烃酰胺、n[(被取代的苯基)甲基]二不饱和酰胺、3-羟基乙酰苯胺、羟基苯基乙酰胺、假辣椒碱、二氢辣椒碱、降二氢辣椒碱、高辣椒碱、高二氢辣椒碱i、大麻素、胡椒碱、姜油酮、八氢三甲基萘醇二醛、水蓼二醛、非砂仁二醛、肉桂二醛、肉桂硫酰亚胺、肉桂酸内酯、赛维德、香草壬酰胺、奥伐尼、n-油烯基-高香草酰胺、小皮伞烷型化合物、鳞二醛、祖二醛及其任何组合或混合物。表2中进一步描述了某些辣椒素。细胞系统是提供异位蛋白质的表达的任何细胞。细胞系统包含细菌、酵母、植物细胞和动物细胞。细胞系统包含原核细胞和真核细胞两者。细胞系统还包含基于如核糖体等细胞组分的蛋白质的体外表达。脂肪酸，c6-c12.根据本发明，可以使用各种脂肪酸作为起始源材料。源材料包含香草醛、香兰素胺或其在芳族环处具有修饰如甲基化、乙基化或糖基化的衍生物；并且更具体地说，6-12碳直链或支链脂肪酸或其衍生物如羟基脂肪酸(例如己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一酸和十二酸)可以是直链脂肪酸或支链脂肪酸并且可以用于制备本发明的辣椒素。使细胞系统生长.生长包含提供将会允许细胞繁殖和分裂的适合的培养基。生长还包含提供资源使得细胞或细胞组分可以转译和制备重组蛋白。蛋白质表达.蛋白质产生可以在基因表达后发生。蛋白质产生由将dna转录为信使rna(mrna)后的阶段组成。然后将mrna转译成多肽链，该多肽链最终折叠成蛋白质。dna可以通过转染—将核酸有意地引入到细胞中的过程—而存在于细胞中。此术语常用于真核细胞中的非病毒方法。此术语还可以指其它方法和细胞类型，但优选其它术语：“转化”更常用于描述细菌、包含植物细胞在内的非动物真核细胞中的非病毒dna转移。在动物细胞中，转染是优选的术语，因为转化还用于指在这些细胞中发展成癌性状态(致癌作用)。转导常用于描述病毒介导的dna转移。转化、转导和病毒性感染包含在本申请的转染定义下。酵母.根据本发明，如本文所要求保护的，酵母是被分类为真菌界成员的真核单细胞微生物。酵母是从多细胞祖先进化而来的单细胞生物，但是其中可用于本发明的一些物种是能够通过形成称为假菌丝(pseudohyphae/falsehyphae)的连接芽殖细胞串来发展多细胞特性的那些。首字母缩略词：pal，苯丙氨酸氨裂解酶；ca4h，肉桂酸4-羟化酶；4cl，4-香豆酸coa连接酶；hct，羟基肉桂酰转移酶；c3h，香豆酰莽草酸酯/奎尼酸酯3-羟化酶；comt，咖啡酸o-甲基转移酶；pamt，转氨酶；bcat，支链氨基酸转移酶；kas，3-酮-酰基acp合酶；acl，酰基载体蛋白；fata，酰基-acp硫酯酶；acs，酰基-coa合成酶；以及cs，辣椒碱合酶。具体实施方式在一些实施例中，本发明涉及用于如从特定进给前体发展来的cp、dhcp和nv的改进产生方法的系统。香草壬酰胺，也被称为天竺葵酸香草酰胺或pava(本文为“nv”)，是辣椒中鉴定的痕量辣椒素之一(图2；constant等人，1996)。香草壬酰胺用作辛辣味的食品添加剂。其还用于制药工业作为辣椒碱的替代方案。然而，由于辣椒中香草壬酰胺的含量极低，因此使用本发明的植物萃取方法在商业上是不可行的，所以其仅通过化学合成制成。虽然化学合成的香草壬酰胺容易获得且较为廉价，但是非天然化合物并未被需求有利于天然产物的消费者很好地感知到。为了天然，化学品必须是通过萃取天然材料衍生的或必须是通过天然前体的酶或微生物转化的，如本发明的方法中所提供的。本发明的一方面是本发明的acs和cs的dna和相应的蛋白质序列。将acs酶和cs酶的dna序列从鬼影辣椒杂交种中鉴定出来并从中除去并插入到质粒中以用于本发明。此类序列在本文中分别提供为seqidno:3和seqidno:4。本发明包含核酸分子及其在本文所述的方法中的用途，核酸分子具有分别与seqidno:1和seqidno:2或其任何互补物或其任何顺式元件杂交的核酸序列。本发明还提供了核酸分子及其在本文所述的方法中的用途，核酸分子包括选自由以下组成的组的核酸序列：本发明的acs系列和cs序列的seqidno:3至seqidno:4、其任何互补体或其任何顺式元件或其任何片段。(见表1，seqidno:3和4)。另外的实施例包含通过利用用于过表达转化植物中的基因的标准已知技术过表达acsl来使用acsl修饰辣椒植物中的辣椒素水平。另一个实施例包含通过利用用于敲除或敲下基因表达的标准已知技术敲除或敲下acsl来使用acsl调节辣椒植物中的辣椒素水平。同样，过表达或敲除/敲下是通过本领域普通技术人员已知的标准分子细胞策略和技术。另一个实施例包含使用acsl生成酰基-coa和包含脂肪酸在内的其下游代谢物，涉及acsl的表达或过表达。另一种变化是使用acsl调节酰基-coa和包含脂肪酸在内的其下游代谢物，包括敲除或敲下acsl。所产生的不同特定辣椒素由进给到培养物的不同脂肪酸确定。(见表3)。可以利用通过本发明的方法制备的酰基coa来制备感兴趣的辣椒素，并且其通常属于中链种类。同样，虽然acsl可以介导中链羧酸和长链羧酸两者到酰基-coa的转换，但是中链活性远比长链活性重要，因为中链活性是当今生物燃料工业的重要构成部分。如上文中针对acsl描述的其它重要性是其可以用于通过转基因技术来修饰植物中的辣椒素水平。然而，acsl不是根据关于长链酰基-coa的用途产生的。在实施例中，可以修饰细胞系统如基于细菌的系统或基于酵母的系统以表达acs。acs可以是从鬼影辣椒克隆的acs1。其它适合的acs是基于来自拟南芥的lcas4和lcas5的acs。其它已知的acs1和acs2也可以表达在细胞系统中。然后可以将适合的底物如8-甲基-反式-6-壬烯酸和8-甲基壬酸进给到细胞系统中。底物还可以表达为细胞系统内的生物合成途径的一部分。然后孵育细胞系统，从而允许以生物合成方式产生8-甲基-反式-6-壬酰基coa或8-甲基壬酰基-coa。根据本发明的另一个实施例，可以通过密码子变化来增强微生物系统中异源蛋白质产生的效率，该密码子变化将dna序列改变为可以通过将细胞系统用于表达而优选但在不改变所产生的最终多肽的情况下因原始基因源生物而变化的dna序列。通常用于克服这一问题的方法包含定向诱变以除去稀有密码子或在特定细胞系中添加稀有密码子trna以朝向将产生感兴趣的多肽的宿主生物所优选的密码子序列移动。最近，此类“密码子优化”技术的改进使得能够成本有效地产生合成基因，从而使其成为可行的替代方案并且可能可用于本发明。同一性和相似性同一性是在序列比对(该比对可以使用仅序列信息或结构信息或其它某个信息来完成，但其通常是单独基于序列信息)后一对序列之间相同的氨基酸分数，并且相似性是基于使用某个相似性矩阵的比对分配的得分。相似性指数可以是以下blosum62、pam250或gonnet中的任何一个或本领域技术人员用于蛋白质序列比对的任何矩阵。同一性是两个子序列之间的对应程度(序列之间没有间隙)。25％或更高的同一性意味着功能的相似性，而18％至25％意味着结构或功能的相似性。请记住，两个完全不相关的或随机的序列(大于100个残基)可以具有高于20％的同一性。相似性是在比较两个序列时这两个序列之间的相似程度。这取决于其同一性。使用杂交技术来确定序列相似性核酸杂交是dna操纵领域的技术人员公知的技术。给定核酸对的杂交性质指示其相似性或同一性。术语“杂交”通常是指核酸分子能够通过互补碱基链配对进行连接。当在适合的条件下接触核酸分子时，可能发生此类杂交。“特异性杂交”是指两个核酸分子能够形成反平行双链核酸结构。如果核酸分子表现出“完全互补性”，即一个序列中的每个核苷酸与其在另一个序列中的碱基配对配偶体核苷酸互补，则称核酸分子是另一个核酸分子的“互补体”。如果两个分子可以在足以允许其在至少常规的“低严格”条件下保持彼此退火的稳定性下彼此杂交，则称这两个分子“最低限度地互补”。类似地，如果分子可以在足以允许其在常规的“高严格”条件下保持彼此退火的稳定性下彼此杂交，则称分子“互补”。与其它核酸分子例如至少在低严格条件下杂交的核酸分子被称为其它核酸分子的“可杂交同源物”。本文中以及sambrook等人，《分子克隆实验室手册(molecularcloning,alaboratorymanual)第2版》，冷泉港出版社，冷泉港，纽约(1989)和haymes等人，《核酸分子杂交实用方法(nucleicacidhybridization,apracticalapproach)》，irl出版社，华盛顿哥伦比亚特区(1985)中描述了常规的低严格条件和高严格条件。从完全互补偏离是允许的，只要此类偏离不完全妨碍分子形成双链结构的能力即可。可以使用低严格条件来选择与靶核酸序列具有较低序列同一性的核酸序列。人们可能希望在约20℃至约55℃的范围内的温度下采用如约0.15m至约0.9m氯化钠等条件。可以使用高严格条件可以来选择与公开的核酸序列具有较高同一性程度的核酸序列(sambrook等人，1989)。高严格条件通常涉及在约50℃至约70℃下孵育数小时至过夜的情况下在以下中进行核酸杂交：约2x至约10x的ssc(在蒸馏水中从含有3m氯化钠和0.3m柠檬酸钠的20x的ssc储备溶液中稀释，ph为7.0)、约2.5x至约5x的denhardt溶液(在蒸馏水中从含有1％(w/v)牛血清白蛋白、1％(w/v)聚蔗糖和1％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮的50x储备溶液稀释)、约10mg/ml至约100mg/ml的鱼精子dna、以及约0.02％(w/v)至约0.1％(w/v)的sds。高严格条件优选由在55℃下孵育数小时的6x的ssc、5x的denhardt溶液、100mg/ml鱼精dna和0.1％(w/v)的sds提供。杂交后通常有几个洗涤步骤。洗涤组合物通常包括在约20℃至约70℃下孵育15分钟的0.5x至约10x的ssc和0.01％(w/v)至约0.5％(w/v)的sds。优选地，在65℃下在0.1x的ssc中洗涤至少一次后，核酸区段保持杂交。核酸分子优选包括在低或高严格条件下与seqidno:3和seqidno:4、其任何互补体或其任何片段或其任何顺式元件杂交的核酸序列。核酸分子最优选包括在高严格条件下与seqidno:3和seqidno:4、其任何互补体或其任何片段或其任何顺式元件杂交的核酸序列。使用同一性评分来分析序列相似性本文所使用得“序列同一性”是指两个最佳比对的多核苷酸或肽序列在组分例如核苷酸或氨基酸的整个比对窗口中不变的程度。测试序列和参考序列的比对区段的“同一性分数”是两个比对序列共享的完全相同的组分的数量除以参考序列区段即整个参考序列或参考序列的较小定义部分中的组分总数。如本文所使用的，术语“序列同一性百分比”或“同一性百分比”是指在两个序列进行最佳比对(在比较窗口上，适合的核苷酸插入、删除或间隙总计小于参考序列的20％)时参考(“查询”)多核苷酸分子(或其互补链)与测试(“受试者”)多核苷酸分子(或其互补链)相比线性多核苷酸序列中完全相同的核苷酸的百分比。用于比对比较窗口的最佳序列比对是本领域技术人员公知的，并且可以通过工具如smith和waterman的局部同源性算法、needleman和wunsch的同源性比对算法、pearson和lipman的相似性搜索方法来执行，并且优选地通过这些算法的计算机化实施方式如作为wisconsin(accelrys公司，柏林顿，马萨诸塞州)的一部分可得到的gap、bestfit、fasta和tfasta来执行。测试序列和参考序列的比对区段的“同一性分数”是两个比对序列共享的完全相同的组分的数量除以参考序列区段即整个参考序列或参考序列的较小定义部分中的组分总数。序列同一性百分比表示为同一性分数乘以100。可以将一个或多个多核苷酸序列与全长多核苷酸序列或其部分或与更长的多核苷酸序列进行比较。出于本发明的目的，还可以使用用于转译核苷酸序列的blastx2.0版和用于多核苷酸序列的blastn2.0版来确定“同一性百分比”。序列同一性百分比优选使用序列分析软件包tm(第10版；遗传学计算机集团公司(geneticscomputergroup,inc.)，麦迪逊，威斯康星州)的“最佳拟合(bestfit)”或“间隙(gap)”程序来确定。“间隙”利用needleman和wunsch的算法(needleman和wunsch，《分子生物学杂志(journalofmolecularbiology)》，48:443-453,1970)来找到两个序列的、最大化匹配数并最小化间隙数的比对。“最佳拟合”使用smith和waterman的局部同源性算法(smith和waterman，《应用数学进展(advancesinappliedmathematics)》，2:482-489,1981，smith等人，《核酸研究(nucleicacidsresearch)》，11:2205-2220,1983)来进行在两个序列之间具有相似性的最佳区段的最佳比对，并插入间隙以最大化匹配数。最优选使用“最佳拟合”程序来确定百分比同一性。用于确定序列同一性的有用方法还公开在局部比对搜索基本工具(blast)程序中，该局部比对搜索基本工具程序可从马里兰州贝塞斯达20894美国国立卫生研究院、美国国立医学图书馆的美国国立生物技术信息中心(ncbi)公开地得到；见《blast手册(blastmanual)》，altschul等人，ncbi，nlm，nih；altschul等人，《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》215:403-410(1990)；blast程序的2.0版或更高版本允许将间隙(删除和插入)引入到比对中；对于肽序列，可以使用blastx来确定序列同一性；并且对于多核苷酸序列，可以使用blastn来确定序列同一性。如本文所使用的，术语“相当大的序列同一性百分比”是指序列同一性百分比为至少约70％序列同一性、至少约80％序列同一性、至少约85％同一性、至少约90％序列同一性、或甚至更大的序列同一性如约98％或约99％序列同一性。因此，本发明的一个实施例是与本文所述的多核苷酸序列具有至少约70％序列同一性、至少约80％序列同一性、至少约85％同一性、至少约90％序列同一性或甚至更大的序列同一性如约98％或约99％序列同一性的多核苷酸分子。具有本发明的acs和cs基因的活性的多核苷酸分子能够引导产生多种辣椒素，与本文所提供的多核苷酸序列具有相当大的序列同一性，并且涵盖在本发明的范围内。“同源性”是指两个或更多个核酸或氨基酸序列之间在位置同一性(即，序列相似性或同一性)百分比方面的相似性水平。同源性还指不同核酸或蛋白质之间的相似功能性质概念。在另一个替代性实施例中，核酸分子包括展现出与选自由seqidno:3和seqidno:4、其任何互补体、其任何片段或其任何顺式元件组成的组的核酸分子具有以下同一性的核酸序列：70％或更大且更优选至少80％或更大、85％或更大、87％或更大、88％或更大、89％或更大、90％或更大、91％或更大、92％或更大、93％或更大、94％或更大、95％或更大、96％或更大、97％或更大、98％或更大、或者99％或更大。核酸分子优选地包括展现出与选自由seqidno:3和seqidno:4、其任何互补体、其任何片段或其任何顺式元件组成的组的多核苷酸具有75％或更大的序列同一性的核酸序列。核酸分子更优选地包括展现出与选自由seqidno:3和seqidno:4、其任何互补体、其任何片段或其任何顺式元件组成的组的多核苷酸具有80％或更大的序列同一性的核酸序列。核酸分子最优选地包括展现出与选自由seqidno:3和seqidno:4、其任何互补体、其任何片段或其任何顺式元件组成的组的多核苷酸具有85％或更大的序列同一性的核酸序列。出于本发明的目的，还可以使用用于转译核苷酸序列的blastx2.0版和用于多核苷酸序列的blastn2.0版来确定“同一性百分比”。在本发明的优选实施例中，目前公开的玉米基因组启动子序列包括具有各自的同源物的、blast得分多于200，优选blast得分多于300且甚至更优选blast得分多于400的核酸分子或片段。根据前述描述显而易见的是，本公开的某些方面不受本文所示的示例的特定细节限制，并且因此预期本领域技术人员将会想到其它修改和应用或其等同物。因此，权利要求书应当旨在覆盖不脱离本公开的精神和范围的所有此类修改和应用。此外，除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解含义相同的含义。虽然本公开的实践或测试中可以使用类似于或等同于本文所述的方法和材料的任何方法和材料，但上文描述了优选的方法和材料。虽然出于理解的目的通过说明和实例相当详细地描述了前述发明，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，可以实践某些变化和修改。因此，说明和实例不应被解释为限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书界定。因此，应理解，本文中提供用于产生特定辣椒素的本发明实施例仅说明了本发明的原理的应用。根据前述描述显而易见的是，可以在不脱离本发明的精神或随附权利要求书的范围的情况下寻求所公开的产生方法和所选的微生物菌株的元素在形式、使用方法和应用上的变化。实例1将500mg/l香兰素胺和500mg/l单独的脂肪酸进给到过表达鬼影辣椒acs1和cs基因的大肠杆菌培养物中。在底物进给后一(1)天和两(2)天取得产生样本，并通过高效液相色谱法(hplc)进行分析(见图2)。如图1和图2所示，这一实验的结果是产生了香草壬酰胺和其它辣椒素。nv是天竺葵酸(正壬酸)和香草壬酰胺的酰胺。香草壬酰胺广泛用作辛辣味的食品添加剂和用于缓解关节炎和肌肉疼痛的药物。本文所产生的cp、dhcp和nv辣椒素是在被修饰成携带来自鬼影辣椒的acs和cs基因的经修饰大肠杆菌培养物。这些基因允许适当进给的选定菌株通过将8-甲基壬酰基部分从8-甲基壬酰基-coa的转移至香草壬酰胺以形成酰胺缀合物的插入的酰基转移酶cs来合成辣椒素。香草壬酰胺由类苯基丙烷途径形成，而支链脂肪酸从支链氨基酸例如缬氨酸衍生(curry等人，1999；mazourek等人，2009)。转氨酶(pamt)催化由香草醛形成香草壬酰胺(图1)。使用共同过表达acs1和cs的bl21(de3)培养物的甘油储液来接种含有100mg/l羧苄青霉素和100mg/l大观霉素的5mltb(极品肉汤(terrificbroth))培养物，并且在37℃下摇动培养物过夜。然后，使用过夜培养物来接种含有100mg/l羧苄青霉素和100mg/l大观霉素的20mltb培养物。先使培养物在37℃下生长至od600为0.4并冷却至25℃。然后加入1mm的iptg以诱导acs1和cs的表达。在25℃下孵育3小时后，向培养物中加入500mg/lvn和500mg/l单独的脂肪酸，并且在25℃下继续孵育培养物。在进给底物后24小时和48小时取得样本。通过乙酸乙酯从培养物中萃取辣椒素，并通过hplc来分析乙酸乙酯相。一式三份地进行实验。在我们之前的申请中，我们描述了用于在进给相应底物之后在过表达鬼影辣椒的acs1和cs基因的大肠杆菌培养物中产生cp和dhcp的过程(表1；chen等人，2015)。根据本发明，我们报告了nv的产生。根据本发明，将转化的培养基进给到特定的脂肪酸，使得由此类培养物产生的产物是单一种类的辣椒素(见表3)。当然，相对于其中产生并萃取各种辣椒素与cp和dhcp的混合物的、基于植物的产生，这是效率的改进。虽然已经将香草壬酰胺鉴定为辣椒属物种中天然存在的辣椒素(constant等人，1996)，但是含量低得使得商业上未曾使用过天然的香草壬酰胺。已经例如由crombie等人(《化学学会志(j.chemsoc.)，1025-27(1955))报道了用于合成辣椒碱及其类似物的无机或非生物方法，描述了明确合成红辣椒中的有效物质(activeprinciple)，辣椒素n-(4-羟基-3-甲氧基苄基)-8-甲基壬-反式-6-烯酰胺。其它有机途径已经示出在lahann等人发布的美国专利号4,493,848和chen等人发布的美国专利号5,094,782中。辣椒素长期以来被用作实验工具，因为其对据信发出疼痛信号的小直径传入神经纤维c-纤维和a-δ纤维具有选择性作用。根据对动物的研究，辣椒素似乎通过打开可渗透钙和钠的阳离子通道来触发c-纤维膜去极化。最近，已经克隆了用于辣椒素效果的受体中的一种。在大多数辣椒中，香兰素胺是由苯基丙氨酸通过阿魏酸、香草醛和相关化合物形成的，并且辣椒素是由香兰素胺和支链脂肪酸通过辣椒碱合酶产生的(图1)。合成生物学基因工程化微生物已经成为越来越重要的平台用于由可再生资源产生药物、化学品和生物燃料(du等人，2011)。当在食品中使用时，可以根据现行法规在食品领域将这些生物技术产品标记为“天然的”(和münch，1997)。示例性辣椒素包含但不限于：香草壬酰胺、n-香草基壬酰胺、n-香草基磺酰胺、n-香草基脲、n-香草基氨基甲酸酯、n[(被取代的苯基)甲基]烷基酰胺、亚甲基取代的n[(被取代的苯基)甲基]烷烃酰胺、n[(被取代的苯基)甲基]-顺式-单饱和烯烃酰胺、n[(被取代的苯基)甲基]二不饱和酰胺、3-羟基乙酰苯胺、羟基苯基乙酰胺、假辣椒碱、二氢辣椒碱、降二氢辣椒碱、高辣椒碱、高二氢辣椒碱i、大麻素、胡椒碱、姜油酮、八氢三甲基萘醇二醛、水蓼二醛、非砂仁二醛、肉桂二醛、肉桂硫酰亚胺、肉桂酸内酯、赛维德、香草壬酰胺、奥伐尼、n-油烯基-高香草酰胺、小皮伞烷型化合物、鳞二醛、祖二醛及其任何组合或混合物。先前开发了大肠杆菌发酵平台，其中可以在进给脂肪酸和香兰素胺/香草醛后产生各种辣椒素(chen等人，2015)。如本文所述，通过这个系统产生香草壬酰胺也是可能的(图2)。产生酰基-coa：克隆申请人使用acsl-sumo-f：cgcgaacagattggaggtgcaacagataaatttattattg和acsl-sumo-r：gtggcggccgctctattatcacttggtacccttgtacat的引物将鬼影辣椒的绿色果实的cdna的acsl基因放大。将所得pcr产物在1％琼脂糖凝胶上纯化并与线性petiten-hissumokan表达载体(lucigen公司，米德尔顿，威斯康星州)混合。使用dna混合物通过热休克(lucigen公司)来转化hl-对照物10g化学感受态细胞。对基因插入进行充分测序，并且比对编码氨基酸序列与acsl的氨基酸序列。如前所示(chen等人，2015)，由于其中已知辣椒属序列中的ile476被鬼影辣椒acsl(本文所提供的seqidno:1)中的缬氨酸残基置换的置换突变，因此这两个序列是新的。使用鬼影辣椒acsl的序列来增强(blast)拟南芥数据库(http://www.arabidopsis.org)并将lcas4和lcas5鉴定为同源物。如前所示，这三个序列共享66％的序列同一性和92％的序列相似性。lcas4和lcas5均已被生物化学表征为参与脂肪酸和甘油脂代谢的长链酰基-coa合成酶(shockey等人，2003)。最近，证明需要lcas4来形成拟南芥中的花粉包被脂质(belza和jessen，2005)。表达申请人使用petiten-hissumo-鬼影辣椒acsl来转化hi-对照物bl21(de3)细胞(lucigen公司)，并且通过0.5mmiptg在16℃下在20小时内诱导his-sumo-acsl的表达通过ni-nta柱来纯化融合蛋白。acsl的分子量为约73.5kd，并且his-sumo标签的大小为约12kd。将sds-page上的his-sumo-鬼影辣椒acsl融合蛋白迁移接近预测大小。产物申请人使用基于hplc的方法来测量鬼影辣椒acsl的活性(chen等人，2011)。简而言之，反应混合物(400με)含有ph为7.5的0.1mtris-hcl、2mmdtt、5mmatp、10mmmgcl2、0.5mmcoa、0.1％triton和200μμ羧酸。通过加入纯化的酶来引发反应，并在30分钟后通过加入20微摩尔乙酸来终止反应。使用120ci8反相柱(赛默飞世尔(thermoscientific)；3μ，120a，150mm×3mm)通过3000lc系统(赛默飞世尔)来进行hplc。流动相由溶剂a(0.1％三氟乙酸)和溶剂b(乙腈)组成。梯度洗脱程序如下：0至5分钟，5％的b；5至9分钟，5％至80％线性梯度的b；9至11分钟，80％的b；11至12分钟，5％的b。流速为0.6ml/分钟。二极管阵列检测器在200nm至400nm的范围内收集数据。为了检测和定量底物和产物，在257nm处测量峰面积。如图8所示，acs1在各种培养基中针对长链羧酸具有活性，针对羊蜡酸(cio)具有最高活性。相比之下，acs1未对乙酸(c2)或丁酸(c4)—短链羧酸示出任何活性。然后，申请人使用8-甲基-反式-6-壬烯酸(6e)辣椒素生物合成途径中的内源性中间体或其还原产物8-甲基壬酸(8m)作为底物用于测定acs1活性。如图2所示，acs1对两种底物均示出了活性，其中6e具有较高活性。申请人收集产物峰的相应hplc馏分，并通过speedvac浓缩器进行干燥以用于进一步的ms/ms鉴定。产物确认甲醇:水:乙腈缓冲液。使用triversa(advion公司，伊萨卡，纽约)将10με用于直接输注。在负离子化模式下操作质谱仪ltq-orbitrapvelos(赛默飞世尔科技，沃尔瑟姆，马萨诸塞州(thermofisherscientific,waltham,ma))。在300m/z至2,000m/zms的质量范围内在ft细胞中进行全扫描(mssurveyscan)。将分辨率设定为60,000@400m/z。将cid分段用于ms/ms，并且以1.5m/z的隔离窗口在离子阱中完成检测。以35％的归一化碰撞能量进行分段。如前所示，ms数据分别与8-甲基-反式-6-壬酰基-coa和8-甲基壬酰基-coa的分子量相匹配。还研究了acs1针对8-甲基壬酸的最佳ph值。使用乙酸盐、磷酸盐、tris和甘氨酸/naoh缓冲液来提供4.0至10.5的ph范围。acs1的光学ph值为约9.5。因此，申请人已经鉴定出鬼影辣椒中为辣椒碱合酶提供底物的新型中/长链酰基-coa合成酶。另外，新型酶还可以应用于生物燃料工业中以用于制备中链脂肪酸衍生物。通过添加来自长春花的caugt2来产生降二氢辣椒碱根据本发明，可以通过使用所选起始材料来产生各种所选辣椒素。本发明还提供了通过使用特定酶来产生特定的辣椒素化合物。这一过程允许申请人产生先前不可能的量的特定且期望的辣椒素，使得可以完全确定药物、食品和香料用途并且可以做出修饰以帮助溶解和给药。根据本发明，已经报道了长春花的培养细胞对辣椒碱和8-降二氢辣椒碱的糖基化(shimoda等人，2007)。然而，先前并未鉴定出负责这一比活性的基因。其他工作者(kaminaga等人(2004))鉴定了编码udp-葡糖基转移酶的两种基因即来自长春花的caugt1和caugt2，并证明这两种基因催化姜黄素中姜黄素单葡糖苷由姜黄素形成以及姜黄素单葡糖苷向姜黄素二葡糖苷转换，但没有提及辣椒素活性。事实上，这些作者还测试了caugt2针对辣椒碱的活性，但发现其无法使辣椒碱糖基化(kaminage等人，2004)。然而，根据本发明，我们证明了caugt2可以催化辣椒碱葡糖苷在体外和体内形成。根据本发明，合成长春花caugt2基因(基因库：ab159213.1)，密码子优化以用于大肠杆菌，并克隆到pdest17载体中(见表5)。使用所得pdest17-caugt2质粒来转化bl21star(de3)感受态细胞。先使转化的培养物在37℃下在lb(amp+)培养基中生长直至od600＝0.4并且然后冷却至16℃，并加入1mmiptg以诱导caugt2蛋白的表达。通过离心在诱导后16小时收获细胞，并且根据制造商的说明通过b-pertm细菌蛋白质萃取试剂(赛默飞世尔科技)来萃取可溶性蛋白质并通过ni-nta亲和色谱法进一步纯化(图6)。确定使用这一经修饰的酶可以产生感兴趣的辣椒素(图7至图10)。另外，以约5mg/l的滴度使用过表达caugt2的bl21star(de3)培养物来分别进行辣椒素和香草壬酰胺的体内生物转化以产生辣椒碱-葡糖苷和香草壬酰胺-葡糖苷。进一步地，从脂肪酸、7-甲基辛酸(7m)或异天竺葵酸衍生出7m-cp的脂肪酸链。当将7m进给到这个培养系统种时，产生7m-cp(图9和图10)。如图9所示，7m-cp的保留时间(10.077分钟)与c9-cp的保留时间(10.190分钟)略有不同，并且其uv光谱几乎完全相同(见图9中的插入图片)。还对培养物中7m-cp和c9-cp的水平进行定量(图10)。7m-cp的滴度略低于c9-cp的滴度。产生辣椒素如图2所示，我们的培养系统的cp9滴度与cp的滴度相似，但是cp8和cp10的滴度略低。通过hplc，cp8(n-香草辛酰胺)、cp9(香草壬酰胺)或cp10(n-香草癸酰胺)的保留时间分别为10.9分钟、11.3分钟和11.8分钟。然而，其uv光谱彼此非常相似(图3)。cp9的保留时间和uv光谱与香草壬酰胺标准物的保留时间和uv光谱非常匹配(图4)。使用120c18反相柱(赛默飞世尔；3μ，150mm×3mm)通过3000lc系统(赛默飞世尔)来进行hplc。流动相由溶剂a(0.1％三氟乙酸)和溶剂b(乙腈)组成。梯度洗脱程序如下：0至5分钟，5％的b；5至9分钟，5％至80％线性梯度的b；9至11分钟，80％的b；11至12分钟，5％的b。流速为0.6ml/分钟。二极管阵列检测器在200nm至400nm的范围内收集数据。为了检测和定量底物和产物，在280nm处测量峰面积(图3和图4)。工业实用性/
技术领域：
：声明本公开适用于食品、医药和药理行业。本公开总体上涉及一种通过经修饰的微生物菌株以生物合成方式产生辣椒素的方法。说明书中引用的表格表1.从鬼影辣椒克隆的acs1和cs的氨基酸序列。在上述蛋白质序列中，acs应被视为seqidno:1，并且cs应被视为seqidno:2。表1.续.从鬼影辣椒克隆的acsl和cs的核酸序列。在上述核酸序列中，acs应被视为seqidno:3，并且cs应被视为seqidno:4。表2.表3.用于产生特定辣椒素的进给计划表表4.辣椒素样本的13c同位素分析*取自实验中使用的中国蕨(chinesefern)表5.密码子优化的caugt2的序列在caugt2的上述核酸和氨基酸序列中，dna应视为seqidno:5，并且蛋白质序列应视为seqidno:6。通过引用援引和并入的参考文献：1.aza-gonzalezc.等人，(2011)，辣椒(辣椒属)中的辣椒素生物合成分子生物学(molecularbiologyofcapsaicinoidbiosynthesisinchilipepper(capsicumspp.))，《植物细胞报告(plantcellrep.)》30:695-706。2.belzaa,jessenab，(2005)，交感神经活动的生物活性食品兴奋剂：对24小时能量消耗和脂肪氧化的影响(bioactivefoodstimulantsofsympatheticactivity:effecton24-henergyexpenditureandfatoxidation)，《欧洲临床营养学杂志(eurjclinnutr.)，59:733-41。3.bosland和baral，(2007)，‘印度鬼椒’——世界上最著名的辣椒是推定的天然存在的种间杂种体(‘bhutjolokia’—theworld'shottestknownchilepepperisaputativenaturallyoccurringinterspeciifichybrid)，《园艺科学(hortscience)》，42:222-24。4.batchelor和jones，(2000)，辣椒酱和辣椒的斯高威尔热值的确定：hplc实验(determinationofthescovilleheatvalueforhotsaucesandchilies:anhplcexperiment)，《化学教育杂志(j.chem.educ.)》，77(2),p266。5.catchpole等人，(2003)，用近临界co2、丙烷和二甲基醚来萃取辣椒、黑胡椒和生姜：通过定量核磁共振来分析萃取物(extractionofchili,blackpepper,andgingerwithnearcriticalco2,propane,anddimethylether:analysisoftheextractsbyquantitativenuclearmagneticresonance)，《农业与食品化学杂志(j.agriculturalandfoodchemistry)》，51:4853-60。6.caterinamj等人，(1997)，辣椒碱受体：疼痛途径中的热活化离子通道(thecapsaicinreceptor:aheat-activatedionchannelinthepainpathway)，《自然(nature)》，389,816-24。7.constanthl等人，(1996)，香草壬酰胺：辣椒油树脂成分(nonivamide,aconstituentofcapsicumoleoresin)，《天然产物杂志(journalofnaturalproducts)》，59:425-26。8.crombie等人，(1955)，《植物源酰胺》第vi部分：辣椒碱的合成(amidesofvegetableorigin.partvi.synthesisofcapsaicin)，《化学学会会刊(j.chemsoc.)》，1025-27。9.curry等人，(1999)，可能的辣椒素类生物合成基因的转录物不同地累积在刺激性和非刺激性辣椒中(transcriptsforpossiblecapsaicinoidbiosyntheticgenesaredifferentaccumulatedinpungentandnon-pungentcapsicumspp.)，《植物科学(plantsci.)》，148:47-57。10.duj等人，(2011)，用于合成增值产品的工程微生物工厂(engineeringmicrobialfactoriesforsynthesisofvalue-addedproducts)，《工业微生物学与生物技术杂志(jindmicrobiolbiotechnol.)》，38:873-90。11.garces-clavera.等人，(2007)，鉴定、验证和调查与辣椒属的刺激性相关联的单核苷酸多态性(snp)(identification,validationandsurveyofasinglenucleotidepolymorphism(snp)associatedwithpungencyincapsicumspp.)，《理论和应用遗传学(theorapplgenet)》，115:907-16。12.govindarajan和sathyanarayana(1991)，《辣椒—生产、技术、化学和质量》第v部分：对生理学、药理学、营养学和新陈代谢的影响—结构、刺激性、疼痛和脱敏序列(capsicum–production,technology,chemistry,andquality.partv.impactonphysiology,pharmacology,nutrition,andmetabolism；structure,pungency,pain,anddesensitizationsequences)，《食品科学与营养评论(criticalreviewsinfoodscienceandnutrition)》，29(6):435-74。13.a和müncht.，(1997)，微生物产生天然香料(microbialproductionofnaturalflavors)《美国微生物学会新闻(asmnews)》，63:551-59。14.higashiguchif.等人，(2006)，各种辣椒果实的辣椒碱和二氢辣椒碱的葡糖苷的纯化及结构确定(purificationandstructuredeterminationofglucosidesofcapsaicinanddihydrocapsaicinfromvariouscapsicumfruits)，《农业与食品化学杂志》，54:5948-5953。15.jordtse.和juliusd.，(2002)，对“辛辣”辣椒的物种特异性敏感性的分子基础(molecularbasisforspecies-specificsensitivityto“hot”chilipeppers)，《细胞(cell)》，108:421-30。16.kaminagay.等人，(2004)，分子克隆和表征催化姜黄素在培养的长春花细胞中的葡糖基化的葡糖基转移酶(molecularcloningandcharacterizationofaglucosyltransferasecatalyzingglucosylationofcurcumininculturedcatharanthusroseuscells)，《欧洲生化学会联合会快报(febslett.)》，567:197-202。17.kometanit.等人,(1993)通过小果咖啡的细胞悬浮培养物来葡糖基化辣椒碱(glucosylationofcapsaicinbycellsuspensionculturesofcoffeaarabica)，《生物科学、生物技术与生物化学(biosci.biotechnol.biochem.)》，57,2192-2193。18.mazourek等人，(2009)，辣椒素系统生物学动态界面(adynamicinterfaceforcapsaicinoidsystemsbiology)，《植物生理学(plantphys.)》，150:1806-21。19.prasadbc.,(2006)，针对辣椒(辣椒属)中的刺激性因素辣椒碱来表征辣椒碱合酶并鉴定辣椒其基因(csyl)characterizationofcapsaicinsynthaseandidentificationofitsgene(csyl)forpungencyfactorcapsaicininpepper(capsicumsp.)，《美国国家科学院院刊(procnatlacadsciusa.)》，103:13315-20。20.prasadbc.等人，(2008)，针对辣椒(辣椒属)中的刺激性因素辣椒碱来表征辣椒碱合酶并鉴定辣椒其基因(csyl)characterizationofcapsaicinsynthaseandidentificationofitsgene(csyl)forpungencyfactorcapsaicininpepper(capsicumsp.)，《美国国家科学院院刊》，105:20558。21.reillyca.等人，(2001)，通过液相色谱-质谱法和液相色谱-串联质谱法来确定自卫武器中的辣椒碱、二氢辣椒碱和香草壬酰胺(determinationofcapsaicin,dihydrocapsaicin,andnonivamideinself-defenseweaponsbyliquidchromatography-massspectrometryandliquidchromatography-tandemmassspectrometry)，《色谱法杂志a(j.chromatogra.)》，912:259-67。22.stewartc.等人，(2005)，用于辣椒的刺激性的punl基因编码推定的酰基转移酶(thepunlgeneforpungencyinpepperencodesaputativeacyltransferase)，《植物杂志(plantj.)》，42:675-88。23.stewartc.等人，(2007)，通过punl基因座来对黄灯笼辣椒的刺激性进行遗传控制(geneticcontrolofpungencyinc.chinenseviathepunllocus)，《实验植物学杂志(jexpbot.)》，58:979-91。24.shimodak.等人(2007)，通过长春花的培养细胞对辣椒碱和8-降二氢辣椒碱进行糖基化(glycosylationofcapsaicinand8-nordihydrocapsaicinbyculturedcellsofcatharanthusroseus)，《植物化学(phytochemistry)》，68:1391-96。25.shockeyjm.等人，(2003)，拟南芥含有大的酰基活化酶超家族：系统发育和生化分析揭示了新一类酰基-辅酶a合成酶(arabidopsiscontainsalargesuperfamilyofacyl-activatingenzymes:phylogeneticandbiochemicalanalysisrevealsanewclassofacyl-coenzymeasynthetases)，《植物生理学(plantphysiol)》，132:1065-76。26.suzukit.等人，(1980)，辣椒碱及其类似物辣椒素在辣椒果实中的细胞内定位：对capsicumannuumvarannuumcv.karayatsubusa的胎盘结构的显微调查(intracellularlocalizationofcapsaicinanditsanalogscapsaicinoid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